ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT PCR TẠO THANG DNA DỰA TRÊN MỘT KHUÔN PLASMID DUY NHẤT HUỲNH THỊ KIM PHƯƠNG*, TRƯƠNG THỊ TINH TƯƠM**, VÕ MINH TOÀN**, PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG***, NGUYỄN ĐỨC HOÀNG**** TÓ[.]
Huỳnh Thị Kim Phương tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ỨNG DỤNG TIN SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT PCR TẠO THANG DNA DỰA TRÊN MỘT KHUÔN PLASMID DUY NHẤT HUỲNH THỊ KIM PHƯƠNG*, TRƯƠNG THỊ TINH TƯƠM**, VÕ MINH TOÀN**, PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG***, NGUYỄN ĐỨC HỒNG**** TĨM TẮT Trong lĩnh vực sinh học phân tử, thang DNA dấu chuẩn thiếu Nghiên cứu phát triển phương pháp tạo thang DNA nhanh hiệu thông qua công cụ tin sinh học để thiết kế cặp mồi bắt cặp đặc hiệu khuôn plasmid pHT254, cho sản phẩm PCR với kích thước khác từ 100 bp đến 2000 bp Các sản phẩm PCR sau tinh chế, xác định nồng độ DNA tiến hành phối trộn Sản phẩm thu thang DNA thang khác với vạch phù hợp mục đích sử dụng Từ khóa: Thang DNA, pHT254, PCR, HT100, HT200 ABSTRACT Synthesis of DNA ladder by bioinformatic and PCR technique based on unique plasmid DNA ladder is an indispensable marker in molecular biology This study developed a new method to create quickly and efficiently DNA ladder via the bioinformatics tools to design specific primers paired on unique plasmid pHT254, the result of the PCR technique is DNA fragments with different sizes from 100 bp to 2000 bp The PCR products then were purified and carried out mixing Resulting product is different DNA ladders that contain the wishes lines, due to the mixing of each individual PCR products Keywords: DNA marker, pHT254, PCR, HT100, HT200 Giới thiệu Hiện nay, hai phương pháp thông dụng truyền thống tạo thang DNA sử dụng nối khơng hồn tồn đoạn DNA có kích thước xác định cắt giới hạn plasmid Escherichia coli [6], gene bacteriophage hay gene Tenebrio molitor [4] Đối với phương pháp nối khơng hồn tồn, phân tử DNA mạch thẳng nối với qua liên kết cộng hóa trị phosphodieste enzyme ligase, hỗn hợp phân tử DNA có kích thước khác tạo sau phản ứng nối khơng hồn tồn Đối với phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn, phân tử DNA plasmid từ Escherichia coli gene phage lamda cắt giới hạn enzyme cắt giới hạn cụ thể có trình tự nhận biết nó, tạo phân tử DNA có kích thước xác định [3, 6] Ưu điểm hai phương pháp truyền thống đơn giản, dễ * Cử nhân, Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học; Email: htkphuong@hcmus.edu.vn ThS, Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học *** PGS TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM **** PGS TS, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM ** tiến hành tốn chi phí Tuy nhiên, vạch DNA tạo phụ thuộc vào số lần lặp lại vị trí nhận biết enzyme cắt hay nối ngẫu nhiên enzyme nối nên gây khó khăn việc kiểm sốt nồng độ kích thước vạch theo mong muốn [1] Bên cạnh đó, phương pháp tạo thang chuẩn DNA kĩ thuật Multiplex-PCR PCR dựa khuôn plasmid hay DNA phage lamda quan tâm, áp dụng rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm công ti thương mại Sigma, Pharmacia, Life Technologies, Boerhinger-Mannheim…[1, 5] Ưu điểm phương pháp nồng độ kích thước phân tử vạch thang điều chỉnh theo mong muốn nhờ kiểm soát số chu kì phản ứng Thơng thường đoạn DNA có kích thước phù hợp dịng hóa vào plasmid khn để tiến hành PCR, q trình địi hỏi số lượng plasmid khn phải tương đương với số vạch DNA mong muốn nhằm xây dựng thang DNA Hướng tiếp cận nghiên cứu nhằm sử dụng cơng cụ tin sinh học q trình thiết kế mồi kết hợp với kĩ thuật PCR để tạo phân tử DNA có kích thước khác dựa khn plasmid nhóm nghiên cứu phát triển Kết giúp làm tiền đề để ứng dụng trình tự tạo nhanh thang DNA phịng thí nghiệm, giảm kinh phí sử dụng sản phẩm thang thương mại Ngoài sản phẩm PCR riêng lẻ nên dễ dàng việc tạo thang có kích thước trịn trăm với nồng độ kích thước mong muốn, tiện lợi cho mục đích người sử dụng Vật liệu – phương pháp • Plasmid Plasmid pHT254 dùng làm khn cho tồn phản ứng PCR, pHT254 DNA dạng mạch vịng, gồm 7937 bp (Hình 1), plasmid cung cấp Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM Hình Bản đồ vector pHT254 vị trí bắt cặp mồi thiết kế • Mồi quy trình PCR Các cặp mồi đặc hiệu nhằm thu nhận đoạn DNA có kích thước khác thiết kế phần mềm Clone Manager dựa plasmid khn pHT254, trình tự chiều dài mồi mô tả Bảng Nguyên tắc thiết kế mồi thực nhờ thuật toán phần mềm cho cặp mồi đặc hiệu với phản ứng thu nhận sản phẩm DNA có kích thước trịn trăm từ 100 – 2000 bp Các cặp mồi thiết kế (Bảng 2) sử dụng cho phản ứng PCR để đánh giá sơ độ đặc hiệu kích thước sản phẩm khn pHT254 Thành phần phản ứng PCR: Taq buffer 1X (Công ti HT-Biotech), dNTP 200 mM (Fermentas), mồi 0,3 pmol/µl (Macrogen), Taq DNA polimerase µl/100 µl phản ứng (HT-Biotech), plasmid khuôn pHT254 (Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học) 100 ng/100 µl phản ứng Bảng Trình tự 22 mồi thiết kế dùng phản ứng PCR Mồi Trình tự nucleotide (5’3’) Độ dài (nu) Nhiệt độ nóng chảy (°C) ON1609 AACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGT 24 62 ON1610 GTCATGCCATCCGTAAGATGC 21 61 ON1611 TTCCGAAGGTAACTGGCTTCA 21 59 ON1613 GGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT 24 63 ON1614 CTACAGGCATCGTGGTGTCAC 21 63 ON1615 TACGGATGGCATGACAGTAAGAG 23 63 ON1616 GTTGCTGGCGTTTTTCCATAG 21 59 ON1617 GGGATCATGTAACTCGCCTTG 21 61 ON1618 GGCGGTGCTACAGAGTTCTTG 21 63 ON1619 CGTTTCCACCGGAATTAGCTT 21 59 ON1620 GGTAGATCCCCTAATTTTCGTACCAT 26 63 ON1621 GTTTTTGCTCACCCAGAAACG 21 59 ON1622 TTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGT 24 63 ON1623 GGGTGGTTTTTCTTTTCACCAG 22 60 ON1624 TTCTTCCGTGATTCCTTGAACA 22 58,5 ON1625 AGGCGATTAAGTTGGGTAACG 21 59 ON1626 AAAAGGCCAGGAACCGTAAAA 21 58,5 ON1627 ATAGTTAATGATCAGCCCACTGACG 25 63,5 ON1628 CTTCTCTTCCGTTTCAGCAACA 22 60 ON1629 TGGAGATGACTTGCTTAATTCCAC 24 62 ON1630 GCGAAACCCGACAGGACTATAA 22 60,5 ON1631 CCACGATGCCTGTAGCAATG 20 60 Điều kiện phản ứng PCR tối ưu nhằm thu nhận đoạn DNA cặp mồi: nhiệt độ bắt cặp mồi, nồng độ Mg 2+, nồng độ mồi khảo sát Trong đó, nhiệt độ bắt cặp mồi khảo sát 54oC, 55oC, 56oC, 57oC 58oC Việc lựa chọn nhiệt độ khảo sát dựa vào mốc nhiệt độ Tm-5 mồi có nhiệt độ nóng chảy thấp 58,5 oC mồi có nhiệt độ nóng chảy cao 63 oC Nồng độ Mg2+ khảo sát mM, 1,5 mM, mM, 2,5 mM Nồng độ mồi dùng cho phản ứng PCR khảo sát 0,2 pmol/µl, 0,3 pmol/µl, 0,4 pmol/µl, 0,5 pmol/µl Qua khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi, chọn hai nhiệt độ bắt cặp mồi dùng chung cho tất phản ứng PCR thu DNA Sau tiến hành phản ứng PCR thu nhận đoạn DNA cặp mồi cụ thể với điều kiện tối ưu, sản phẩm PCR điện di phân tách gel agarsose 2% (Invitrogen) bổ sung Safe view (Invitrogen) dung dịch TAE 1X (40 mM Tris-acetate and mM EDTA, pH 8.0) tinh qua PCR purification kit (Qiagen) Các sản phẩm PCR sau phối trộn với tạo thành thang DNA Bảng Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR cho sản phẩm với kích thước tròn trăm Cặp mồi Forward Reverse ON1611 ON1618 ON1609 ON1610 ON1611 ON1622 ON1609 ON1614 ON1611 ON1616 ON1613 ON1618 ON1631 ON1618 ON1613 ON1622 ON1615 ON1618 ON1613 ON1616 Sản phẩm PCR (bp) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Cặp mồi Forward Reverse ON1631 ON1616 ON1617 ON1626 ON1615 ON1616 ON1619 ON1628 ON1621 ON1630 ON1621 ON1626 ON1623 ON1624 ON1623 ON1620 ON1625 ON1624 ON1627 ON1628 Sản phẩm PCR (bp) 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 Kết - thảo luận Dựa plasmid khuôn pHT254, 22 mồi thiết kế tạo thành 20 cặp mồi đặt hiệu cho phản ứng PCR để thu nhận sản phẩm có kích thước từ 100 – 2000 bp Kết PCR đánh giá sơ độ đặc hiệu kích thước sản phẩm DNA mồi điện di phân tích gel agarose có kích thước từ 100 – 2000 bp (Hình 2) Kết cho thấy q trình thiết kế mồi dựa khn pHT254 thành công, tất phản ứng cho vạch sáng phù hợp với kích thước lí thuyết Tuy nhiên, kết điện di gel cho thấy sản phẩm khuếch đại đoạn có kích thước 100bp, 200 bp 300 bp cho vạch mờ so với vạch cịn lại (Hình 2A) (A) (B) Hình Kết điện di sản phẩm PCR từ 100 – 2000 bp gel agarose 2%; (A): Sản phẩm PCR từ 100 – 1000 bp; (B): Sản phẩm PCR từ 1100 – 2000 bp; (M): thang DNA ZipRuler Express (Thermo Scientific) Phản ứng PCR tiếp tục khảo sát điều kiện tối ưu để thu nhận sản phẩm PCR tốt Kết khảo sát chọn lựa điều kiện phù hợp cho phản ứng PCR với thành phần phản ứng PCR sau: Bảng Thành phần tối ưu cho phản ứng PCR dNTP Taq buffer Mg2+ Mồi Taq enzyme Plasmid pHT254 Chu kì nhiệt biểu diễn Hình 3: 200 µM 1X 1,5 mM 0,4 pmol/µl µl/100 µl phản ứng 100 ng/100 µl 95oC phút 95oC 30 giây 72oC 55oC 1kb/ phút 72oC 10 phút 30 giây 4o C ∞ Hình Sơ đồ chương trình chạy PCR Kết điện di sản phẩm PCR với tổ hợp điều kiện khảo sát cho thấy vạch sáng rõ (Hình 4) Đặc biệt sản phẩm có kích thước 100 bp, 200 bp 300 bp cải thiện tương đương với vạch có kích thước khác Như vậy, thu nhận thành công sản phẩm DNA mục tiêu, sản phẩm sau tinh PCR purification kit tiến hành phối trộn thành thang DNA Hình Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR với điều kiện tối ưu (M): thang DNA ZipRuler Express (Thermo Scientific) Các sản phẩm DNA có kích thước từ 100 – 2000 bp sau tinh quy nồng độ khác tiến hành khảo sát nồng độ tối ưu cho kích thước DNA q trình phối trộn (kết khơng trình bày) Kết điện di sản phẩm phối trộn tổ hợp DNA có kích thước khác với nồng độ tối ưu cho thấy vạch DNA mục tiêu phù hợp với kích thước lí thuyết, vạch thị sáng với nồng độ DNA cao vạch có kích thước 400 800 bp, nhiên số vạch có kích thước gần khơng phân tách rõ rệt gel agarose (Hình 4) Để phân tách đoạn gen với kích thước gần cần phải điện di bảng gel lớn, thời gian điện di lâu hơn, lượng thang DNA nạp vào giếng cao Do cần phối trộn đoạn có kích thước khác phù hợp để thang có độ phân tách tốt mà khơng cần điện di lâu bảng gel lớn Hình Kết điện di gel agarose vạch DNA có kích thướt từ 100 – 200 bp So với số thang DNA thương mại, chênh lệch vạch kích thước thơng thường từ 200 – 300 bp, chúng tơi tiến hành phối trộn có chọn lọc số kích thước mục tiêu xây dựng nên thang HT100 HT200 (Hình 4), vạch sáng thị sản phẩm DNA có kích thước 400 bp 1200 bp với thang HT100, vạch 800 bp với thang HT200 So với thang phối trộn đủ sản phẩm DNA có kích thước từ 100 – 2000 bp, thang HT100 HT200 có vạch phân tách rõ rệt phù hợp để ứng dụng làm thang thí nghiệm phân tích kích thước DNA Nồng độ cụ thể vạch DNA phối trộn trình bày Bảng Bảng A B Hình Kết điện di sản phẩm phối trộn (A): Thang HT100; (B): Thang HT200 Trong sinh học phân tử, kĩ thuật điện di gel agarose sử dụng phổ biến, nhiên hầu hết thang DNA sử dụng nước sản phẩm thương mại từ cơng ti nước ngồi với giá thành cao, để thuận tiện cho q trình nghiên cứu giảm kinh phí, việc chủ động tự tạo thang DNA phịng thí nghiệm trung tâm nghiên cứu quan tâm đến Bảng Nồng độ phối trộn vạch DNA thang HT100 Bảng Nồng độ phối trộn vạch DNA thang HT200 Kích thước vạch DNA (bp) Nồng độ (ng/µl) Kích thước vạch DNA (bp) Nồng độ (ng/µl) 2000 100 2000 100 1500 100 1500 100 1200 200 1000 100 1000 100 800 200 800 100 600 100 600 100 400 200 500 100 200 150 400 250 300 100 200 150 100 200 Dựa vào nghiên cứu liên quan cơng bố, q trình xây dựng thang dựa việc dịng hóa đoạn DNA có kích thước xác định vào vector khuôn, việc tiến hành dịng hóa tạo hàng loạt plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA có kích thước khác tốn nhiều thời gian công sức [1, 2, 5] Việc sử dụng kết hợp tin sinh học để thiết mồi khuôn pHT254 PCR thu đoạn DNA có kích thước khác khắc phục khuyết điểm tồn chiến lược sử dụng kĩ thuật PCR tạo thang DNA Kết nghiên cứu chứng minh khả ứng dụng cao phương pháp qua trình khảo sát cho thấy điều kiện phản ứng PCR tương đối giống cặp mồi, tạo thuận lợi cho trình chuẩn bị tiến hành tất phản ứng PCR thu đoạn DNA, đem lại thuận tiện hiệu cho người sử dụng Bên cạnh đó, việc chủ động q trình phối trộn có chọn lọc vạch DNA với kích thước mong muốn giúp xây dựng thang DNA phù hợp với mục đích nghiên cứu, thang DNA bao gồm vài vạch DNA có kích thước phù hợp với mục tiêu ứng dụng (Hình 7, Hình 8) Ở phương pháp cắt giới hạn DNA plasmid hay DNA gene phage có kích thước sản phẩm cắt khơng thể kiểm soát thang DNA lamda cắt HindIII EcoRI cho kích thước số vạch 564, 831, 947 1375 bp Trong đó, phương pháp PCR thu DNA làm thang cho vạch kiểm soát 100, 200, 300, 400, 500 bp… giúp thuận tiện q trình phân tích kết điện di, đặc biệt với vạch có chênh lệch kích thước khơng lớn Hình Thang DNA với bốn vạch mục tiêu gồm 400, 700, 1000 1500 bp Hình Thang DNA HT100B với vạch 100, 300, 500, 700, 900, 1200, 1700 bp Kết luận Đã thiết kế 20 cặp mồi đặc hiệu plasmid pHT254 Chỉ với khuôn plasmid pHT254 giúp thu nhận vạch thang từ 100 – 2000 bp điều kiện tối ưu Quá trình phối trộn thang theo nhiều kích thước nồng độ khác phù hợp với mục đích người sử dụng Ghi chú: Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh khn khổ nhiệm vụ thường xun theo chức năng, mã số TX2015-18-07 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbasian, M., Seyedi, H.A.E., Boroujeni, Z.K and Mofid, M.R (2015), “Easy method for production of a home-made DNA ladder in every laboratory”, Advanced Biomedical Research, Chang, M., Wang, J.-H and Lee, H.-J (2008), “Laboratory production of 100 base pair DNA molecular weight markers”, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70(6), pp.1199-1202 Cooney, C.A., Galbraith, J.L and Bradbury, E.M (1989), “A regularly spaced DNA size standard with 10 kbp resolution for pulsed field gel electrophoresis”, Nucleic Acids Research, 17(13), pp.5412-5412 Gitelman, I and Davis, C.A (1997), “A novel DNA molecular weight ladder”, Technical Tips Online, 2(1), pp.82-83 Lan, V.T.T., Loan, P.T.T., Duong, P.A.T., Thanh, L.T., Ha, N.T., Thuan, T.B., Lan, V.T.T., Loan, P.T.T., Duong, P.A.T., Thanh, L.T., Ha, N.T and Thuan, T.B (2012), “Straightforward Procedure for Laboratory Production of DNA Ladder, Straightforward Procedure for Laboratory Production of DNA Ladder”, Journal of Nucleic Acids, Journal of Nucleic Acids, 2012, 2012, e254630 Polyarush, S.V., Egamberdiev, S.S., Mansurov, D.R and Azimova, S.S (2003), “Preparation of DNA Markers Based on E coli Plasmid DNA”, Chemistry of Natural Compounds, 39(6), pp.592-594 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 06-01-2016; ngày phản biện đánh giá: 03-02-2016; ngày chấp nhận đăng: 17-3-2016) ... dụng kết hợp tin sinh học để thiết mồi khuôn pHT254 PCR thu đoạn DNA có kích thước khác khắc phục khuyết điểm tồn chiến lược sử dụng kĩ thuật PCR tạo thang DNA Kết nghiên cứu chứng minh khả ứng. .. vạch DNA mong muốn nhằm xây dựng thang DNA Hướng tiếp cận nghiên cứu nhằm sử dụng công cụ tin sinh học trình thiết kế mồi kết hợp với kĩ thuật PCR để tạo phân tử DNA có kích thước khác dựa khn plasmid. .. vạch theo mong muốn [1] Bên cạnh đó, phương pháp tạo thang chuẩn DNA kĩ thuật Multiplex -PCR PCR dựa khuôn plasmid hay DNA phage lamda quan tâm, áp dụng rộng rãi nhiều phịng thí nghiệm cơng ti thương