BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN EBNA 1 Ở CÁC MẪU MÔ THU NHẬN TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ngày nhận bài 16/06/2015 Lao Đức Thuận1 Ngày nhận lại 11/07/2015 Nguyễn Hoàng Anh Tuấn2 Ngày duyệt đăng[.]
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 10 (1) 2015 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN EBNA-1 ỞCÁC MẪU MƠ THU NHẬN TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ngày nhận bài: 16/06/2015 Ngày nhận lại: 11/07/2015 Ngày duyệt đăng: 26/10/2015 Lao Đức Thuận1 Nguyễn Hoàng Anh Tuấn2 Nguyễn Thị Yến Tuyết3 Nguyễn Hữu Dũng4 Lê Huyền Ái Thúy5 TÓM TẮT Tại Việt Nam, ung thư vòm họng dạng ung thư phổ biến bệnh ung thư thuộc vùng đầu cổ Nhiều nghiên cứu chứng xâm nhiễm Epstein – Barr virus (EBV) có mối quan hệ mật thiết nguyên nhân gây bệnh ung thư vòm họng Nhằm hướng tới việc xây dựng quy trình chẩn đốn sớm bệnh ung thư vịm họng, chúng tơi lựa chọn gen EBNA-1 (Epstein – Barr nuclear antigen 1), gen cần thiết cho xâm nhiễm EBV, làm gen mục tiêu cho việc xây dựng quy trình phát diện EBV Trong nghiên cứu bước đầu, tiến hành thống kê tần số trung bình trọng số diện EBV nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác Đồng thời, xây dựng thành cơng quy trình PCR phát gen EBNA-1 mẫu mơ bệnh ung thư vịm họng thu nhận từ Bệnh Viện Chợ Rẫy Kết nghiên cứu bước đầu tiền đề cho việc phát triển phương pháp chẩn đốn khơng xâm lấn nhằm chẩn đốn sớm bệnh ung thư vòm họng dựa kỹ thuật sinh học phân tử đối tượng gen liên quan đến xâm nhiễm EBV Từ khóa: EBV, EBNA-1, ung thư vòm họng ABSTRACT In Viet Nam, Nasopharyngeal carcinoma (NPC), originating in the nasopharynx, is the most common cancer of the head and neck cancers The association of NPC with Epstein – Barr virus (EBV) firmly demonstrated that EBV played an important role in nasopharynx carcinogenesis For the aim to establish the method for early diagnosis and prognosis of NPC, EBNA-1 (Epstein – Barr nuclear antigen 1) which is necessary for infection of EBV, was chosen as target gene to establish the method for detection of EBV In this study, we systematically analyzed the mean of percentage weighted of the presence of EBNA-1 in various sources of sample Moreover, we initially succeed to establish the PCR method for detection of EBNA-1 in biopsy tissues collected from nasopharyngeal cancer patients in Cho Ray hospital These results indicated that, in the future, it will be useful in developing a non-invasive method for early diagnosis and prognosis of NPC based on molecular techniques in detection of concerning genes which were EBV infection required Keyword: EBNA-1, EBV, Nasopharyngeal carcinoma ThS, Trường Đại học Mở TP.HCM Trường Đại học Mở TP.HCM Trường Đại học Mở TP.HCM TS BS, Bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM – SỐ 10 (1) 2015 PGS.TS, Trường Đại học Mở TP.HCM Email: thuy.lha@ou.edu.vn Giới thiệu Ung thư vòm họng (Nasopharyngeal carinoma) khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mơ vòm họng Đồng thời, loại ung thư phổ biến bệnh lý vùng đầu (Phúc cộng sự, 2008; Yang cộng sự, 2014) Tỷ lệ mắc bệnh ung thư vịm họng có khác biệt địa lý khu vực khác Trong đó, Việt Nam nằm khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao, cụ thể theo thống kê năm 2012 (WHO), thấy tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng tử vong lên đến 3,9% 3,3% dân số (World Health Organization, 2012) EBV (Epstein – Barr virus) virus có tính nhiễm phổ rộng cộng đồng phát 90% người trưởng thành, thuộc nhóm Herpes virus type nghiên cứu sớm từ năm 1980 (Phúc cộng sự, 2008; Niedobitek, 2000) Sự xâm nhiễm EBV ba nguyên nhân bao gồm: (1) xâm nhiễm EBV; (2) mơi trường sống thói quen sinh hoạt; (3) biến đổi di truyền dẫn đến hình thành ung thư vịm họng (Frappier, 2012; Tao cộng sự, 2007) Trên giới, nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh diện phân tử DNA, RNA, protein virus biểu tế bào ung thư vịm họng tế bào bị nhiễm EBV có nguy tiến triển thành ung thư vòm họng Chẳng hạn, nghiên cứu Chang cộng (1990) thực 50 mẫu mơ vịm họng khơng biệt hóa, kết cho thấy EBVDNA diện mẫu mô với lượng cao (Thompson cộng sự, 2004) EBNA-1 (Epstein – Barr nuclear antigen 1) gen thuộc họ EBNAs nằm gen EBV, có vai trị quan trọng q trình xâm nhiễm, nhân lên trì gen EBV mơ ung thư vịm họng Đồng thời, EBNA-1 cịn đóng vai trị quan trọng việc trì trạng thái tiềm tàn EBV (Chang cộng sự, 1990; Frappier, 2012; Tao cộng sự, 2007) Cụ thể hơn, EBNA-1 mã hóa cho protein EBNA-1, EBNA-1 tương tác với vị trí OriP, điểm vị trí khởi đầu chép, khởi phát nhân lên EBV-DNA (Frappier, 2012; Thompson cộng sự, 2004) Hơn nữa, EBNA-1 cịn có vai trị việc kích hoạt biểu gen khác giai đoạn tiềm tàn LMP-1,LMP-2, BARTs,… (Brooks cộng sự, 1992; Frappier, 2012; Thompson cộng sự, 2004) Do đó, gen EBNA-1 sản phẩm tìm thấy hầu hết khối u vịm họng liên quan đến EBV (Brooks cộng sự, 1992; Phúc cộng sự, 2008; Zhang cộng sự, 2012) Chính đặc điểm mở khuynh hướng sử dụng EBV-DNA hay gen liên quan nhằm phát triển kỹ thuật chẩn đốn sớm khơng xâm lấn bệnh ung thư vịm họng, từ nâng cao hiệu điều trị khả sống sót bệnh nhân Trong nghiên cứu này, chúng tơi hệ thống hóa lại liệu khoa học nghiên cứu liên quan đối tượng ung thư vòm họng gen EBNA-1 loại bệnh phẩm khác Đồng thời, bước đầu xây dựng quy trình PCR phát diện gen EBNA-1 mô sinh thiết từ bệnh nhân vòm họng lưu giữ bảo quản hai dung môi khác Formalin PBS Vật liệu phương pháp Mẫu nghiên cứu mẫu mơ sinh thiết từ bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh ung thư vòm họng thu nhận từ bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu mơ lưu giữ bảo quản nhiệt độ oC hai loại dung môi khác nhau: formalin PBS (Phosphate buffer saline) Khai thác liệu Các báo liệu khoa học liên quan khai thác sở liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) từ khóa như: nasopharyngeal carcinoma (ung thư vòm họng), EBNA-1, EBV (Epstein – Barr virus), non-invasion method (phương pháp không xâm lấn), v.v… Dữ liệu khai thác sử dụng để thống kê, xác định tần số trung bình có trọng số diện gen EBNA-1 nhiều loại mẫu bệnh phẩm ung thư khác mẫu dịch phết, mô sinh thiết, máu, v.v… kỹ thuật sinh học phân tử khác PCR, Real-time PCR, v.v… Tách chiết DNA Các mẫu bệnh phẩm tách chiết theo phương pháp Phenol/Chloroform theo quy trình tách chiết Chomczynski Sacchi (1987) có cải biến Phenol từ pH=4 thành pH=8 (Chomczynski, 1987) Nồng độ độ tinh DNA từ mẫu bệnh phẩm sau tách chiết xác định phương pháp đo mật độ quang thông qua tỉ lệ A260/A280 nm Sau tách chiết, DNA mẫu lưu giữ TE (Tris-EDTA) bảo quản nhiệt độ -20 oC sử dụng sau Phản ứng PCR khuếch đại gen EBNA-1 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen EBNA-1 tham khảo từ công trình nghiên cứu Adam cộng (2011) Trình tự cặp mồi thể Bảng Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu Kí hiệu Trình tự Chiều dài sản phẩm EBNA-F (Mồi xi) TGAATACCACCAAGAAGGTG 223 bp EBNA-R (Mồi ngược) AGTTCCTTCGTCGGTAGTC Chu trình phản ứng PCR thiết kế sau: chu kỳ với 95oC-5 phút, 40 chu kỳ lặp lại với 95oC-30 giây, o 42,5 C-30 giây, 72oC-30 giây chu kỳ với 72oC-5 phút Tổng thể tích phản ứng 15 µl bao gồm: 7,5 µl Mastermix 2X, µl mồi (0,5 µl mồi xuôi, 0,5 µl mồi ngược), 5,5 µl ddH2O, µl DNA Sản phẩm phản ứng PCR kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1,5% gửi giải trình tự cơng ty Nam Khoa Kết giải trình tự tiến hành hiệu chỉnh kiểm tra mức độ tương đồng sở liệu Genbank (NCBI) K ế t ) t h c Multiplex M e t h y l a t i o n d ữ q u ả l i ệ u Cho đến nay, chúng tơi khai thác 13 cơng trình nghiên cứu giới liên quan để tiến hành thống kê đánh giá loại mẫu sử dụng, cỡ mẫu, phương pháp sử dụng nhằm phát diện gen EBNA-1 bệnh ung thư vòm họng Kết thống kê thể Bảng v t h ả o l u ậ n K h a i i n h t h i ế t M áu M ô đú c pa rra ffi n - - (15, 4) - - - (7, 7) - (15, 4) S p e c i f i c P C R Bảng Thống kê loại mẫu phương pháp sử dụng phát EBNA-1 M Dịc ô h s phết Tổ n g c ộ Nucleic Acid Sequ ence – Base d Ampl ificati on Real – Time PCR - PCR 1 - (30, 7) Nested PCR - - - (7, 7) n g n ( % Mô sinh thiết Dịch phết Máu Mô đúc parraffin Tổng cộng Nested PCR and Sequencing - - - (7,7) Quantitative PCR 1 - - (15,4) Tổng cộng (46,1) (30,8) (15,4) (7,7) 13 (100,0) n(%) Ghi chú: - khơng có sử dụng nghiên cứu Kết thống kê cho thấy phương pháp sử dụng chủ yếu việc phát EBNA-1 nghiên cứu giới phương pháp PCR (chiếm 30,7%) Bên cạnh đó, loại mẫu sử dụng, chủ yếu mô sinh thiết (46,1%) dịch phết (30,8%) Từ sở liệu thu thập được, tiến hành thống kê tần số trung bình phát gen EBNA-1 nhiều loại mẫu mơ khác thể Hình Hình 1.Thống kê diện EBV tế bào bình thường, tế bào ung thư vịm họng (UTVH), loại mẫu thống kê trung bình có trọng số Chú thích: tâm đường trịn thể tần số báo nghiên cứu gen EBNA-1 nhằm phát EBV, kích thước đường trịn thể số lượng mẫu nghiên cứu, đường thẳng nằm ngang thể tần số xuất EBV trung bình có trọng số Kết thống kê tần số trung bình trọng số phát gen EBNA-1 tế bào ung thư vịm họng, dịch phết, mơ máu 99,24%, 99,70%, 98,55% 68,85% Ngoài ra, tần số trung bình trọng số mẫu tế bào bình thường 0% Kết cho thấy có khác biệt lớn diện gen EBNA-1 mẫu ung thư so với tế bào bình thường Điều cho thấy, diện gen EBNA-1 dấu hiệu đặc trưng cho bệnh nhân ung thư vịm họng hướng tới việc sử dụng dấu chứng sinh học chẩn đốn sớm ung thư vịm họng Ngồi ra, chúng tơi nhận thấy tần số trung bình trọng số mẫu dịch phết mơ cao có giá trị tần số gần Đồng thời, theo kết thống kê loại mẫu sử dụng mẫu dịch phết mẫu mô hai loại mẫu sử dụng nhiều Do đó, việc sử dụng hai loại mẫu thích hợp cho việc phát diện gen EBNA-1 kỹ thuật PCR Tuy nhiên, giới hạn nghiên cứu này, lựa chọn sử dụng loại mẫu mô sinh thiết làm đối tượng nghiên cứu để phát gen EBNA-1 kỹ thuật PCR Một vấn đề cần lưu ý thu nhận mẫu mô sinh thiết cần phải lưu giữ bảo quản dung dịch thích hợp Theo nghiên cứu giới, hai loại dung dịch sử dụng bảo quản nhiều dung dịch Formalin PBS Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát mẫu mô sinh thiết lưu giữ hai dung dịch Khuếch đại EBNA-1 Trong nghiên cứu này, kiến hành khảo sát việc khuếch đại gen EBNA-1 từ mẫu mô sinh thiết thu nhận từ bệnh nhân chẩn đoán ung thư vịm họng lưu giữ hai dung mơi bảo quản PBS (ký hiệu từ A1 đến A6) Formalin (ký hiệu từ B1 đến B6) DNA sau tách chiết tiến hành kiểm tra mức độ tinh nồng độ DNA phương pháp đo mật độ quang bước sóng 260 nm 280 nm Nhìn chung, mẫu tách chiết có tỷ số A260/A280 nằm khoảng chấp nhận được, sử dụng để thực phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu (Dữ liệu khơng trình bày) Hình Kết điện di sản phẩm PC R khu ếch đại gen EB NA1 mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họn g Ghi chú: L: thang DNA 100 bp; (-): mẫu chứng âm; A1 đến A6: mẫu mô sinh thiết lưu giữ dung dịch PBS; B1 đến B6:6 mẫu mô sinh thiết lưu giữ dung môi Formalin Dựa kết điện di, mẫu lưu giữ dung dịch PBS xuất băng với kích thước khoảng 223 bp mẫu A1, A2, A4 A6 Kích thước sản phẩm phù hợp với kích thước gen EBNA-1 khuếch đại với cặp mồi EBNA-F EBNA-R Ở giếng A3, A5 không ghi nhận băng Đối với mẫu lưu giữ dung dịch Formalin, giếng từ B1 đến B6 không ghi nhận băng nào, ghi nhận băng ký sinh có kích thước 100 bp, băng dự đoán dạng cấu trúc thứ cấp mồi Từ kết PCR ghi nhận việc bảo quản mô sinh thiết dung dịch Formalin ảnh hưởng đến chất lượng DNAEBV Điều giải thích rằng: mẫu mô sinh thiết lưu giữ dung dịch Formalin khoảng thời gian dài 12 – 24 tiếng, kết dẫn đến phân hủy DNA thông qua việc bẻ gãy liên kết phân tử DNA Điều hoàn toàn phù hợp với nhận định Campos Gilbert (2012) (Campos cộng sự, 2012) Do đó, chúng tơi lựa chọn dung dịch PBS làm dung dịch lưu giữ, bảo quản mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họng nhiệt độ oC Nhằm khẳng định băng có kích thước 223 bp gen EBNA-1, chúng tơi tiến hành gửi giải trình tự mẫu đại diện Kết giải trình tự thể Hình Hình Kết giải trình tự sản phẩm PCR: (A) mạch xi; (B) mạch ngược Dựa kết giải trình tự cho thấy peak sản phẩm rõ ràng trừ số nucleotide phần đầu trình tự Điều giải thích, vị trí mồi bắt cặp, giải trình tự tín hiệu vùng không rõ ràng Vùng loại bỏ tiến hành hiệu chỉnh trình tự Đoạn trình tự rõ ràng kiểm tra mức độ tương đồng chương trình BLAST Kết BLAST cho thấy, trình tự thu nhận có độ tương đồng cao với trình tự gen EBNA-1 human herpes virus (Mã số truy cập: HQ827839) với giá trị độ tương đồng 98%, giá trị e-value gần (Ident = 98%, E-value = 4e-101) Như vậy, khuếch đại thành công gen EBNA-1 mẫu mô sinh thiết thu nhận từ bệnh nhân ung thư vòm họng lưu giữ bảo quản dung dịch PBS Kết luận Từ kết khai thác liệu, ghi nhận diện gen EBNA-1 dấu chứng đặc trưng cho bệnh nhân ung thư vịm họng Về thực nghiệm, chúng tơi bước đầu xây dựng thành cơng quy trình phát gen EBNA-1 phương pháp PCR đối tượng mẫu mô sinh thiết lưu giữ dung dịch PBS nhiệt độ oC Các kết bước đầu cho phép hướng tới việc khảo sát diện gen EBNA-1 số lượng mẫu bệnh phẩm lớn để hướng tới việc ứng dụng xây dựng phương pháp chẩn đốn sớm ung thư vịm họng người Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Adam, A A M., Abdullah, N E., Khalifa, E H., Hassan, L A M., Elamin, E M., Hamad, K M., Ibrahim, M E., & Hassan, E H (2011) Pathology of nasopharyngeal carcinoma in Sudanese patients and its Association with epstein-Barr Virus: A Report from a single center in Khartou, Advances in Tumor Virology, 2, 1-6 Brooks, L., Yao, Q Y., Rickinson, A B., &Young, L S (1992) Epstein-Barr virus latent gene transcription in nasopharyngeal carcinoma cells: coexpression of EBNA1, LMP1, and LMP2 transcripts, J Virol., 66(5), 2689-2697 Campos, P F.,& Gilbert, T M (2012) DNA extraction from formalin-fixed material, Methods in Molecular Biology, 840, 81-85 Chang, Y S., Tyan, Y S., Liu, S T., Tsai, M S., & Pao, C C (1990) Detection of Epstein-Barr virus DNA sequences in nasopharyngeal carcinoma cells by enzymatic DNA amplification, J Clin Microbiol., 28(11),2398-2402 Chomczynski, P.&Sacchi, N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem, 162(1), 156-159 Chu, E A., Wu, J M., Tunkel, D E.&Ishman, S L.(2008) Nasopharyngeal Carcinoma: The Role of the Epstein - Barr virus, Medscape J Med, 10(7), 165 Frappier, L (2012) Role of EBNA1 in NPC tumourigenesis, Semin Cancer Biol., 22(2), 154-61 Nguyễn Đình Phúc, Lê Thanh Hòa (2008) Virus Epstein-barr ung thư vòm mũi họng số phương pháp đại ứng dụng chẩn đốn Tạp chí Cơng Nghệ sinh học, 6(1), 1-18 Niedobitek, G (2000) Epstein-Barr virus infection in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma Mol Pathol, 53(5), 248-254 Sham, J S., Poon, Y F., Wei, W.I & Choy, D (1990) Nasopharyngeal carcinoma in young patients, Cancer, 65, 2606-2610 Tao, Q &Chan, A T (2007) Nasopharyngeal carcinoma: molecular pathogenesis and therapeutic developments, Expert Rev Mol Med., 9(12), 1-24 Thompson, M P & Kurzrock, R (2004) Epstein-Barr virus and cancer, Clin Cancer Res., 10(3), 803-821 World Health Organization, (2012) Estimated cancer incidence, Mortality and prevalence worldwide in 2012, International agency for research on cancer Yang, J., Zhou, M., Zhao, R., Peng, S., Luo, Z., Li, X., … Li, G (2014) Identification of candidate biomarkers for the early detection of nasopharyngeal carcinoma by quantitative proteomic analysis, J Proteomics., 109, 162-175 Zhang, Z., Sun, D., Hutajulu, S H., Nawaz, I., Nguyen Van, D., Huang, G., … Hu, L F (2012) Development of a non-invasive method, multiplex methylation specific PCR (MMSP), for early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma, PLoS One., 7(11), e45908 ... cho bệnh nhân ung thư vòm họng Về thực nghiệm, bước đầu xây dựng thành công quy trình phát gen EBNA- 1 phương pháp PCR đối tượng mẫu mô sinh thiết lưu giữ dung dịch PBS nhiệt độ oC Các kết bước đầu. .. 4e -10 1) Như vậy, khuếch đại thành công gen EBNA- 1 mẫu mô sinh thiết thu nhận từ bệnh nhân ung thư vòm họng lưu giữ bảo quản dung dịch PBS Kết luận Từ kết khai thác liệu, ghi nhận diện gen EBNA- 1. .. pháp Mẫu nghiên cứu mẫu mô sinh thiết từ bệnh nhân chẩn đốn mắc bệnh ung thư vịm họng thu nhận từ bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu mơ lưu giữ bảo quản nhiệt độ oC hai loại dung môi