Tạp chí Khoa học – Đại học Huế ISSN 1859-1388 Tập 126, Số 3A, 2017, Tr 69-78 NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN HAEMOPHILUS PARASUIS BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM TRÊN CHUỘT LANG (GUINEA PIG) Nguyễn Văn Chào1*, Zhou Rui2, Wang Qiao Na2 Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Trường Đại học Nông nghiệp Hoa Trung, Hồ Bắc, Trung Quốc Tóm tắt: Vi khuẩn Haemophilus parasuis cấy chuyển qua 250 đời hai điều kiện nhiệt độ, nhằm giảm độc lực với hy vọng chọn chủng có độc lực phù hợp làm nguyên liệu để sản xuất vaccine nhược độc Các chủng H37-100, H37-150, H37-200, H37-250 H40-100, H40-150, H40-200, H40-250 hệ cấy truyền từ vi khuẩn Haemophilus parasuis serotype chủng SH0165 điều kiện nuôi cấy 37 oC 40 oC sử dụng để gây nhiễm cho chuột lang Liều gây nhiễm sử dụng liều LD 100 (5 x 109 CFU/ml) vi khuẩn Haemophilus parasuis serotype chủng SH0165 Thí nghiệm tiến hành nhằm đánh giá độc lực chủng vi khuẩn nghiên cứu thông qua tiêu tỷ lệ chết chuột thí nghiệm theo thời gian, bệnh tích, tỷ lệ mẫu mơ phân lập vi khuẩn sau mổ khám Kết cho thấy tỷ lệ chuột thí nghiệm chết trước 24 có xu hướng giảm từ hệ 100 - 250 hai nhóm 37 oC 40 oC Bệnh tích triệu chứng chuột thí nghiệm điển hình bệnh Glasser, sốt cao, ủ rũ, bỏ ăn, viêm tơ huyết, quan có sợi viêm dạng tơ huyết bao phủ Tỷ lệ mẫu phân lập vi khuẩn sau mổ khám cho thấy độc lực vi khuẩn giảm rõ rệt Các quan chuột không chết sau thời gian gây nhiễm phân lập vi khuẩn H parasuis Như vậy, độc lực chủng vi khuẩn tiếp đời có xu hướng giảm hệ tiếp đời tăng lên Từ khóa: chuột lang, gây nhiễm, vi khuẩn, H parasuis Đặt vấn đề Haemophilus parasuis vi khuẩn Gram âm thuộc họ Pasteurellaceae nguyên nhân gây nên bệnh Glasser lợn Bệnh có triệu chứng điển sinh màng nhầy, nhiều tơ huyết, viêm đường hô hấp viêm màng não [1] Bệnh H parasuis có triệu chứng khác viêm phổi, lợn bị chết đột ngột, tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết cao, có tỷ lệ chết lên đến 64,00 % [8 - 9] H parasuis vi khuẩn xuất sớm đường hơ hấp lợn con, phân lập từ đường hô hấp lợn khỏe mạnh [7,10] Vi khuẩn thường phân lập từ mô phổi, đường hô hấp lợn, mơ não phân lập vi khuẩn Đã có 15 chủng H parasuis xác định biện pháp định danh truyền thống Một số chủng 15 chủng định danh phương pháp phân tử số giải trình tự tồn genome chủng SH0165 [15], ER - 6P (serovar 15) and Nagasaki (serotype 5), 12939 (serotype 1), SW140 (serotype 2), 29755 (serotype 5), MN - H (serotype 13), 84 - 15995 (serotype 15), SW114 (serotype 3), H465 (serotype 11), D74 (serotype 9), and 174 (serotype 7) [3] Tuy nhiên chủng có độc lực cao khơng thể dùng * Liên hệ: chaonguyenvan27@gmail.com Nhận bài: 20-10-2016; Hoàn thành phản biện: 24-11-2016; Ngày nhận đăng: 01-02-2017 Nguyễn Văn Chào CS Tập 126, Số 3A, 2017 trực tiếp vaccine nhược độc Chính vậy, việc thử nghiệm chủng có độc lực thấp ngày quan tâm nghiên cứu Do chủng tiêm truyền qua động vật cấy chuyển nhiều đời lại mang lại đột biến tự nhiên nhanh; vậy, việc đánh giá độc lực chủng cần thiết để đạt mục đích sử dụng làm nguyên liệu sản xuất vaccine phòng bệnh Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn Haemophilus parasuis sử dụng nghiên cứu bao gồm chủng SH0165 serotype phân lập từ lợn bị bệnh Trung Quốc lưu giữ phịng thí nghiệm vi sinh vật Nơng nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp Hoa Trung; chủng H 37-100, H37-150, H37-200, H37-250 hệ tiếp đời từ chủng gốc SH0165 điều kiện nuôi cấy 37 oC; H40-100, H40-150, H40-200, H40-250 hệ tiếp đời từ chủng gốc SH0165 điều kiện ni cấy 40 oC Trước tiến hành thí nghiệm tất chủng vi khuẩn khẳng định phương pháp PCR với cặp mồi 16S rRnA-F 5’GGC TTC GTC ACC CTC TGT AT- 3’; 16S rRnA-R 5’ GTG ATG AGG AAG GTT GGT GT-3’ khuếch đại gen 16S rRNA để khẳng định chủng vi khuẩn H parasuis (hình 1) Hình Kết kiểm tra gene 16S rRnA chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu (1Marker; 2,3SH0165; 4Đối chứng âm; 5H37-100, 6H37-150, 7H37-200, 8H37-250; 9H40-100, 10H40-150, 11H40-200, 12H40-250) 2.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng đường chuẩn vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Đường cong sinh trưởng xây dựng để đánh giá thời gian tốc độ sinh trưởng chủng vi khuẩn Đường chuẩn chủng vi khuẩn xây dựng để ứng dụng xác định số lượng tế bào vi khuẩn thông qua đo giá trị OD 600 Các phương trình tương quan (biểu đồ 1) sử dụng tương ứng với chủng vi khuẩn nghiên cứu Vi khuẩn trước thí nghiệm tái huyền phù từ mẫu bảo quản -80 oC môi trường TSA (Tryptic Soy Agar Difco Laboratories, Detroit, MI cung cấp) bổ sung 10 mg/ml nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) % huyết bị, ni 37 oC 40 oC tương ứng với điều kiện phân lập trước chủng Sau 20 đến 24 vi khuẩn tiếp tục cấy chuyển sang môi trường BHI bổ sung NAD (10 mg/ml) % huyết 70 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3A, 2017 bị, ni 37 oC 40 oC với điều kiện tương ứng, có lắc với tốc độ 175 vòng/phút, % CO2 Sau 16 đến 18 tiếp tục chuyển sang môi trường BHI với dung tích lớn (30 ml/bình), huyền phù vi khuẩn đo OD600 lần, đo đến đường cong sinh trưởng đạt đỉnh dừng lại (tùy thuộc vào tốc độ sinh trưởng chủng) Đường cong sinh trưởng xây dựng dựa tương quan giá trị OD600 thời gian sinh trưởng Đường chuẩn xây dựng dựa kết xác định đường cong sinh trưởng, cách chọn đường cong sinh trưởng giai đoạn sinh trưởng nhanh (log phase) để xác định tương quan số lượng vi khuẩn sống (CFU/ml) giá trị OD 600 phương pháp mô tả [6] Vi khuẩn nuôi cấy mơi trường BHI thể tích ni 30 ml, giá trị OD600 đo lần, dựa đường cong sinh trưởng chọn thời điểm thích hợp cho chủng để lấy mẫu xác định số lượng tế bào sống (CFU/ml) Phương pháp xác định số lượng tế bào sống (CFU/ml): lấy 100 µl mẫu canh khuẩn, pha loãng thành dãy nồng độ từ 10 -1 đến 10-9, chọn ba nồng độ (10-7 - 10-9) liên tiếp cấy trải mơi trường TSA, sau ni cấy nhiệt độ thích hợp Số lượng khuẩn lạc đếm sau 24 h ni cấy để tính số CFU/ml [6] Biểu đồ Đường chuẩn chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 71 Nguyễn Văn Chào CS 2.3 Tập 126, Số 3A, 2017 Thí nghiệm đánh giá độc lực chủng vi khuẩn chuột lang Vi khuẩn nuôi cấy môi trường BHI để đạt giá trị OD thích hợp cho chủng Huyền phù vi khuẩn ly tâm 5000 vịng/phút để thu sinh khối sau tái huyền phù nước sinh lý cho mật độ tế bào đạt x 10 CFU/ml, đem tiêm cho chuột với liều ml/con, chủng tiêm cho chuột Mật độ tế bào x 109 CFU/ml liều LD100 cho vi khuẩn H parasuis serotype chủng SH0165, liều khẳng định liều LD 100 thí nghiệm trước Số lượng tế bào sống CFU/ml xác định tùy thuộc vào mức độ sinh trưởng chủng Khi giá trị OD650 đạt mức cần thiết (nằm giá trị đường chuẩn lựa chọn) Số lượng tế bào sống (CFU/ml) liều gây nhiễm đảm bảo cách làm giàu (ly tâm với lượng lớn) sau tái huyền phù với nước sinh lý Chuồng nuôi chế độ chăm sóc: chuột ni chuồng riêng biệt đặt phòng khác cho nhóm thí nghiệm Chuột cho ăn thức ăn chế biến sẵn đảm bảo vô trùng ngày lần, hệ thống nước uống cung cấp tự động từ bể nước phía trên; chuồng thường xuyên vệ sinh khử trùng Chuột chọn thí nghiệm chuột lang đực có trọng lượng trung bình 300 g/con đến 320 g/con Chuột ni thích nghi trước gây nhiễm ngày Trước thí nghiệm phải đảm bảo chuột hồn tồn khỏe mạnh khơng có triệu chứng bất thường Theo dõi triệu chứng chuột sau gây nhiễm: chuột theo dõi ghi nhận triệu chứng lần, ghi nhận chiệu chứng thời gian chết Chuột chết mổ khám chụp ảnh bệnh tích, lấy mẫu (não, phổi, tim, gan lách) để phân lập vi khuẩn Môi trường TSA sử dụng để phân lập lại vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm Chuột theo dõi 72 sau gây nhiễm, sau 72 không chết mổ để kiểm tra bệnh tích lấy mẫu phân lập lại vi khuẩn Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm lấy toàn quan (gan, lách, phổi não), dùng kéo cắt nhỏ sau cho vào ống 50 ml có chứa sẵn viên bi thủy tinh 20 ml nước sinh lý hấp khử trùng Các ống sau đưa vào máy lắc với tốc độ 300 vòng/phút phút đến 10 phút (tùy đặc tính mơ) mô trộn đều, từ ống mẫu lấy 100 µl pha lỗng thành dãy nồng độ (10-1 đến 10-5) (giai đoạn lặp lại lần/1 mẫu), từ dãy nồng độ lấy 100 µl cấy trải môi trường TSA để xác định diện vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn sau phân lập khẳng định lại phương pháp PCR Cặp mồi 16S rRnA-F 5’GGC TTC GTC ACC CTC TGT AT- 3’ 16S rRnA-R 5’ GTG ATG AGG AAG GTT GGT GT 3’ đặc hiệu cho vi khuẩn H parasuis sử dụng để khẳng định lại kết phân lập Kết ghi nhận dương tính kết PCR dương tính Kết thảo luận 3.1 Kết xác định đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Kết xác định đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu thể biểu đồ 72 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3A, 2017 Biểu đồ Đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu Biểu đồ cho thấy tốc độ sinh trưởng hệ tiếp đời có xu hướng chậm so với chủng gốc (H parasuis serotype chủng SH0165) Trong chủng tiếp đời cần khoảng 12 đến 13 đạt đỉnh đường cong (phát triển thành số lượng tối đa) sau trì pha ổn định Chủng SH0165 có tốc độ sinh trưởng chậm so với chủng tiếp đời, chủng cần khoảng 19 đến 22 để đạt đến mức độ sinh trưởng tối đa So sánh giá trị tương quan OD600 thời gian sinh trưởng chủng tiếp đời cho thấy giá trị OD600 chủng H37-100 có xu hướng thấp so với chủng khác Kết phù hợp với kết Gliniewicz cộng [5] đánh giá đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn Flavobacterium psychrophilum tiếp đời (20 lần đến 50 lần) mơi trường có diện rifampicin Kết nghiên cứu Gliniewicz cộng (2015) cho thấy, tốc độ sinh trưởng chủng bố mẹ chậm so với chủng tiếp đời từ chủng bố mẹ [5] 3.2 Tỷ lệ chuột thí nghiệm chết theo thời gian Chuột lơ thí nghiệm tiêm liều tương ứng với liều LD100 chủng gốc SH0165 (5 x 109 CFU/ml), tiêm ml canh khuẩn Kết theo dõi thời gian gây chết chuột thể bảng Kết bảng cho thấy, chủng vi khuẩn gốc (SH0165), hệ H100 tiếp đời, hai điều kiện nhiệt độ 37 oC 40 oC có độc lực cao Độc lực chủng hai điều kiện tương đương độc lực chủng gốc SH0165 Trong vi khuẩn H parasuis serotype chủng SH0165 khẳng định chủng có độc lực cao [15] nhóm H37-100 H40-100 có độc lực cao tương tự chủng gốc (5/5 chết trước 48 h sau tiêm) Tuy nhiên, đến hệ 150, 200 250 độc lực có xu hướng giảm xuống, tỷ lệ chết nhóm H37-150 H40-150 80,00 % (4/5); đến nhóm H37-200, H40-250 tỷ lệ chết giảm xuống 20,00 % (1/5) Từ kết thấy độc lực chủng tiếp đời từ chủng SH0165 có xu hướng giảm xuống theo hệ nuôi cấy hai điều kiện 37 oC 40 oC Vi khuẩn tiếp đời giảm độc lực nghiên cứu ứng dụng trực tiếp loại vaccine giảm độc lực Một số nghiên cứu giải thích nguyên nhân dẫn đến giảm độc lực chủng tiếp đời số điều kiện định [4-5,12,14] 73 Nguyễn Văn Chào CS Tập 126, Số 3A, 2017 Bảng Số chuột thí nghiệm chết sau gây nhiễm Lơ thí nghiệm SH0165 H37-100 H37-150 H37-200 H37-250 Đối chứng H40-100 H40-150 H40-200 H40-250 3.3 Số chuột chết trước 12 h (con) 0 0 0 0 0 Số chuột chết trước 24 h (con) 2 2 0 Số chuột chết trước 36 h (con) 4 Số chuột chết trước 48 h (con) 4 Số chuột chết trước 60 h (con) 5 Tỷ lệ chuột chết trước 72 h (%) Bệnh tích kết phân lập vi khuẩn H parasuis từ mẫu bệnh phẩm Bệnh tích chuột lơ thí nghiệm thể hình Lô: Đối chứng Lô: SH0165 Lô: H37-100 Lô: H37-150 74 Số chuột chết trước 72 h (con) 5 100,0 100,0 80,00 20,00 40,00 0,00 100,0 80,00 60,00 20,00 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3A, 2017 Lô: H37-200 Lô: H37-250 Lô: H40-100 Lơ: H40-150 Lơ: H40-200 Lơ: H40-250 Hình Bệnh tích điển hình số quan chuột thí nghiệm 1: Xoang bụng; 2: Gan; 3: Lách; 4: Phổi; 5: Tim; 6: Não Qua kết thấy bệnh tích chuột lơ thí nghiệm điển hình bệnh Glasser Với bệnh tích viêm dính xoang bụng xoang ngực chuột Gan lách có nhiều vùng viêm dính tạo màng giả, phổi có nhiều đốm đen nhìn từ bề mặt Đặc biệt, bệnh tích điển hình xuất màng viêm dính quan nội tạng tạo sợi tơ huyết bề mặt xoang thể Ngoài bệnh tích điển hình quan sát được, q trình thí nghiệm triệu chứng bệnh chuột thí nghiệm mệt mỏi, bỏ ăn, thở khó, sốt cao… ghi nhận Như vậy, khẳng định chuột thí nghiệm 75 Nguyễn Văn Chào CS Tập 126, Số 3A, 2017 chết tác động độc tố vi khuẩn sử dụng gây nhiễm Những triệu chứng bệnh tích điển hình quan sát tương đồng với kết nghiên cứu trước [2,11,13] Chuột chết trước 72 không chết thời gian thí nghiệm mổ khám lấy mẫu để phân lập lại vi khuẩn H parasuis Kết cho thấy, tỷ lệ mẫu dương tính với vi khuẩn H parasuis thay đổi mô khác (bảng 1) Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mô phổi não cao Ở lô thí nghiệm H37-200; H37-250; H40-250 phân lập vi khuẩn chuột không chết sau 72 theo dõi Ở hai lơ thí nghiệm H40-100 H40-150 tất mẫu mô phân lập vi khuẩn H parasuis Với chuột chết, việc phân lập vi khuẩn mơ coi bình thường tác động vi khuẩn làm sinh bệnh nguyên nhân trực tiếp làm chuột chết Ngược lại, chuột không chết phân lập vi khuẩn, điều lại có ý nghĩa lớn trình sinh đáp ứng miễn dịch cho thể Việc trì số lượng định thời gian định giúp thể có hội tiếp xúc với mầm bệnh để kích thích sinh miễn dịch Tuy nhiên, mầm bệnh tồn lâu thể có nguy đào thải thường xuyên môi trường gây bệnh, khẳng định chủng vi khuẩn giảm độc lực việc khơng đáng lo ngại Bảng Kết phân lập vi khuẩn H parasuis từ mẫu bệnh phẩm chuột thí nghiệm Bệnh phẩm Mô tim (mẫu +/mẫu kiểm tra (%)) Mô phổi (mẫu +/mẫu kiểm tra (%)) Mô lách (mẫu +/mẫu kiểm tra (%)) Mô não (mẫu +/mẫu kiểm tra (%)) SH0165 5/5 (100) 4/5 (80,0) 5/5 (100) 5/5 (100) H37-100 3/5 (60,0) 5/5 (100) 3/5 (60,0) 4/5 (80,0) H37-150 4/5 (80,0) 4/5 (80,0) 4/5 (80,0) 4/5 (80,0) H37-200 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) H37-250 4/5 (80,0) 5/5 (100) 4/5 (80,0) 5/5 (100) Đối chứng 0/5 (0,0) 0/5 (0,0) 0/5 (0,0) 0/5 (0,0) H40-100 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) H40-150 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) H40-200 5/5 (100) 5/5 (100) 5/5 (100) 4/5 (80,0) H40-250 4/5 (80,0) 4/5 (80,0) 4/5 (80,0) 5/5 (100) Lơ thí nghiệm Kết luận Độc lực chủng vi khuẩn H parasuis sau tiếp đời qua nhiều hệ (khoảng 200 đến 250 hệ) có xu hướng giảm rõ rệt 76 Jos.hueuni.edu.vn Tập 126, Số 3A, 2017 Các hệ vi khuẩn thứ 100 độc lực tương đối cao chuột lang (100 % số chuột gây nhiễm chết trước 48 h) Tốc độ sinh trưởng đạt mức sinh trưởng tối đa chủng sau tiếp đời nhanh so với chủng gốc SH0165 Chuột lang gây nhiễm có triệu chứng, bệnh tích điển hình bệnh Glasser Tài liệu tham khảo Amano H., Shibata M., Kajio N., Morozumi T (1996), Pathogenicity of Haemophilus parasuis serovars and in contact-exposed pigs, Journal of veterinary medical science, 58(6), 559 - 561 Biberstein E L., Gunnarsson A., Hurvell B (1977), Cultural and biochemical criteria for the identification of Haemophilus spp from swine, American Journal of Veterinary Research, 38(1), - 11 Brockmeier S L., Register K B., Kuehn J S., Nicholson T L., Loving C L., Bayles D O., Shore S M., Phillips G J (2014), Virulence and draft genome sequence overview of multiple strains of the swine pathogen Haemophilus parasuis, PLoS One, 9(8), e103787 (103781 - 103713) Ferguson-Noel N M., Laibinis V A., Kleven S H (2012), Evaluation of Mycoplasma gallisepticum Kstrain as a live vaccine in chickens, Avian Diseases, 56(1), 44 - 50 Gliniewicz K., Wildung M., Orfe L H., Wiens G D., Cain K D., Lahmers K K., Snekvik K R., Call D R (2015), Potential mechanisms of attenuation for rifampicin-passaged strains of Flavobacterium psychrophilum, BioMed Central Microbiology, 15(179), 015 - 0518 Loske A M., Tello E M., Vargas S., Rodriguez R (2014), Escherichia coli viability determination using dynamic light scattering: a comparison with standard methods, Archives of Microbiology, 196(8), 557 563 Moller K., Kilian M (1990), V factor-dependent members of the family Pasteurellaceae in the porcine upper respiratory tract, Journal of clinical microbiology, 28(12), 2711 - 2716 Morozumi T., Nicolet J (1986), Morphological variations of Haemophilus parasuis strains, Journal of Clinical Microbiology, 23(1), 138 - 142 Oliveira S., Galina L., Blanco I., Canals A., Pijoan C (2003), Naturally-farrowed, artificially-reared pigs as an alternative model for experimental infection by Haemophilus parasuis, Canadian journal of veterinary research, 67(2), 146 - 150 10 Oliveira S., Pijoan C (2004), Haemophilus parasuis: new trends on diagnosis, epidemiology and control, Veterinary Microbiology, 99(1), - 12 11 Olvera A., Segalés J., Aragón V (2007), Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods, The Veterinary Journal, 174(3), 522 - 529 12 Plante K S., Rossi S L., Bergren N A., Seymour R L., Weaver S C (2015), Extended Preclinical Safety, Efficacy and Stability Testing of a Live-attenuated Chikungunya Vaccine Candidate, PLoS Neglected Tropical Diseases, 9(9), - 19 13 Riley M G., Russell E G., Callinan R B (1977), Haemophilus parasuis infection in swine, Journal of The American Veterinary Medical Association, 171(7), 649 - 651 14 Sun Y., Liu C S., Sun L (2010), Isolation and analysis of the vaccine potential of an attenuated Edwardsiella tarda strain, Vaccine, 28(38), 6344 - 6350 77 Nguyễn Văn Chào CS Tập 126, Số 3A, 2017 15 Yue M., Yang F., Yang J., Bei W., Cai X., Chen L., Dong J., Zhou R., Jin M., Jin Q., Chen H (2009), Complete genome sequence of Haemophilus parasuis SH0165, Journal of Bacteriology, 191(4), 1359 - 1360 VIRULENCE OF HAEMOPHILUS PARASUIS SEROVAR SH0165 STRAIN IN GUINEA PIG Nguyen Van Chao1*, Zhou Rui2, Wang Qiao Na2 College of Agriculture and Forestry, Hue University, Vietnam Huazhong Agricultural University, Hubei, China Abstract: A negative bacterium, Haemophilus parasuis, was cultivated through 250 passages under two temperature regimes in order to reduce its virulence and find a strain with suitable virulence for liveattenuated vaccine production In this study, a guinea pig infection model was used to investigate the virulence of the passages of H parasuis serovar SH0165 strain Two experimental groups were carried out, both with serial passages of H parasuis serovar SH0165 strain, including H37-100, H37-150, H37-200, H37-250 (incubation at 37 oC) and H40-100, H40-150, H40-200, and H40-250 (incubation at 40 oC) The median lethal concentration (LD100: 5x109 CFU/ml) was used as injection dose for the experiments The results showed that the cumulative mortality (%) of the pigs decreased from H100 to H250 in both experimental groups during the first 24 hours after infection Moreover, the typical clinical signs and changes of the infected tissues of Glasser’s disease were found in the experimental pigs such as fever, respiratory infections, polyserositis, meningitis, and arthritis Additionally, H parasuis was reisolated and identified from the survived pigs In conclusion, the virulence of the passages of H parasuis serovar SH0165 strain was inversely related to the passage time Keywords: guinea pig, infection, bacterium, H parasuis 78