Nghiên cứu định danh vi khuẩn lelliottia amnigena bằng phương pháp pcr

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG VÕ BÁ DUY NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VI KHUẨN LELLIOTTIA AMNIGENA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng, năm 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG  VÕ BÁ DUY NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VI KHUẨN LELLIOTTIA AMNIGENA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng, năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu tác giả hướng dẫn TS Nguyễn Minh Lý chưa công bố cơng trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả Võ Bá Duy I LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu khoa học tơi đầu tư kỹ lưỡng Đây cơng trình gặp phải nhiều vấn đề khó khăn, vấn đề khuất mắc q trình nghiên cứu tơi Tuy nhiên, thành đem lại xứng đáng ghi nhận Tất thành không riêng nỗ lực thầy trị chúng tơi mà cịn giúp đỡ, ủng hộ mặt vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, thầy bạn bè để tơi hồn thành tốt khóa luận Trước hết, xin chân thành cảm ơn ba mẹ, cảm ơn người giúp đỡ, động viên tôi, hậu phương vững hỗ trợ tơi tập trung hoàn thành tốt đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Minh Lý, người tận tâm hỗ trợ, giúp đỡ tơi, động viên tơi thực khóa luận Cảm ơn thầy theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đưa góp ý kinh nghiệm thực tiễn ngành sống suốt thời gian vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Sinh – Môi trường giúp đỡ, hỗ trợ tội suốt trình học tập bốn năm giảng đường đại học, tạo điều kiện hội để sinh viên học tập, rèn luyện tốt Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn thân thương đến người bạn, người anh, người chị bạn sinh viên khóa ln đồng hành tơi, ln chia sẻ kiến thức hỗ trợ giúp đỡ lẫn q trình nghiên cứu, học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! II MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG BIỂU VI DANH MỤC HÌNH ẢNH VII TÓM TẮT VIII MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh héo xanh vi khuẩn 1.2 Vi khuẩn L amnigena 1.2.1 Phân loại vi khuẩn 1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo vi khuẩn L amnigena 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá vi khuẩn L amnigena 1.3 Tổng quan phương pháp PCR 1.3.1 Nguyên lý phản ứng PCR 1.3.2 Ứng dụng phương pháp PCR để định danh vi khuẩn 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 Chương ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 III 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 13 2.3.2 Phương pháp phân tích trình tự DNA 13 2.3.3 Phương pháp thiết kế mồi 14 2.3.4 Phương pháp mô phản ứng PCR phần mềm FastPCR WebPCR 14 2.3.5 Phương pháp tách chiết DNA đệm CTAB 14 2.3.6 Kỹ thuật PCR 15 2.3.7 Phương pháp điện di gel agarose 15 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Kết phân tích trình tự DNA 16 3.2 Kết thiết kế mồi đặc hiệu 18 3.3 Kết chạy mô phản ứng 18 3.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế kỹ thuật PCR 21 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số 21 3.4.2 Phản ứng PCR với mồi 759/760 21 3.4.3 Phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế 22 3.5 Chạy tối ưu phản ứng PCR với mồi Pec431 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 Kết luận 27 Kiến nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 IV DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center bp Base pair CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid HXVK Héo xanh vi khuẩn Kb Kilobase mg Milligram mL Milliliter mM Millimol PCR Polymerase chain reaction SPA Sucrose peptone agar TBE Tris-Borate acid-EDTA TZC Tetrazolium chloride V DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tiêu đề bảng Trang 2.1 Danh sách chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 12 2.2 Trình tự cặp mồi 759/760 sử dụng nghiên cứu 12 2.3 Danh sách trình tự DNA lựa chọn làm mạch khn 13 3.1 Phân tích trình tự dựa vào vùng gen mã hóa locus 16 3.2 Trình tự cặp mồi thiết kế sử dụng nghiên cứu 18 VI DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tiêu đề hình Trang 1.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Lelliottia amnigena 3.1 Độ tương đồng chủng với vị trí locus NZ_PDDA01000052 17 3.2 Độ tương đồng chủng với vị trí locus PDDA01000045 17 3.3 Độ tương đồng chủng với vị trí locus NZ_PDDA01000053 17 3.4 Độ tương đồng chủng với vị trí locus MW148523 17 3.5 Chạy mô phản ứng PCR với phần mềm FastPCR WebPCR 20 3.6 DNA tổng số mẫu vi khuẩn 21 3.7 Phản ứng PCR với cặp mồi 759/760 22 3.8 Phản ứng PCR với cặp mồi C167 22 3.9 Phản ứng PCR với cặp mồi Pec431 23 3.10 Phản ứng PCR với cặp mồi C183 24 3.11 Phản ứng PCR với cặp mồi Vrc2 24 3.12 Sản phẩm Gradient PCR với cặp mồi Pec431 chủng L amnigena 25 3.13 Phản ứng PCR chủng vi khuẩn với cặp mồi Pec431 57oC 26 VII TÓM TẮT Bệnh héo xanh vi khuẩn coi năm loại bệnh trồng thuộc đối tượng quan tâm Bệnh có nguồn gốc đất, phổ biến gây tổn thất nghiêm trọng sản xuất nông nghiệp, trồng có ý nghĩa kinh tế lạc, cà chua, khoai tây làm giảm đáng kể đến suất chất lượng nơng sản phẩm Hiện có nhiều tác nhân gây bệnh chưa xác định Trong đó, Lelliottia amnigena tác nhân gây bệnh héo xanh vi khuẩn báo cáo gần Hiện nay, việc định danh loài vi khuẩn gây bệnh thơng qua phương pháp vi sinh hóa sinh khó khăn Trong nghiên cứu đưa kết nghiên cứu tạo đoạn mồi đặc hiệu để định danh tác nhân gây bệnh phương pháp PCR Kết nghiên cứu kiểm chứng hiệu cặp mồi Pec431-fp 5’CATCGCCAAAGGCCAGAATC-3’ Pec431-rp 5’-CCGTTAGGCTTGAGCAGTTCA-3’ việc định danh vi khuẩn L amnigena đối sánh với chủng vi khuẩn thuộc loài khác nhau, bao gồm Lelliottia amnigena; Ralstonia solanacearum; Serratia rubidaea; Bacillus amyloliquefaciens Bacillus velezensis Chính vậy, cặp mồi Pec431 thiết kế nghiên cứu giúp nhận diện nhanh vi khuẩn Lelliottia amnigena Từ khóa: Bệnh héo xanh vi khuẩn, Lelliottia amnigena, Ralstonia solanacearum, PCR VIII C4-dicarboxylate ABC transporter MW148523 16S RNA ribosomal 518 - 1087 100 - 85,96 < 93,68 - 628 100 - 95,4 < 95,87 Hình 3.1 Độ tương đồng chủng với vị trí locus NZ_PDDA01000052 Hình 3.2 Độ tương đồng chủng với vị trí locus PDDA01000045 Hình 3.3 Độ tương đồng chủng với vị trí locus NZ_PDDA01000053 Hình 3.4 Độ tương đồng chủng với vị trí locus MW148523 17 3.2 Kết thiết kế mồi đặc hiệu Các cặp mồi định danh L amnigena thiết kế dựa so sánh trình tự chủng: L amnigena strain FDAARGOS_395; L amnigena strain NCTC12124; L amnigena strain ZB04 số chủng tham chiếu khác đăng ký genbank Trình tự cặp mồi trình bày bảng sau (Bảng 3.2.) Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi thiết kế sử dụng nghiên cứu Tên mồi Trình tự (5' - 3') Kích thước Kích thước sản phẩm PCR dự Nhiệt độ bắt (bp) kiến (bp) cặp(Ta) 801 56 432 59 384 58 560; 400 57 C167-fp ACATCTTTTTGCGGCGGATA 20 C167-rp TAAAGGTACGCGCAATCACG 20 Pec431-fp CATCGCCAAAGGCCAGAATC 20 Pec431-rp CCGTTAGGCTTGAGCAGTTCA 21 C183-fp GAAATCGAAATGGCCTACGG 20 C183-rp CCATCAGCACCGAAACGAT 19 Vrc2-1 GTTGGATCACCTCCTTACCTGA 22 Vrc2-2 CCTCACAACCCGAAGATGTTTC 22 3.3 Kết chạy mô phản ứng Chạy mô phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế phần mềm FastPCR phần mềm WebPCR (Hình 3.5.) Từ kết chạy mô với cặp mồi thiết kế Cho thấy rằng, Độ phù hợp với cặp mồi với chủng vi khuẩn L amnigena 100%; nhiệt độ nóng chảy %GC nằm ngưỡng cho phép, kích thước sản phẩm PCR khơng cao Phù hợp với tiêu đưa Nhiệt độ bắt cặp (Ta) cặp mồi tính tốn thơng qua thơng số NN để tạo dự đốn xác oligonucleotide DNA nhiệt động lực học polyme (Santalucia, 1998) Từ đưa chu trình nhiệt phù hợp cho cặp mồi 56oC; 59oC 58oC; 57oC tương ứng với cặp mồi C167; Pec431; C183 Vrc2 18 19 Hình 3.5 Chạy mơ phản ứng PCR với phần mềm FastPCR WebPCR 20 3.4 Kết kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế kỹ thuật PCR 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Chín chủng vi khuẩn tiến hành tách DNA tổng số dung dịch đệm CTAB 2% Các mẫu tách chiết có DNA tổng số, kết điện di kiểm tra DNA tổng số trình bày hình sau (Hình 3.6.) Hình 3.6 DNA tổng số mẫu vi khuẩn Chất lượng DNA với độ tinh tương đối, số mẫu chứa thành phần RNA DNA đứt gãy Tất DNA tổng số tách chiết đủ điều kiện để sử dụng cho bước 3.4.2 Phản ứng PCR với mồi 759/760 Cặp mồi giúp xác định chủng vi khuẩn L amnigena, R solanacearum S rubidaea dựa sản phẩm PCR xuất độ dài tương đối khoảng 300bp (Hình 3.7.) Kết phản ứng PCR với mồi 759/760 mô tả (Opina et al., 1997) cho thấy trình tự có kích thước khoảng 280 bp tổng hợp chủng R solanacearum Tuy nhiên, nhận thấy trình tự có kích thước gần tương tự tổng hợp chủng L amnigena (LA); S rubidaea (SR) Kết giải trình tự sản phẩm PCR tổng hợp cặp mồi 759/760 xác nhận xác lồi Như thấy, cặp mồi 759/760 có tính đặc hiệu chưa cao khó phân biệt lồi , L amnigena; S rubidaea, R solanacearum 21 Hình 3.7 Phản ứng PCR với cặp mồi 759/760 3.4.3 Phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế a Phản ứng PCR với mồi C167 Từ kết phản ứng PCR với cặp mồi C167 (Hình 3.8.), cho thấy chủng L amnigena (LA); S rubidaea (SR) B velezensis (6) xuất band có kích thước khác nhau, kích thước tương đối chủng theo thứ tự 800bp; 850bp 1700bp Kích thước sản phẩm vi khuẩn L amnigena tương ứng với giả thiết đưa Tuy nhiên độ chênh lệch kích thước sản phẩm mẫu LA SR khơng nhiều Hình 3.8 Phản ứng PCR với cặp mồi C167 22 b Phản ứng PCR với mồi Pec431 Theo kết phản ứng PCR chủng vi khuẩn với cặp mồi Pec431(Hình 3.9.) có mẫu L amingena (LA) xuất band có kích thước khoảng 400bp phù hợp với kích thước sản phẩm đoạn mồi dự đốn Dựa vào cho thấy rằng, cặp mồi Pec431 có khả định danh chủng vi khuẩn L amnigena Hình 3.9 Phản ứng PCR với cặp mồi Pec431 c Phản ứng PCR với mồi C183 Kết phản ứng PCR chủng vi khuẩn với cặp mồi C183 (Hình 3.10.) cho thấy kích thước phù hợp với giả thiết Tuy nhiên, độ đặc hiệu mồi chưa cao chủng vi khuẩn L amnigena (LA); Bacillus velezensis (6) Bacillus sp (7) kích thước tương đối khoảng gần 400bp, khó phân biệt 23 Hình 3.10 Phản ứng PCR với cặp mồi C183 d Phản ứng PCR với mồi Vrc2 Sản phẩm phản ứng PCR với cặp mồi Vrc2 (Hình 3.11.) chủng vi khuẩn cho thấy xuất nhiều band khác nhau, chủng L amnigena (LA) xuất band, kích thước phù hợp với giả thuyết đưa Tuy nhiên, độ đặc hiệu cặp mồi Vrc2 chưa cao Chiều dài số lượng band mẫu nhiều Hình 3.11 Phản ứng PCR với cặp mồi Vrc2 3.5 Chạy tối ưu phản ứng PCR với mồi Pec431 Sản phẩm Gradient PCR với mồi Pec431 thể hình 3.12 Với nhiệt độ bắt cặp khác thiết lập từ máy PCR Aeris Thermal Cycler (ESCO, Singapore) 24 Hầu band đạt kích thước phù hợp với kích thước dự đốn, độ dày độ sáng band cao tất mẫu Tuy nhiên lane lane 2, sản phẩm xuất vạch dẫn tới độ đặc hiệu chưa cao Tại lane (57.1oC) nhiệt độ chọn làm nhiệt độ tối ưu với nồng độ PCR khoảng 35ng/1µL mẫu sản phẩm Thành phần phản ứng với tổng thể tích 10 µL đó: nồng độ Primer 0,5 pmol/µL, nồng độ DNA từ 50-100ng, số chu kỳ lặp lại 30 chu kỳ Hình 3.12 Sản phẩm Gradient PCR với cặp mồi Pec431 chủng L amnigena M: 100bp ladder; lane 1: 55oC; lane 2: 56.2oC; lane 3: 57.1oC; lane 4: 58.2oC: lane 5: 59.5oC; lane 6: 60.7oC; lane 7: 61.6oC; lane 8: 63oC Sau xác định nhiệt độ nồng độ tối ưu, tiến hành chạy phản ứng với chủng vi khuẩn để khẳng định độ nhạy cặp mồi Pec431 (Hình 3.13.) Kết phản ứng có chủng Lelliottia amnigena (LA) xuất band nồng độ cao, kích thước band phù hợp với giả thuyết đưa (khoảng 400bp) Các chủng vi khuẩn khác không xuất band, độ đặc hiệu cặp mồi tương đối cao Có thể sử dụng cặp mồi Pec431 công tác xác định nhanh chủng vi khuẩn L amnigena Ngồi ra, kết hợp nhiều cặp mồi khác để tăng thêm tính đặc hiệu việc xác định tác nhân gây bệnh héo xanh vi khuẩn 25 Hình 3.13 Phản ứng PCR chủng vi khuẩn với cặp mồi Pec431 57oC 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Tính đặc hiệu cặp mồi 759/760 định danh vi khuẩn gây bệnh héo xanh chưa cao - Đã thiết kế cặp mồi để thử nghiệm định danh Lelliottia amnigena phần lớn cặp mồi bắt cặp theo giả thiết đặt Trong đó, cặp mồi Pec431 hiệu sản phẩm PCR có kích thước khoảng 400bp tương ứng với giả thiết đặt - Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng pcr với mồi Pec431: Nồng độ primer 0,5 pmol/µL, nồng độ DNA từ 50-100ng Phản ứng bắt đầu 95oC phút; 30 chu kì với 95oC 30 giây; 57oC 30 giây; 72oC 45 giây cuối 72oC 10 phút Sau sản phẩm bảo quản 4oC Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để sử dụng đoạn mồi Pec431 định danh tác nhân gây bệnh héo xanh 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aley, E., & Elphinstone, J (1995) Culture media for Ralstonia solanacearum isolation, identification and maintenance Fitopatologia, 30, 126–130 Bollet, C., Elkouby, A., Pietri, P and de Micco, P, 1991 Isolation of Enterobacter amnigenus from a heart transplant recipient Eur J Clin Microbiol Infect Dis 10, 1071-1073 Brady, C., Cleenwerck, I., Venter, S., Coutinho, T., & De Vos, P (2013) Taxonomic evaluation of the genus Enterobacter based on multilocus sequence analysis (MLSA): proposal to reclassify E nimipressuralis and E amnigenus into Lelliottia gen nov.as Lelliottia nimipressuralis comb nov and Lelliottia amnigena comb nov., respectively, E gergoviae and E pyrinus into Pluralibacter gen nov.as Pluralibacter gergoviae comb nov and Pluralibacter pyrinus comb nov., respectively, E cowanii, E radicincitans, E oryzae and E arachidis into Kosakonia gen nov.as Systematic and Applied Microbiology, 36(5), 309-319 Chương, H V., Long, Đ T., Hồng, H T K., Lệ, H T., Hiệp, N văn, Vân, H T H., & Thuận, P T (2019) Ứng Dụng Phương Pháp Pcr Để Xác Định Vi Khuẩn Vibrio Parahaemolyticus Gây Bệnh Ở Cá Hue University Journal of Science: Natural Science, 128(1E), 39–46 https://doi.org/10.26459/hueuni-jns.v128i1e.5398 Cuong, M X (2020) Identification phytopathogen causing bacterial wilt on tomato in central vietnam Master's Program in Biochemical Engineering Department Master Thesis Denny, T P (2006) Plant pathogenic Group, 573–644 Dieffenbach, C W., Lowe, T M J., & Dveksler, G S (1993) General concepts for PCR primer design Genome Research, 3(3) https://doi.org/10.1101/gr.3.3.S30 Gavini, F., Mergaert, J., Beji, A., Mielcarek, C., Izard, D., Kersters, K., & De Ley, J (1989) Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen nov as Pantoea agglomerans comb nov and description of Pantoea dispersa sp nov International Journal of Systematic Bacteriology, 39(3), 337–345 https://doi.org/10.1099/00207713-39-3-337 Gohel, V., Chaudhary, T., Vyas, P., & Chhatpar, H S (2004) Isolation and identification of marine chitinolytic bacteria and their potential in antifungal biocontrol Indian Journal of Experimental Biology, 42(7), 715–720 28 Iversen, C., Mullane, N., McCardell, B., Tall, B D., Lehner, A., Fanning, S., Stephan, R., & Joosten, H (2008) Cronobacter gen nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter sakazakii gen nov., comb nov., Cronobacter malonaticus sp nov., Cronobacter turicensis sp nov., Cronobacter muytjensii sp nov., Cro International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58(6), 1442–1447 https://doi.org/10.1099/ijs.0.65577-0 Kang, M J., Lee, M H., Shim, J K., Seo, S T., Shrestha, R., Cho, M S., Hahn, J H., & Park, D S (2007) PCR-based specific detection of Ralstonia solanacearum by amplification of cytochrome c1 signal peptide sequences Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(11), 1765–1771 Lee, Y A., Fan, S C., Chiu, L Y., & Hsia, K C (2001) Isolation of an Insertion Sequence from Ralstonia solanacearum Race and Its Potential Use for Strain Characterization and Detection Applied and Environmental Microbiology, 67(9), 3943–3950 https://doi.org/10.1128/AEM.67.9.3943-3950.2001 Liu, S., & Tang, Y (2016) Identification and Characterization of a New Enterobacter Onion Bulb Decay Caused by Lelliottia amnigena in China Applied Microbiology: Open Access, 2(2) https://doi.org/10.4172/2471-9315.1000114 Middleton K.J and Hayward A.C (1990), “Bacterial wilt of groundnut Proceedings of an ACIAR/ICRISAT collaborative research planing meeting held at Genting Highlands”, Malaysia, March 1990, 58 pp Murugaiyan, J., Krueger, K., Roesler, U., Weinreich, J and Schierack, P., 2015 Assessment of species and antimicrobial resistance among Enterobacteriaceae isolated from mallard duck faeces Environ Monit Assess 187,127 Munz, P., & Leupold, U (1970) Characterization of ICR-170-induced mutations in Schizosaccharomyces pombe Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 9(2), 199–212 https://doi.org/10.1016/00275107(70)90058-8 Nguyen Tat Thang, Do Tan Dung, N V T (2011) Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum smith hại khoai tây vùng Hà Nội - phụ cận biện pháp phịng trừ Tạp Chí Khoa Học Phát Triển, 5, 725–734 Opina, N., Tavner, F., Hollway, G., Wang, J., Li, T., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A., Krishnapillai, V., Hong, W., Holloway, B., & Timmis, J (1997) A novel method for development of species and strain-specific DNA proves and PCR primers for identifying Burkholderia Solanacearum (formerly Pseudomonas 29 Solanacearum) Asia-Pacific Journal of Molecular Biology And Biotechnology, 5(1), 19–30 Pastrik, K H., & Maiss, E (2000) Detection of Ralstonia solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction Journal of Phytopathology, 148(11–12), 619–626 https://doi.org/10.1046/j.1439-0434.2000.00567.x Pavan, M E., Franco, R J., Rodriguez, J M., Gadaleta, P., Abbott, S L., Janda, J M., & Zorzópulos, J (2005) Phylogenetic relationships of the genus Kluyvera: Transfer of Enterobacter intermedius Izard et al 1980 to the genus Kluyvera as Kluyvera intermedia comb nov and reclassification of Kluyvera cochleae as a later synonym of K intermedia International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55(1), 437–442 https://doi.org/10.1099/ijs.0.63071-0 Saghai-Maroof, M A., Soliman, K M., Jorgensen, R A., & Allard, R W (1984) Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(24), 8014–8018 https://doi.org/10.1073/pnas.81.24.8014 Santalucia (1998) A unified view of polymer , dumbbell , and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics 95(February), 1460–1465 Singh, N., T P., Sharma1, P L., Kabyashree, K., Barman, A., Kumar, R., Sonti, R V., Genin, S., & Ray, and S K (2005) An Innovative Root Inoculation Method to Study Ralstonia solanacearum Pathogenicity in Tomato Seedlings 1–51 Thanh, N L (2018) Giới Thiệu kỹ thuật PCR RT-PCR Thủy, L T T., & NGHIÊN (2014) Nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trồng 62420107 Thuy Linh, N T., Tru, N Van, Bich Thuy, L T., Thang, N Van, Van, N T., & Viet, N Van (2016) The linkage of SSR markers with bacterial wilt disease resistance in peanut Tap Chi Sinh Hoc, 38(2), 207–213 https://doi.org/10.15625/08667160/v38n2.6195 Trần Thị Tuyết Hoa (2014) Phát vi khuẩn Vibrio harveyi Streptococcus agalactiae phương pháp pcr khuẩn lạc 1–6 Wang, C., Zhao, D., Qi, G., Mao, Z., Hu, X., Du, B., & Ding, Y (2020) Effects of Bacillus velezensis FKM10 for Promoting the Growth of Malus hupehensis Rehd and Inhibiting Fusarium verticillioides Frontiers in Microbiology, 10, 2889 Wang Hou, 1983 (1983) Studies on the control of the bacterial wilt of peanut 30 Agricultural Science and Technology in Lingyi, 1: 79-84 Yabuuchi, E., Yano, I., Hotta, H., Nishiuchi, Y., & Kosako, Y (1995) Transfer of Two Burkholderia and an Alcaligenes Species to Ralstonia Gen Nov.: Proposal of Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff 1973) Comb Nov., Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Comb Nov and Ralstonia eutropha (Davis 1969) Comb No MICROBIOLOGY and IMMUNOLOGY, https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.1995.tb03275.x 31 39(11), 897–904 ... VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 III 2.2 Phạm vi nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn. .. giúp định danh vi khuẩn L amnigena thời gian ngắn phản ứng PCR có ý nghĩa quan trọng vi? ??c xác định nhanh tác nhân gây bệnh Vì vậy, đề tài: ? ?Nghiên cứu định danh vi khuẩn Lelliottia amnigena phương. .. hóa phân tử vi khuẩn Vibrio sp., ứng dụng phương pháp PCR với cặp mồi 16S-rRNA giải trình tự gen rDNA 16S để xác định vi khuẩn Vibrio sp Kết nghiên cứu cho thấy xác định chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus