Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi thiết kế bằng kỹ thuật PCR
3.4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Chín chủng vi khuẩn được tiến hành tách DNA tổng số bằng dung dịch đệm CTAB 2%. Các mẫu tách chiết đều có DNA tổng số, kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số được trình bày ở hình sau (Hình 3.6.).
Hình 3.6. DNA tổng số các mẫu vi khuẩn
Chất lượng DNA với độ tinh sạch tương đối, một số mẫu còn chứa thành phần RNA hoặc DNA đứt gãy. Tất cả DNA tổng số đã tách chiết đều đủ điều kiện để sử dụng cho các bước tiếp theo.
3.4.2. Phản ứng PCR với mồi 759/760
Cặp mồi này giúp xác định 3 chủng vi khuẩn L. amnigena, R. solanacearum và S.
rubidaea dựa trên sản phẩm PCR xuất hiện độ dài tương đối khoảng 300bp (Hình 3.7.).
Kết quả phản ứng PCR với mồi 759/760 được mô tả bởi (Opina et al., 1997) cho thấy trình tự có kích thước khoảng 280 bp đã được tổng hợp ở các chủng R. solanacearum. Tuy nhiên, cũng nhận thấy các trình tự có kích thước gần tương tự được
tổng hợp ở các chủng L. amnigena (LA); S. rubidaea (SR). Kết quả giải trình tự các sản
phẩm PCR được tổng hợp bằng cặp mồi 759/760 đã xác nhận chính xác các lồi. Như vậy có thể thấy, cặp mồi 759/760 có tính đặc hiệu chưa cao và khó có thể phân biệt được 3 loài , L. amnigena; S. rubidaea, R. solanacearum.
22
Hình 3.7. Phản ứng PCR với cặp mồi 759/760
3.4.3. Phản ứng PCR với 4 cặp mồi thiết kế a. Phản ứng PCR với mồi C167 a. Phản ứng PCR với mồi C167
Từ kết quả phản ứng PCR với cặp mồi C167 (Hình 3.8.), cho thấy 3 chủng L. amnigena (LA); S. rubidaea (SR) và B. velezensis (6) xuất hiện band có kích thước khác
nhau, kích thước tương đối từng chủng theo thứ tự là 800bp; 850bp và 1700bp.
Kích thước sản phẩm của vi khuẩn L. amnigena tương ứng với giả thiết đưa ra. Tuy nhiên độ chênh lệch về kích thước sản phẩm của mẫu LA và SR khơng nhiều.
23
b. Phản ứng PCR với mồi Pec431
Theo kết quả phản ứng PCR của 9 chủng vi khuẩn với cặp mồi Pec431(Hình 3.9.) chỉ có mẫu L. amingena (LA) xuất hiện band có kích thước khoảng 400bp và phù hợp với kích thước sản phẩm của đoạn mồi được dự đốn. Dựa vào đó cho thấy rằng, cặp mồi Pec431 có khả năng định danh được chủng vi khuẩn L. amnigena.
Hình 3.9. Phản ứng PCR với cặp mồi Pec431
c. Phản ứng PCR với mồi C183
Kết quả phản ứng PCR của 9 chủng vi khuẩn với cặp mồi C183 (Hình 3.10.) cho thấy rằng kích thước phù hợp với giả thiết. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của mồi chưa cao. 3 chủng vi khuẩn L. amnigena (LA); Bacillus velezensis (6) và Bacillus sp. (7) cùng một
24
Hình 3.10. Phản ứng PCR với cặp mồi C183
d. Phản ứng PCR với mồi Vrc2
Sản phẩm phản ứng PCR với cặp mồi Vrc2 (Hình 3.11.) của 9 chủng vi khuẩn cho thấy xuất hiện nhiều band khác nhau, trong đó chủng L. amnigena (LA) xuất hiện 2 band, kích thước phù hợp với giả thuyết đưa ra. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của cặp mồi Vrc2 chưa cao. Chiều dài và số lượng band của các mẫu nhiều.
Hình 3.11. Phản ứng PCR với cặp mồi Vrc2