So sánh kỹ thuật dàn mảnh cắt bằng bàn hơ nhiệt với bể nước nóng trong kỹ thuật làm tiêu bản mô bệnh học

ĐẶT VẤN ĐỀ Một xét nghiệm mô bệnh học tiến hành theo chuỗi liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, cố định, pha, chuyển đúc, cắt mảnh, dán mảnh, nhuộm đọc kết Việc lấy bệnh phẩm phẫu thuật, sinh thiết hay bấm qua nội soi…được thực bác sĩ lâm sàng Việc pha bệnh phẩm thành mảnh nhỏ đọc kết mô bệnh học bác sĩ chuyên khoa giải phẫu bệnh đảm nhiệm Cỏc khõu cũn lại, từ mảnh bệnh phẩm sau pha, xử lý qua cỏc khõu kỹ thuật vi thể, làm tiêu mô bệnh học thực labo mô bệnh học kỹ thuật viên mô bệnh học thực Giải phẫu bệnh khoa học tổn thương, phân tích bệnh tật hình thái học chế [1] Vì vậy, để có tiêu đẹp, đạt u cầu cho chẩn đốn ln mục tiêu phấn đấu cho labo mô bệnh học Trong vài thập niên gần đây, với phát triển mạnh khoa học công nghệ, khâu chuỗi liên hồn xét nghiệm mơ bệnh học cú cải tiến mới, thay phải thao tác tay đây, phần lớn cỏc khõu thực máy Công xuất làm tiêu mô bệnh học ngày tăng, đáp ứng đầy đủ yêu cầu nhà lâm sàng Tuy nhiên, giải phẫu bệnh học nói chung kỹ thuật mơ bệnh học nói riêng, có tính đặc thù Với chuyên ngành này, máy móc dự cú tối tân đến đâu thay yếu tố người Để có tiêu đẹp, người kỹ thuật viên mô bệnh học, bên cạnh đôi bàn tay điêu luyện ln phải có hiểu biết tường tận hóa chất, húa-lý tớnh đặc điểm mơ học loại mô phải hiểu rõ tuân thủ đỳng cỏc yêu cầu cỏc khõu kỹ thuật… Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp cử nhân kỹ thuật y học làm kỹ thuật mô bệnh học Chúng lựa chọn đề tài” So sánh kỹ thuật dàn mảnh cắt bàn hơ nhiệt với bể nước nóng kỹ thuật làm tiêu mô bệnh học” với hai mục tiêu là: Thực hoàn chỉnh kỹ thuật làm tiêu nhuộm thường quy Hematoxylin Eosin (H&E) So sánh kỹ thuật dàn/tãi mảnh cắt bàn hơ nhiệt với bể nước nóng q trình làm tiêu mơ bệnh học Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Q trình làm tiêu mơ bệnh học [2] 1.1.1 Lấy bệnh phẩm : Bệnh phẩm làm mô bệnh học lấy bác sĩ lâm sàng chủ yếu gồm loại: bệnh phẩm phẫu thuật( sau cắt bỏ phần hay toàn phần quan thể); Bệnh phẩm lấy sinh thiết mổ; Kim sinh thiết, sinh thiết bấm qua nội soi… Hai yêu cầu trước tiên việc lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng lấy đủ ♦ Lấy trúng Lấy bệnh phẩm trỳng vựng tổn thương cấn xét nghiệm vấn đề không đơn giản thực Ngay trường hợp tổn thương quan sát mắt thường (vết loét , ung thư cổ con, vùng tai, mũi, họng…) sờ nắn dễ dàng (những u hạch nông, u da, ung thư vú nên để xác định vị chí xác vùng sinh thiết việc khó khăn, phải cân nhắc, địi hỏi kinh nghiệm Ngay trường hợp nhìn thấy tổn thương nên lấy bệnh phẩm nhiều vị trí khác lặp lại sinh thiết kết âm tính Tốt lấy bệnh phẩm qua cắt lọc vùng tổn thương cho hoàn chỉnh lần, bệnh phẩm tươi, tổn thương nhỏ khó phân biệt với vùng tổn thương lành mạnh kề bên cố định ♦ Lấy đủ Lấy đủ lấy đủ thành phần, đủ lượng tối thiểu cần cho việc chuẩn đoán Một yêu cầu khác không định hỗ trợ nhiều cho việc chuẩn đốn vừa lấy tổ chức bình thường lẫn tổ chức bệnh sinh thiết, mục đích việc lấy phần lành lẫn phần bệnh để đối chiếu, so sỏnh vùng bình thường với bệnh lý, xác định tính chất xâm lấn tổn thương số trường hợp xác định quan có tổn thương loại bệnh Đối với số tổn thương cú tớnh chất chuyển tiếp có giai đoạn phát triển khác nhau, phải lấy bệnh phẩm vừa vị trí khác vừa thời điểm khác 1.1.2 Cố định ♦ Khái niệm Cố định làm bất động cấu chúc mô tế bào, tôn trọng tới mức tối đa hình thái chúng hay nói cách khác, cố định mơ giết chết thành phần mô bảo quản chúng tình trạng gần lúc sống ♦ Vài nét cố định Một loại thuốc cố định tốt phải đạt yêu cầu sau: - Chống nhiễm trùng - Ngấm nhanh vào mơ, giết nhanh tế bào - Bảo tồn hay làm thay đổi cấu trúc mô tế bào, chống lại tiêu hủy men nội bào, làm cho protein thành axit amin - Những thành phần tế bào cần tìm khơng hịa tan, khơng chịu tác động cỏc khõu kỹ thuật sau mà chuẩn bị tốt cho cỏc khõu kỹ thuật - Không làm cho mô, tế bào thành phần chúng bị méo mó, biến dạng, khơng sinh hình giả tạo - Bảo tồn chức hóa học sẵn có làm bộc lộ chức phận hóa học bị ngụy trang - Tôn trọng số đặc điểm vật lý ♦ Một số nguyên tắc chung cố định - Mọi bệnh phẩm phải cố định sau lấy để trỏnh cỏc men nội bào hoạt động làm cho tế bào thoỏi húa, tan gây tự tiêu hủy - Không làm dập nát bệnh phẩm Tuyệt đối trỏnh dựng kẹp có để kẹp chặt bệnh phẩm, bệnh phẩm tươi Nên cố định bệnh phẩm trước pha sau cố định sơ - Bệnh phẩm không cắt dày Thường từ 3-5 mm vừa, không nên cắt dày quỏ vỡ phần bệnh phẩm không cố định bị tự tiêu hủy thối rữa trước dung dịch cố định ngấm tới - Khơng để mặt bệnh phẩm dính vào lọ đựng Phải đổ dung dịch cố định vào lọ đựng cho bệnh phẩm vào, mặt bệnh phẩm dính vào thành lọ mà khơng cố định dẫn đến bị thối hóa, hoại tử - Đủ dung dịch cố định cần thiết Có yêu cầu : Phải nồng độ Dung dịch cố định phải nồng độ khơng đặc lng quỏ làm cho bệnh phẩm giòn chưa cố định tốt Thể tích dung dịch cố định phải gấp 10 lần thể tích bệnh phẩm - Thời gian cố định thích hợp : Tùy thuộc vào tính chất độ dày bệnh phẩm, vận tốc xuyên thấm, nồng độ dung dịch cố định - Chú ý với trường hợp cố định đặc biệt Glycogen cố định dung dịch Gendre Mỡ cố định dung dịch formol 10% cắt lạnh nhuộm Soudan Khơng có loại dung dịch cố định đa Vì tiến hành nghiên cứu cần tìm hiểu cố định dung dịch 1.1.3 Gửi Xét nghiệm Là công việc khoa lâm sàng bao gồm gửi bệnh phẩm cố định phiếu xét nghiệm với yêu cầu sau : ♦ Bệnh phẩm phải bảo quản nguyên vẹn tình trạng cố định tốt - Lọ đựng phải sạch, chí cần vô trùng để tránh tác động ngoại lai làm ảnh hưởng tới bệnh phẩm (nấm mọc, vi khuẩn từ dụng cụ làm hỏng bệnh phẩm ) - Chất liệu lọ đựng bệnh phẩm thủy tinh chất dẻo - Nút đậy thật kín - Cú dón nhón ngồi ghi vật liệu khơng tan thuốc cố định ghi rõ tên, tuổi, giới số mảng - Khi gửi bệnh phẩm xa cần đặt bệnh phẩm lớp bụng cú tẩm dung dịch cố định đậy nút thật kín ♦ Tránh thất lạc nhầm lẫn Mỗi lọ đựng bệnh phẩm sinh thiết bệnh nhân ♦ Cung cấp thơng tin - Ngồi thơng tin ký hiệu, tên, tuổi, giới bệnh nhân phiếu gửi xét nghiệm phải ghi rõ nơi lấy bệnh phẩm, loại thuốc cố định sử dụng - Nhất thiết phải có sổ lưu để tiện tra cứu, đối chiếu cần thiết 1.1.4 Vùi bệnh phẩm ♦ Mục đích vùi bệnh phẩm Sự cố định giết chết tế bào giữ cho thành phần bất động tình trạng tĩnh Để biết thực chất mối liên quan tế bào mơ cấu tế bào bị biến dạng người ta phải có chất làm cho bệnh phẩm giống khuôn giữ vững cho bệnh phẩm cách thâm nhập vào tế bào giữ cho thành phần tế bào mô không bị thay đổi cắt mảng Đó vùi ♦ Nguyên lý Chất dùng để vùi hay dùng paraffin vỡ cú tính chất Có mật thích hợp dễ ngấm cho phép cắt mảng mà làm thay đổi hình thái tính chất mơ tế bào Loại paraffin thích hợp cho vùi bệnh phẩm loại có nhiệt độ nóng chảy 56-58°C ♦ Vùi paraffin - Khử nước Vì paraffin khơng tan nước nờn khụng ngấm vào mô tế bào bệnh phẩm phải khử nước cồn etylic có nồng độ từ thấp đến cao : 80°C, 95°C, 100°C - Tẩm dung môi trung gian paraffin ( khử cồn) Do paraffin không tan cồn nên phải khử cồn dung môi trung gian có đồng thời có tính năng: Vừa hòa tan cồn hòa tan paraffin Dung dịch trung gian loại cồn có bệnh phẩm, làm tan mỡ làm bệnh phẩm Dung môi trung gian hay dùng toluen xylen - Tẩm paraffin ( khử dung môi trung gian ) Tẩm paraffin thực tốt dung môi trung gian loại bỏ hoàn toàn cách chuyển bệnh phẩm vào cốc có paraffin nóng chảy với độ tinh khiết tăng dần - Đúc bloc hay vùi thực Muốn đúc bloc phải làm cho paraffin xung quanh bên bệnh phẩm đặc lại cách nhất, dùng khuôn kim loại, khuôn láng qua chút glycerin Đổ vào khuôn chất paraffin lọc từ trước, nhúng bệnh phẩm vào chất paraffin lỏng Dùng kẹp hơ nóng để định hướng bệnh phẩm theo ý muốn Chừng 10 giây, chất paraffin lỏng tiếp xúc với khuụn tạo nên màng mỏng bệnh phẩm định hướng Khi lớp vỏ ngồi paraffin đủ (nhưng bloc cịn ấm) nhúng khuôn vào bát đựng đầy nước lạnh ý không làm dạn, vỡ màng mỏng paraffin bên Khoảng 20 đến 30 phút sau, paraffin tồn Khn tách gần tự nhiên sau nguội hoàn toàn rửa bơi glycerin trước ♦ Quy trình chuyển tay • Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày < 2mm - Cồn 90° 15 phút - Cồn 95° 15 phút - Cồn 100°I 15 phút - Cồn 100°II 15 phút - Cồn 100°III 15 phút - Xylen I 15 phút - Xylen II 30 phút - Xylen III 30 phút - Paraffin I 30 phút - Paraffin II 1h - Paraffin III 1h Bệnh phẩm phải lắc liên tục hóa chất phải • Áp dụng cho bệnh phẩm dày 5-8 mm - Cồn 80° 2h - Cồn 90° 6h - Cồn 95° 8h - Cồn 100° I 4h - Côn 100° II 6h - Cồn 100° III 8h - Xylen I 4h - Xylen II 8h - Xylen III 10h - Paraffin I 4h - Paraffin II 6h - Paraffin III 10h ♦ Quy trình chuyển máy • Áp dụng cho mô thông thường - Cồn 80° 1h - Cồn 95° lầnì1h/ lần - Cồn 100° lầnì1h/ lần - Xylen lầnì1h/lần - Paraffin lầnì1h/lần - Paraffin hút chân không 1h - Đúc bloc 1.1.5 Cắt dán mảnh ♦ Dao cắt: Yêu cầu: - Sắc - Không sước mẻ ♦ Một số điều kiện để cắt tốt - Nhiệt độ phòng cắt 25°C - Độ nghiêng lưỡi dao 45° ♦ Cắt mảnh máy cắt mỏng(Microtom) - Cắt khối thành hình thỏp, đỏy hình chữ nhật, để lại khoảng 2-3mm paraffin quanh vật phẩm - Cố định khối bàn gắn máy cắt mỏng - Đặt lưỡi dao vào định hướng khối dao máy cắt mỏng cho thích hợp Bắt đầu cắt với độ dày đến àm tế bào học ♦Tãi mảnh cắt dán - Nhỏ vài giọt nước dung dịch dán lên phiến kính (dung dịch phải làm ướt kính) - Đặt lên dung dịch mảnh cắt hay dải cắt - Đặt phiến kớnh lờn bàn nóng khoảng 50°C theo dõi mảnh cắt tãi ra, mảnh cắt phải dung dịch - Nghiêng phiến kính để nước cách thận trọng - Để khô tiêu theo tư nghiêng (mảnh cắt mặt dưới) 12 nhiệt độ bình thường 20 đến 30 phút tủ ấm nhiệt độ khoảng 45°C, khụ kiệt mảng cắt dính tốt vào phiến kính ♦ Tiêu chuẩn mảnh cắt đạt yêu cầu - Mảnh cắt phải mỏng - Không sước rách - Mảnh cắt có kích thước to gần bệnh phẩm thật - Khơng hơ dón quỏ, cịn ngun khn paraffin - Mảnh cắt phải đặt lam kính 1.1.6 Nhuộm Hematoxylin- Eosin (H&E)[3] - Tiêu tẩy paraffin lần xylen, lần phút - Loại xylen cồn 100°, cồn 95°, 80°, lần phút - Rửa nước chảy phút - Nhuộm nhân dung dịch hematoxylin nhanh từ đến phút - Biệt hóa cồn acid 1% (1ml HCl nguyên chất 100ml cồn 70°) vài giây - Rửa nước chảy phút (kiểm tra kính hiển vi xem nhõn chưa, nhạt nhuộm thêm, sẫm biệt hóa cồn acid rửa nước chảy phút) - Làm xanh dung dịch lithicacbonnat phút - Rửa nước chảy phút - Nhuộm bào tương Eosin từ đến phút - Rửa qua nước 10 Bảng 1: Đánh giá kỹ thuật tiêu nhuộm H&E Đánh giá Không đạt Đạt Khá Tốt Thận 15 30 15 Ruột/ruột 24 25 11 Hạch 43 12 lympho Tổng số 82 67 31 180 45,55% 37,22% 17,23% 0% Loại mơ thừa % Nhận xét: khơng có tiêu đẹp,  Tiêu khơng đạt u cầu : 82/180, chiếm 45,55%  Tiêu đạt yêu cầu: 67/180, chiếm 37,22%  Tiêu đạt loại khá: 31/180, chiếm 17,23% So sánh loại mô xét tiêu mức đạt yêu cầu loại thỡ cú khác biệt rõ rệt:  Mơ thận có 45 số 60 tiêu bản, chiếm 75%;  Mơ ruột có 36/60, chiếm 60% ;  Mô hạch lympho 17/60, chiếm 28,33% 17 Kết đánh giá kỹ thuật dàn/tói mảnh cắt paraffin trình bày bảng đây: Bảng 2: Đỏnh giá kỹ thuật tói/dàn mảnh cắt paraffin bàn hơ nhiệt bể nước nóng Tiêu chí đánh giá Bàn hơ nhiệt Bể nước nóng Độ phẳng mảnh cắt 74 106 Bong/mất phần 54 28 Cặn Albumin Tổng số 149 31 % 277 165 Nhận xét:  Độ phẳng mảnh cắt dùng bàn hơ nhiệt có 74 trường hợp, thấp nhiều so với dùng bể nước núng , cú 106 trường hợp  Việc bong/mất phần, răn gấp nếp mảnh cắt, dùng bàn hơ nhiệt, có 54 trường hợp, cao dùng bể nước nóng, gồm 28 trường hợp  Thường thấy cặn Abumin dùng bàn hơ nhiệt, có 277 trường hợp dùng bể nước nóng, thấp nhiều có 31 trường hợp Tổng số tiêu chí đánh giá cao nhiều so với số lượng tiêu cắt nhuộm (180) tiêu có tiêu chí đánh giá 18 Hình 1: 12N, mơ thận Hình 2: 12K, mơ thận 19 Hình 3: 8K, Ruột thừa × 50 Hình 4: 8N,Ruột thừa × 50 20 .. .mảnh cắt bàn hơ nhiệt với bể nước nóng kỹ thuật làm tiêu mô bệnh học? ?? với hai mục tiêu là: Thực hoàn chỉnh kỹ thuật làm tiêu nhuộm thường quy Hematoxylin Eosin (H&E) So sánh kỹ thuật dàn/ tãi... dàn/ tãi mảnh cắt bàn hơ nhiệt với bể nước nóng q trình làm tiêu mô bệnh học Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình làm tiêu mô bệnh học [2] 1.1.1 Lấy bệnh phẩm : Bệnh phẩm làm mô bệnh học lấy... dỏn mảnh nhuộm 30 bloc Việc cắt mảnh thực Microtom quay tay, dao cắt sử dụng lần, seri Mỗi bloc cắt lấy tiêu Việc tãi mảnh cắt tiến hành song song, mảnh tãi bàn hơ nhiệt, mảnh cắt tãi bể nước nóng