Đề tài: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN ppt

Rượu cần là cách gọi của người Việt đối với loại rượu đặc sản được một số dân tộc thiểu số Việt Nam ủ men trong hũ/bình/ché/chóe/ghè, không qua chưng cất, khi đem rauống phải dùng các cầ

KHOA SINH HỌC

 BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG

QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

CƠ QUAN QUẢN LÝ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

Đà Lạt, tháng 05 năm 2011

KHOA SINH HỌC

 BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN 2011

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG

QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN

Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài : Đỗ Bá Dương

Lớp CSK32 – MSSV: 0810951 Thành viên tham gia – Lớp CSK32:

Mã Phước Huyền Thanh An 0810928

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi Những kết quả và sốliệu nghiên cứu trong báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu khoa học chưa được ai công

bố dưới bất cứ hình thức nào Nhóm chúng tôi sẽ hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhàtrường về lời cam đoan này

Đà Lạt, ngày 20 tháng 05 năm 2011

Người cam đoan

 ThS Nguyễn Khoa Trưởng, giảng viên Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Đà Lạt

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi trong quá trình thực hiện đề tài

 Cảm ơn gia đình, anh chị khóa trước, bạn bè đã giúp đỡ, động viên chúng tôi

Xin chân thành cảm ơn

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân

lập từ quả táo mèo 19Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và tế bào của các chủng nấm men

phân lập từ bánh men lá 20Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởngvà phát triển của nấm

men sau 24h nuôi cấy 21

Bảng 3.4 Khả năng đồng hóa lên men đường saccharose và đường glucose của

các chủng giống đã phân lập 22Bảng 3.5 Số lượng tế bào nấm men sau khi nuôi cấy trong khoảng thời gian

từ 0h – 48h 23

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Biểu đồ sự ảnh hưởng của pH tới số lượng tế bào nấm men sau 24h

nuôi cấy 21Hình 3.2 Biểu đồ đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men tuyển chọn 24Hình 3.3 Quy trình sản xuất rượu cần 25

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về rượu cần 2

1.2 Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu 4

1.3 Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên 5

1.4 Tổng quan nấm men 7

1.4.1 Hình thái và kích thước 7

1.4.2 Cấu tạo của tế bào nấm men 7

1.4.3 Sinh sản của nấm men 9

1.4.3.1 Sinh sản vô tính 9

1.4.3.2 Sinh sản hữu tính 9

1.4.4 Các enzyme của nấm men 10

1.4.5 Những ứng dụng của nấm men 11

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Đối tượng 12

2.1.2 Thời gian và địa điểm 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 12

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 12

2.2.2 Hóa chất 13

2.2.3 Phương pháp phân lập nấm men 13

2.2.4 Phương pháp nhân giống 15

2.2.5 Phương pháp tạo bánh men rượu 15

2.2.6 Phương pháp lên men rượu 16

2.2.7 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men 16

2.2.8 Phương pháp xác định độ cồn 17

2.2.9 Xử lý số liệu 18

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng nấm men phân lập được 19

3.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào từ chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ quả táo mèo 19

3.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào từ chủng nấm men phân lập và tuyển chọn từ bánh men lá 19

3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men 20

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men

20

3.2.2 Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn đường của nấm men 22

3.3 Đường cong sinh trưởng của các chủng nấm men đã tuyển chọn được 23

3.4 Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu cần 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27

Kết luận 27

Kiến nghị 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC 29

MỞ ĐẦU

Việt Nam đang trong bước chuyển mình hội nhập, bên cạnh tiếp thu các thành tựukhoa học tiên tiến, việc bảo tồn, phát huy các truyền thống văn hóa dân tộc càng phảiđược chú trọng Việt Nam có nền văn minh lúa nước lâu đời, các sản phẩm từ nôngnghiệp đã xuất hiện lâu đời và trở thành các giá trị văn hóa ẩm thực cần lưu giữ trong đó

có rượu Trải dài trên đất nước Việt Nam mỗi mảnh đất là một hương vị riêng của rượuhòa quyện trong nét văn hóa bản địa như Rượu Mẫu Sơn – Lạng Sơn, rượu bản Phố - Bắc

Hà, rượu Đao – Yên Bái, rượu cần Tây Bắc, Tây Nguyên… Như chúng ta đã biết, rượucần là một đặc sản văn hóa của các dân tộc thiểu số Việt Nam nói chung và các dân tộcTây Nguyên nói riêng, trong có các dân tộc ở tỉnh Lâm Đồng

Rượu cần là thứ đồ uống quý có trong tất cả các gia đình người Tây Nguyên, dùngtrong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi khách Người dân TâyNguyên cho rằng, rượu của họ là do Giàng (trời) bày cho cách làm, mỗi khi cúng Giànghoặc tế lễ thần linh phải có rượu cần thì lời cầu nguyện mới linh nghiệm Hơn nữa, rượucần được làm khá công phu bằng chất liệu là lương thực - thứ sản phẩm nuôi sống conngười

Tuy nhiên, các giá trị này đang ngày càng mai một, sản phẩm rượu cần đang bịthương mại hóa vì vậy chất lượng rượu đang dần mất đi giá trị truyền thống Để tiếp tụcgóp phần lưu giữ và bảo tồn truyền thống sản xuất rượu cần thì việc nghiên cứu các loàicây và các chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất rượu cần đang được quan tâm Xuất

phát từ những lý do đó nhóm chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “PHÂN LẬP CÁC

CHỦNG NẤM MEN CÓ Ý NGHĨA TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU CẦN”.

Nội dung đề tài:

1 Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men

2 Đánh giá hoạt tính của các chủng nấm men phân lập được

3 Bước đầu xây dựng quy trình sản xuất rượu cần quy mô phòng thí nghiệm

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về rượu cần

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều sản phẩm rượu khác nhau Mỗi quốc gia đều cónhững sản phẩm rượu đặc trưng, Nhật Bản có rượu sake, Hàn Quốc có Soju… Rượuphương đông với nôi văn hóa lớn như Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á hầu hết đượcsản xuất từ nguồn lương thực như các loại ngũ cốc

Rượu vang là sản phẩm nổi tiếng gắn liền với nét văn hóa phương tây thường lênmen không qua chưng cất từ các loại trái cây mà đặc trưng là nho, Đây là sản phẩm nổitiếng của Pháp, Ý Ngoài ra ở phương tây còn có một số sản phẩm truyền thống nổi tiếngnhư: Mezcal (Tequila) của Mexico được làm từ cây Maguey (từ một loài xương rồng) đặctrưng cho Mexico, rượu Whisky là nước uống của nhà tu Ireland

Trên thế giới hiện không ngừng gia tăng về chủng loại rượu, số lương, chất lượngrượu Vì vậy việc giữ gìn và phát triển sản phẩm rượu cần truyền thống của Việt Namđóng vai trò quan trọng trong việc đa dạng hóa sản phẩm rượu trên thế giới

Bên cạnh cây lúa nước là đặc trưng của Việt Nam thì sản phẩm rượu cần cũng đượcnhiều người, nhiều quốc gia biết đến như là sản phẩm truyền thống thứ hai của dân tộcViệt Nam

Rượu cần là cách gọi của người Việt đối với loại rượu đặc sản được một số dân tộc

thiểu số Việt Nam ủ men trong hũ/bình/ché/chóe/ghè, không qua chưng cất, khi đem rauống phải dùng các cần làm bằng tre/trúc đục thông lỗ để hút rượu Rượu cần là đồ uốngquý thường chỉ dùng trong các dịp lễ tế thần linh, những ngày hội làng và dành đãi khách

Từ thời xa xưa, các đồng bào dân tộc thiểu số ở nước ta đã biết lợi dụng các chủng visinh vật trong tự nhiên để thực hiện quá trình lên men rượu tự nhiên không qua chưng cấttạo thành sản phẩm rượu có tên gọi chung là rượu cần Hầu hết các đồng bào dân tộcthiểu số của nước ta đều có nghề làm rượu cần Các đồng bào dân tộc Thái ở Tây Bắc,đồng bào các dân tộc Xê - đăng, Cơ tu, H’Rê… ở miền trung Đặc biệt đặc sắc là rượu

cần của đồng bào các dân tộc thiểu số vùng Tây Nguyên như: Bana, Giarai, Mạ, Stiêng,

K’ho,…

Nguyên liệu làm rượu của đồng bào rất đa dạng từ hạt bo bo, ngô, gạo tẻ, gạo nếp

cho đến củ khoai mì, củ dong Các loài thực vật mà đồng bào sử dụng làm rượu cần cũng

rất đa dạng thay đổi tùy theo đồng bào dân tộc Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu thực vật

để làm men phải vào rừng sâu và quá trình làm rượu mất rất nhiều thời gian, công sức Vìvậy, hiểu biết về làm rượu cần truyền thống ngày càng giảm làm cho tri thức dân giankhông được kế thừa mà dần mất đi bản sắc độc đáo riêng Chính vì thế, việc bảo tồn vănhóa dân tộc, đang rất cần được chú trọng trước khi bị mất hoàn toàn

Mặc dù sản phẩm rượu cần đã được sản xuất từ lâu đời nhưng hiện nay vẫn chưa cónhiều nghiên cứu về rượu cần chỉ có một số nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Huệ (1996),

từ bánh men của người dân tộc K’Ho, Nguyên liệu để làm bánh men là gạo và một số loạicây lá đặc trưng ở mỗi dân tộc như cây đòng và cây me kà zút (tên gọi của người dân tộcK’Ho), đã phân lập được:

- Hai chủng nấm mốc thuộc chi Mucor và Rhizopus Hai chủng này có khả năng

Hiện nay, rượu cần đã được thương phẩm hóa từ lâu với một số hãng sản xuất rượucần nổi tiếng như: Rượu cần Y Miên, Rượu cần Y Pao, Rượu cần Hòa Bình Nhưng thực

tế, trước thời buổi kinh tế thị trường, rượu cần dã bị thay đổi bản chất thực của men lá.Hiện nay các nơi sản xuất rượu cần không sử dụng cây tự nhiên mà sử dụng men công

nghiệp hoặc men thuốc bắc để thay thế làm mất đi hương vị và làm giảm chất lượng sảnphẩm Quá trình làm rượu diễn ra nhanh nhưng rượu không ngon, không đậm đà và có vịchua nhiều Trong khi đó, rượu cần truyền thống có vị ngọt, độ cồn nhẹ, giàu dinh dưỡng,không gây phản ứng phụ.

Như vậy, với nguồn tài nguyên thực vật làm rượu cần phong phú, kinh nghiệm sảnxuất rượu lâu đời của đồng bào dân tộc Tây nguyên và nhu cầu sử dụng rượu ngày càngcao chúng ta cần phải tiếp tục có những nghiên cứu để phát triển bền vững nghề sản xuấtrượu cần ở địa phương

1.2 Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu

Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4kJCác phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, nó phải trải qua 10 phươngtrình phản ứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzyme xúc tác, kết quả cho rarượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác

Nấm men là cơ thể hiếu khí, chúng hô hấp như cơ thể bậc cao, khi trong môi trườnghết oxy phân tử (oxy không khí hòa tan trong môi trường lên men), chúng mới tiến hànhlên men, tức là chuyển sang hô hấp kỵ khí

Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn như glucose, fructose sẽ được phân giảitheo con đường EMP và chu trình axit tricacboxylic (ATC) lúc đầu được thực hiện, tiếptheo là chuỗi hô hấp hoạt động, nấm men thu nhiều năng lượng, sinh khối dịch lên mentang Môi trường sẽ dần chuyển sang lên men, sau đó sản phẩm sẽ hình thành Etanol,CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và sản phẩm phụ như Glyserin

Quá trình lên men rượu có 5 quá trình chủ yếu:

 Biến đồi glucose thành fructose-1,6-phosphate

 Biến đổi fructose-1,6-phosphate thành 3-phospho glyceraldehyde vàphosphodioxy-acetone

 Biến đổi phosphodioxy-acetone thành 2- phospho glycerate rồi thành axitpyruvic

 Axit pyruvic bị loại 1 phân tử CO2 để thành acetaldehyde.

 Hình thành etanol do acetaldehyde lấy hydro từ NADH

1.3 Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên

Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu cần tự nhiên là nấm men, nấm mốc cósẵn từ các bánh men Vì vậy bánh men có tính địa phương và không thuần khiết, nhưngnói chung hệ vi sinh vật ở đây thường là:

 Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A flavus, A awamorii, A usami, A niger (giống Aspergillus chiếm phần lớn), Mucor (M Circinilloides), Rhizopus, Penicillium và

Amylomyces rouxii Nấm mốc sinh enzyme amylaza đường hóa tinh bột.

 Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae Ngoài ra còn thấy có

Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida những men này coi như là men dại,

men tạp có lẫn trong bánh men và chúng ta không mong muốn Nấm men rượu chuyểnhóa đường thành rượu

Trong bánh men ta còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger Giống

Endomycopsis tương tự như nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh

glucoamylaza và thủy phân tinh bột thành đường glucoza Vì vậy trong nghề làm rượu

người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh bột.

 Vi khuẩn: thường thấy có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic Nói chung, vikhuẩn có mặt ở đây đều là vi khuẩn tạp nhiễm, ta không mong muốn

Các giống nấm mốc Aspergillus, Mucor và Rhizopus đóng vai trò sinh enzyme

amylaza đường hóa tinh bột Khi đường hóa hệ enzyme trong nấm mốc thường ít amylaza và nhiều β-amylaza, vì vậy đường tạo thành chủ yếu là maltoza và các dextrincuối (cũng có thể lên men được)

α-Một số chủng nấm mốc thuộc loài Aspergillus awamorii, A usami sinh ra nhiều

glucoamylaza, khi đường hóa cho sản phẩm là glucoza Hai loài này sinh bào tử có màu

đen nhìn thấy bằng mắt thường như các đầu kim nhỏ Về hình thức A awamorii và A.

usami khá giống nhau, chúng thường có mặt trong bánh men.

Aspergillus oryzae và A flavus cũng rất giống nhau, sinh bào tử khi già có màu vàng

hoa cau, vì vậy chúng được gọi là mốc vàng hoa cau Chúng có khả năng sinh enzymeamylaza và proteaza Trong nghề làm tương, làm xì dầu và làm rượu rất hay gặp các mốcvàng

Aspergillus niger, bào tử thương đối lớn và rất đen, được gọi là mốc đen, có khả

năng sinh ra nhiều enzyme amylaza, nhưng đồng thời có thể tạo ra acid citric từ dịchđường Vì vậy người ta cũng không mong muốn sự có mặt của mốc này trong bánh men,nhưng đây là một điều khó khăn vì mốc này rất phổ biến trong tự nhiên

Việc sử dụng mốc vàng hoa cau trong nghề làm tương, nước chấm xì dầu và trong

nghề làm rượu cũng cần lưu ý: A flavus có khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza

dùng để thủy phân tinh bột thành đường, thủy phân protein thành peptide và acid amin,

nó còn sinh ra độc tố aflatoxin khi môi trường nuôi cấy có chất béo Độc tố này ảnhhưởng nhiều tới gan

Mucor và Rhizopus có hình dạng rất giống nhau, chỉ khác nhau phần hệ sợi cơ chất.

Trong nghề làm rượu rất gặp hai giống này, đặc biệt là Mucor rouxii, M mucedo, M.

japanicus ở nước ta hay gặp M rouxii (phát triển tốt trên môi trường czapek và trên

gạo)

Một số chủng Mucor có khả năng sinh tổng hợp hai hệ enzyme diastaza (amylaza)

đường hóa tinh bột và zymaza lên men rượu từ đường Vì vậy chúng có thể lên men trực

tiếp từ tinh bột thành rượu Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số loài khác và được

dùng nhiều trong men rượu

Hơn nữa khi có mặt Rhizopus và Mucor lên men rượu có mùi thơm rất dễ chịu Cơ

chế của mùi thơm ở đây của hai mốc này như thế nào đến nay hoàn toàn chưa rõ

Penicilium là mốc sinh bào tử có màu xanh thường gọi là mốc xanh Tuy nó có khả

năng sinh ra hệ enzyme đường hóa mạnh, nhưng nó thường cho mùi vị mốc rất khó chịunhư nhiều mốc khác Nhưng mốc sinh “mùi đặc trưng” của mốc thường không được hoannghênh trong nghề chế biến thực phẩm

Giống Endomycopsis được gọi là giả nấm men Khi trưởng thành có hệ sợi giả cùng

với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phấn hoặc bào tử phân đôi bằng vách ngăn hoặc nảy

chồi ở nhiều phía Endomycopsis có khả năng sinh nhiều glucoamylaza và đặc biệt trong

hệ enzyme do giống này sinh ra ưu việt hơn nấm mốc là có ít enzyme transglucosidaza

Có mặt enzyme này một phần glucoza chuyển thành acid glconic Hơn nữa, enzyme lấy

từ chế phẩm nuôi Endomycopsis không có mùi mốc làm cho hương vị của rượu thành

phẩm thơm ngon

Nấm men có trong bánh men chủ yếu là men rượu Saccharomyces cerevisiae Ngoài

men rượu ra thì các giống men khác có trong bánh men đều coi là men dại Phần dướibánh men thường lót trấu, tạo điều kiện thoáng khí

1.4 Tổng quan nấm men

1.4.1 Hình thái và kích thước

Nấm men thường có hình trứng hay hình bầu dục Kích thước thay đổi từ 21µm, do đó có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học Để quan sát hình thái nấmmen và đo được kích thước người ta thường sử dụng môi trường thạch, mạch nha dịch thểvới nồng độ đường là 10-15 baling, hoặc môi trường thạch, mạch nha, thời gian nuôi cấy

2,5μm-m-3 ngày, nhiệt độ là 25-2,5μm-m-300C

1.4.2 Cấu tạo của tế bào nấm men

gian nuôi cấy mà vách tế bào nấm men dày lên, vách tế bào nấm men dày khoảng 25nm(chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào) Đa số nấm men có vách tế bào cấu tạo bởiglucan và mannan Một số loại nấm men có vách tế bào cấu tạo bởi mannan và kitin,phần còn lại chứa 10% protein (tính theo trọng lượng cơ thể) Một ít lipid, đôi khi có càpoliphosphat, enzyme, sắc tố và một số ion vô cơ

cấu tạo chủ yếu là protein chứa 50% trọng lượng khô Chức năng màng giống như màngnguyên sinh chất của vi khuẩn Thông qua màng nguyên sinh chất mà thực bào cũng nhưthải bỏ các sản phẩm trao đổi chất

 Tế bào chất: tế bào chất nấm men là hệ keo bán lỏng chứa các loại protein, axit

amin, ARN, glucid, lipid và các loại hạt nucleotid chứa 42% ARN và 50% protit, và cácloại hợp chất phân tử nhỏ, chứa các cơ quan con, các vật thể và các chất dự trữ khác

và điều kiện nuôi cấy Có 2 loại ribosome là loại 70S và 80S

Ty thể gồm 2 lớp là màng trong và màng ngoài Màng trong có hình lượn sóng hay hìnhrăng lược Để tăng thêm diện tích tiếp xúc, giữa hai màng có các hạt nhỏ gọi là hạt cơbản, bên trong ty thể là chất dịch hữu cơ Màng ngoài của tế bào nấm men khác với màng

ty thể là màng ty thể có rất nhiều đơn vị, hình thái dạng nấm và mũ nấm có đường kínhkhoảng 80-100A Màng ngoài của ty thể có chứa các loại enzyme của chuỗi hô hấp,enzyme phosphorin hóa, và trên đó cư trú một số men không có trong màng trong nhưmono aminoxydaza, NAD-xytocrom, C-seductase

Trong ty thể người ta tìm thấy tất cả các yếu tố của hệ thống tổng hợp protein Người

ta tách ra từ cơ quan này các loại ribosome “VK” Tức là những hạt ribosome 70s củaribosome này cũng giống như ARN, thông tin của ty thể được tổng hợp dưới sự kiểm soátcủa ADN ty thể ADN của ty thể nấm men là ADN dạng vòng, có khối lượng phân tử là50x60 Ra, gấp 5 lần so với động vật bậc cao ADN ty thể nấm men chiếm 15-23% tổnglượng ADN của toàn tế bào nấm men Có một loại plasmid được phát hiện năm 1967 ởnấm men Saccharomyces cerevisiae được gọi là YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo) Ty thểđược coi là trạm năng lượng của tế bào nấm men

Nó tham gia thực hiện các phản ứng oxy hóa giải phóng năng lượng ra khỏi cơ chấtlàm cho năng lượng được tích lũy dưới dạng ATP, giải phóng năng lượng ATP và chuyểnhóa năng lượng đó thành năng lượng có ích cho hoạt động sống của tế bào

Ngoài ra ty thể còn chứa nhiều loại enzyme khác như: oxidase, xitocromoxidase,peoxydase…

Không bào có chứa enzyme thủy phân, polyphosphate, lipid, ion kim loại, các phẩmtrao đổi chất, điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men Ngoài

ra còn chứa các hạt dự trữ tinh bột khác như: hạt lipid dưới dạng các hạt nhỏ, các hạtglucogen, một ít hạt tinh bột

và ổn định, có khả năng biểu hiện của tế bào tiến hóa, đó là sự phân chia tế bào theo hìnhthức giảm phân

Màng nhân của tế bào nấm men có cấu trúc hai lớp và có lỗ thủng Nhân của tế bàonấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 14 cặp nhiễm sắc thể ADN trong nhân tếbào nấm men đơn bội có trọng lượng phân tử 4x10 Da (Dalton)

1.4.3 Sinh sản của nấm men

1.4.3.1 Sinh sản vô tính

 Sinh sản bằng phương pháp nảy chồi

Phương pháp nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến của nấm men Khi nấm mentrưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi sẽ lớn dần lên, một phần nhân của tế bào mẹđược chuyển sang chồi sau đó tách ra một nhân mới rồi hình thành vách ngăn để ngăncách với tế bào mẹ hoặc đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới Hình thànhsinh sản này xảy ra đối với tất cả nấm men

Sinh sản bằng phân cắt: một số ít nấm men như Sporobolomyces sinh sản bằngphương pháp cắt ngang như vi khuẩn, tế bào dài ra rồi sau đó sinh ra những vách ngănđặc biệt và phân cắt thành nhiều tế bào

 Sinh sản bằng bào tử

Bào tử đốt: ở chi Geotrichum

Bào tử bắn: ở chi Sporobolomyces

Bào tử áo: ở nấm Candida albicans

1.4.3.2 Sinh sản hữu tính

Tế bào nấm men có thể sinh sản bằng nang hay túi bào tử, trong mỗi túi có 2-4 hoặc 8bào tử Túi bào tử được sinh ra do sự tiếp hợp của hai tế bào nấm men.

Khi tê bào khác giới đứng gần nhau, ở mỗi đầu của hai tế bào sẽ hình thành mấu lồi vàtiến sát nhau, hai tế bào sẽ tiếp hợp với nhau và hình thành một hợp tử, sau đó sẽ có quátrinh phân phối nguyên sinh chất và nhân Nhân của hợp tử phân chia thành 2,4,8 nhânmới, mỗi nhân con cùng với một phần nguyên sinh chất tạo thành một túi bào tử Túi bào

tử gặp điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một tế bào nấm men mới

1.4.3.3 Các enzyme của nấm men

Để sinh trưởng và phát triển, nấm men phải sử dụng enzyme phân giải các nguồn dinhdưỡng phức tạp như tinh bột, rỉ đường, dầu mỏ… thành đường và chuyển hóa vào trong

cơ thể dưới dạng cacbon và năng lượng duy trì sự sống, đồng thời tạo ra sản phẩm sinhhọc trong sản xuất

 Enzyme Protease

Protease là một nhóm enzyme gồm hai loại peptidase và proteinase, chúng phân hủycác liên kết phân tử protein thành polypeptide, pepton Sau đó peptide phân tử nhỏ nàythủy phân thành các acid amin tự do có dưới tác dụng của peptidase Các peptidase cóđặc hiệu hơn proteinase, chúng chỉ tác dụng lên peptide ở những vị trí nhất định

 Enzyme Amylase

Là hệ enzyme được chiết ra sớm nhất và được nghiên cứu nhiều từ trước đến nay.Amylase được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp và trong y học để tạo rađường glucose, dextrin thực phẩm, thành phần bổ sung vào khẩu phần thức ăn trong chănnuôi, các thuốc hỗ trợ tiêu hóa, thủy phân đường để lên men sản xuất mì chính và các sảnphẩm khác

Amylase thuộc nhóm enzyme hydrolase xúc tác thủy phân lên kết glucoside trong tinhbột và các sản phẩm tạo thành mà người ta chia nhóm thủy phân tinh bột ra làm nhiềuloại, trong đó có ba loại enzyme phổ biến:

 α-amylase (α-1,4glucan, 4-glucanhydrogenase)

 β-amylase (α-1,4glucan maltohydrolase)

 Gluco-amylase (γ-amylase)

Các enzyme khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng đối với liên kết glucoside và một sốtính chất khác Tùy thuộc vào mục đích thành phần mà người ta có thể sử dụng các loạienzyme khác nhau

1.4.4 Những ứng dụng của nấm men

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có khả năng sinh trưởng và phát triểnnhanh, các đặc điểm sinh lý phù hợp với sản xuất công nghiệp Trong tế bào nấm menchứa hầu hết các sản phẩm cần cho sự sống (protein, glucide, lipid, enzyme và cácvitamine, các acid nucleid, các chất khoáng) Từ những đặc điểm trên nấm men có rấtnhiều vai trò và được ứng dụng rộng rãi trong tất cả các lĩnh vực của đời sống

Nhiều loại nấm men được sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, sản xuất cồn, glicerine

và điều chế một số hóa chất khác

Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng chứa nhiều protein và vitamine

Vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn cho người vàgia súc Nấm men được sử dụng làm nở bột mì, gây hương vị nước chấm, sản xuất một sốdược phẩm

Tuy nhiên bên cạnh những nấm men có ích còn có những nấm men có hại cho người

và gia súc, hoặc có thể làm hư hỏng lương thực, thực phẩm

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

Các chủng nấm men phân lập được từ quả táo mèo (Docynia indica) và bánh men lá

của người dân tộc Churu

2.1.2 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ 11/2011 – 05/2011 tại phòng thí nghiệm vi sinh – Khoa Sinhhọc, trường Đại học Đà Lạt

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị

 Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri

 Tủ cấy, que cấy, đèn cồn, dao cắt (loại nhỏ), kéo

 Máy đo pH, giấy quỳ tím

 Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy báo,vòng thun

 Túi dựng mẫu

 Thuốc nhuộm Xanh methylene

 Thuốc nhuộm Fuchsin

 Cồn 900, cồn 700, cồn 330

2.2.3 Phương pháp phân lập nấm men

2.2.3.1 Môi trường phân lập nấm men

Môi trường Hansen (xem phần phụ lục)

2.2.3.2 Phân lập mẫu

Lấy một ít mẫu quả táo mèo, mẫu bánh men rượu cần của người dân tộc Churu nghiềnnhỏ Hòa loãng mẫu trong nước muối sinh lý theo thang bậc 10

Các bước pha loãng mẫu:

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa sẵn 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự,hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm thứ 1 thu được dung dịch có độ pha loãng là 10-1 Hút1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2 thu được dung dịch có độpha loãng 10-2 Cứ tiếp tục hút 1 ml dung dịch ở độ pha loãng trước cho vào 9ml nướcmuối sinh lý ta được dung dịch có độ pha loãng cao hơn Đảo trộn dung dịch nhiều lầnbằng micropipet trước khi hút để đồng nhất mẫu

Sau đó cấy ria trên mặt thạch môi trường Hansen trong tủ cấy vô trùng rồi đem nuôicấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C.

Sau thời gian từ 24 – 72 giờ các khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên mặt thạch Sau đótiến hành tách các khuẩn lạc khác nhau cấy truyền sang đĩa thạch petri khác tạo giốngthuần chủng

Giống thuần được cấy giữ giống trong thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh Các thaotác luôn được đảm bảo vô trùng

2.2.3.3 Phương pháp phân loại nấm men

Phân loại nấm men dựa theo các đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm tế bào và sinh hóa củachủng giống Sử dụng khóa phân loại nấm men đến giống của Kudriavtxev, 1954

2.2.3.4 Quan sát hình thái khuẩn lạc

Mô tả hình thái, kích thước, màu sắc, tính chất của khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩaphân lập

2.2.3.5 Quan sát hình thái tế bào, cách thức sinh sản của nấm men

Làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm Xanh methylene 0,1% , mẫu là chủng giống đãphân lập được nuôi cấy trong môi trường Hansen lỏng sau khoảng thời gian 20 – 24 giờ.Quan sát trên kính hiển vi

2.2.3.6 Xác định bào tử của nấm men

a Nuôi cấy tạo bào tử

Từ ống giống lỏng sau 24 giờ nuôi cấy, cấy giống trên môi trường thạch tạo bào tử.Môi trường tạo bào tử nấm men (xem phần phụ lục)

Mẫu cấy được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C trong 2 ngày, sau đó đem sốc nhiệt ởnhiệt độ 400C trong 18 giờ

b Nhuộm và quan sát bào tử nấm men

 Các dung dịch thuốc nhuộm

 Thuốc nhuộm Fuchsin

 Thuốc nhuộm Xanh methylene

 Cách làm tiêu bản nhuộm bào tử nấm men

Cố định vết bôi: chuẩn bị vết bôi của nấm men trên lam kính, hơ nóng nhẹ để cố địnhvết bôi (cố định bằng nhiệt)

Nhuộm Fuchsin: đặt phiến kính lên thanh đỡ ngang trên cốc đong có chứa nước đangsôi Đậy lên vết bôi một mẫu giấy thấm có kích thước vừa với phiến kính Phủ thuốcnhuộm Fuchsin lên phiến kính Để yên 5 phút

Lấy mẫu giấy ra, rửa thuốc nhuộm dư bằng nước và khử màu vết bôi bằng dung dịchcồn 330C hoặc H2SO4 1 % trong khoảng thời gian 1 phút sau đó rửa lại bằng nước trong 5giây

Nhuộm với Xanh methylene trong vòng 30 – 45 giây

Rửa lại với nước, thấm khô vết bôi nhẹ nhàng với giấy thấm rồi quan sát dưới vậtkính dầu của kính hiển vi

Bào tử sẽ bắt màu đỏ, còn tế bào sẽ bắt màu xanh

2.2.4 Phương pháp nhân giống

Chuẩn bị môi trường nhân giống là môi trường Hansen lỏng (xem phần phụ lục), chovào các bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình 100 ml môi trường Sau đó đem hấp khửtrùng

Dùng que cấy lấy một vòng que cấy nấm men đã phân lập được trong ống thạchnghiêng cho vào trong bình tam giác nhân giống đã chuẩn bị, khuấy cho tan Thao tácđược thực hiện trong tủ cấy vô trùng Sau đó đem đi nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở điềukiện nhiệt độ 290C, tốc độ lắc 100 vòng/ phút

Tiến hành nuôi cấy trong 24 giờ

2.2.5 Phương pháp tạo bánh men rượu

Nguyên liệu: Gạo lức, rễ cây ”đoòng”, rễ cây vấn vương, thân cây gối hạc.

Dụng cụ: Dao, cối giã, khay đựng.

Phương pháp: