Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High Performance Liquid Chromatography ) docx

Phần I : Cơ sở lý thuyết • HPLC ch ữ vi ết t c 04 ch ữ đầu b ằng ti ếng Anh c ph ương pháp s ắc k ý l ỏng hi ệu n ăng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,tr ước g ọi ph ương pháp s ắc k ý l ỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) • Ph ương pháp đời t n ăm 1967-1968 c s phát tri ể n c ải ti ến t ph ương pháp s ắc k ý c ột c ổ ển Hi ện ph ương pháp HPLC ngày phát tri ển hi ện đại hoá cao nh s ự phát tri ển nhanh chón g c ngành ch ế t ạo máy phân tíc h Hi ện áp d ụng r ất l ớn nhi ều nghành ki ểm nghi ệm đặc bi ệt ứng d ụng cho nghành ki ểm nghi ệm Thu ốc Và hi ện côn g c ụ đắc l ực phân tíc h thu ốc đa thành ph ần cho phép định tín h định l ượng Phần I : Cơ sở lý thuyết - Khái ni ệm : S ắc k ý l ỏng hi ệu n ăng cao m ộ ph ươ pháp chia tách t ng pha động chât l ỏng pha t ĩnh ch ứ c ộ ch ấ r ắ a t t n phân chia d ưới d ạng ti ểu phân ho ặc m ột ch ất l ỏng ph ủ lên m ột ch ất mang r ắn ,hay m ột ch ất mang đượ bi ến đổi b ằng liên k ết c hoá h ọc v ới nhóm ch ứ h ữu c Q trìn h s ắc k ý l ỏng d ự c c a ch ế h ấp ph ụ,phân b ố ,trao đổi Ion hay phân lo ại theo kíc h c ỡ ( Rây phân t ) 2- Nguyên t ắc c trìn h s ắc k ý c ột : Pha t ĩnh m ột y ếu t ố quan tr ọng quy ết định b ản ch ất c trìn h s ắc k ý l ọai s ắc k ý N ếu pha t ĩnh ch ất h ấp ph ụ ta có S ắc k ý h ấp ph ụ pha thu ận ho ặc pha đảo N ếu pha t ĩnh ch ất trao đổi Ion ta có S ắc k ý trao đổ ion i N ếu pha t ĩnh ch ất L ỏng ta có S ắc k ý phân b ố hay s ắc k ý chi ết Phần I : Cơ sở lý thuyết N ếu pha t ĩnh Gel ta có S ắc k ý Gel hay Rây phân t • Cùn g v ới pha t ĩnh để r ửa r ải ch ất phân tíc h kh ỏi c ột ,chún g ta c ần có m ột pha độ ng • Nh v ậy n ếu chún g ta n ạp m ẫu phân tíc h g ồm h ỗn h ợp ch ất phân tíc h A,B,C Vào c ột phân tíc h ,k ết qu ả ch ất A,B,C S ẽ đượ c tách kh ỏi sau qua c ột Quy ết đị nh hi ệu qu ả c s ự tách s ắc k ý t h ợp t ương tác Chất phân tích A +B+C F1 Pha tĩnh F2 F3 Pha động Phần I : Cơ sở lý thuyết • T c 03 t ương tác s ẽ quy ết định ch ất r ửa r ải kh ỏi c ột tr ước tiên l ực l ưu gi ữ c ột nh ỏ nh ất ( F1) ng ược l ại • Đối v ới m ỗi ch ất ,s ự l ưu gi ữ qui định b ởi 03 l ực F1,F2,F3 Trong F1 F2 gi ữ vai trò quy ết định F3 y ếu t ố ảnh h ưởng khôn g l ớn • Ởđ F1 l ự gi ữ ch ấ phân tíc h c ộ F2 l ự kéo ây c t t c c pha động đối v ới ch ất phân tíc h kh ỏi c ột • Nh v ậy v ới ch ất khác F1 F2 khác ,K ết qu ả ch ất khác s ẽ di chuy ển c ột v ới t ốc độ khác tách kh ỏi kh ỏi c ột ( nh hìn h d ưới ) Phần I : Cơ sở lý thuyết Phần minh hoạ trình tách chất A B cột tách sắc ký Pha động Thời gian A B Phần I : Cơ sở lý thuyết - Phân lo ại s ắc k ý : Theo c ch ế tách s ắc k ý ng ười ta phân loai nh sau : 3.1 S ắc k ý h ấp ph ụ : Quá trìn h s ắc k ý d ựa s ự h ấp ph ụ m ạnh ,y ếu khác c ủ pha t ĩnh a đối v ới ch ất tan s ự r ửa gi ải ( ph ản h ấp ph ụ ) c ủ pha độ để kéo a ng ch ất tan kh ỏi c ột S ự tách m ột h ỗn h ợp ph ụ thu ộc vào tín h ch ất động h ọc c ch ất h ấp ph ụ Trong tr ường lo ại có 02 lo ại h ấp ph ụ : + S ắc k ý h ấp ph ụ pha thu ận ( NP - HPLC) : Pha t ĩnh phân c ự ,pha c động khôn g phân c ực + S ắc k ý h ấp ph ụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha t ĩnh khôn g phân c ự c ,pha động phân c ực Lo ại s ắc k ý áp d ụng r ất thành côn g để tách h ỗn h ợp ch ất có tín h ch ất g ần t ương t ự thu ộc lo ại khôn g phân c ực,phân c ực y ếu hay trung bìn h nh Vitamin,thu ốc h nhi ệt gi ảm đau Hi ện chún g ta s d ụng ch ỉ có lo ại s ắc k ý mà Phần I : Cơ sở lý thuyết • Ch ủ y ếu hi ện chún g ta s d ụng l ọai s ắc k ý h ấp ph ụ pha đả o ( RP ) • Trong d ượ c ển USP chún g ta tra c ứu c ột có giá tr ị t ươ ng ứng nh sau : • • • • L1 : RP 18 L7 : RP L3 : Si 60 Và m ột s ố vv Kíc h th ướ c h ạt t ươ ng ứng t - 10 µm Kíc h th ướ c h ạt t ươ ng ứng t - 10 µm Kíc h th ướ c h ạt t ươ ng ứng t - 10 µm loai c ột khác nh c ột Diol , C ột NH2,CN Phần I : Cơ sở lý thuyết - Các đạ i l ượ ng đặ c tr ưng c s ắc k ý đồ Kết trình tách chất Detector phát ghi thành sắc ký đồ hình Phần I : Cơ sở lý thuyết To : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 : Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B tr2 tr1 t’r1 to t’r2 Phần I : Cơ sở lý thuyết T thôn g s ố c peak ,nhi ều đạ l ượ đặ tr v ề l ý i ng c ng thuy ết đưa để đánh giá m ột trìn h s ắc k ý D ưới m ột s ố đại l ượng th ường dùn g th ực t ế cách thay đổi đại l ượ có ng l cho q trìn h phân tíc h s ắc k ý 4.1 Th ời gian l ưu th ực t’r : Retention time Th ời gian l ưu c m ột ch ất th ời gian tín h t b ơm m ẫu vào c ột ch ất kh ỏi c ột đạt giá tr ị c ực đại Th ời gian l ưu c m ỗi ch ất h ằng định ch ất khác th i gian l ưu s ẽ khác cùn g m ột ều ki ện s ắc k ý ch ọn Vì v ậ th y i gian l ưu đại l ượng để phát hi ện định tín h ch ất Th ời gian l ưu ph ụ thu ộc vào y ếu t ố : + B ản ch ất s ắc k ý c pha t ĩnh + B ản ch ất ,thành ph ần,t ốc độ c pha động + C ấu t ạo b ản ch ất phân t c ch ất tan + Trong m ột s ố tr ường h ợp th ời gian l ưu ph ụ thu ộc vào pH c pha động Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký C ột pha thu ận ( NP) : Silicagel trung tính Pha t ĩnh : Cột loại cột dùng để tách chất không phân cực hay phân cực Trên bề mặt hoạt động có chứa nhóm OH phân cực ưa nước Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60 Cấu tạo cột sau : OH OH OH - O - Si - O - Si - O - Si - O OH OH OH Pha động : dùng cho loai dung môi không phân cực hay phân cực : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.1 : Lựa chọn pha tĩnh Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel Alkyl hóa ) Dùng để tách chất khơng phân cực ,ít phân cực ,các chất phân cực tạo cặp Ion Trên bề mặt hoạt động nhóm OH bị Alkyl hóa tức thay nguyên tử H mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP hay RP 18) hay mạch Carbon vịng( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) phân cực hay phân cực Ví dụ cột Lichrosor -Lichrospher RP ODS , Cột Nucleosil C18 Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký Pha Động : Pha động dùng loại dung mơi có phân cực :Methanol ,Acetonitril,,nước hay loại dung dịch đệm ,hỗn hợp dung môi-đệm Sự tách chất nhồi loại cột có độ lặp lại cao ứng dụng chủ yếu phân tích Dược phẩm Hiện sử dụng loại chủ yếu Hiện pha tĩnh Silicagel có hàng trăm chất khác tùy thuộc vào nhóm ngun tử H ,ngồi cịn có lọai pha tĩnh Oxid Nhơm,trên chất hữu cao phân tử,trên mạch bon Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký III.2 : Lựa chọn pha động - Dựa vào tài liệu ,Dược điển ,thành phần tính chất chất có mẫu phân tích .ta lựa chọn pha động phù hợp trình rửa giải tách hồn tồn chất có mẫu đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn peak trình bày đồng thời phải có thời gian phân tich phù hợp nhằm tiết kiệm dung mơi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu hoạt động thiết bị - Pha động làm thay đổi : + Độ chọn lọc α + Thời gian lưu Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký - Pha động làm thay đổi : + Hiệu tách cột + Độ phân giải + Tính đối xứng Peak Do ,Trong pha tĩnh chọn ta chọn pha động có thành phần phù hợp ta có hiệu suất tách sắc ký tốt hỗn hợp chất cần phân tích Chính pha động cần có cầu u cầu sau : + Pha động phải trơ với pha tĩnh có Khơng làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( vd giá trị pH : 2.5< pH