LUẬN văn THẠC sĩ bước đầu thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA từ đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge)

TỔNG QUAN

Tổng quan về thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), chuẩn đối chiếu là bất kỳ nguyên liệu đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/hoạt lực Một chuẩn đối chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục chính thức của Dược điển Anh (BP) hoặc Dược điển Mỹ (USP) hoặc của WHO Có thể thiết lập một chuẩn đối chiếu cơ sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/hoạt lực với một chuẩn đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuẩn đối chiếu tùy theo mục đích sử dụng (dùng để định tính hay định lượng) và bản chất phương pháp định lượng

Các phương pháp phân tích trong Dược điển hiện tại mà có thể đòi hỏi việc sử dụng các chất chuẩn đối chiếu là : Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phương pháp sắc ký, các kỹ thuật tách khác, chuẩn độ thể tích, khảo nghiệm dựa trên góc quay cực, xét nghiệm vi sinh, các kiểm tra liên quan tới hóa học miễn dịch, hiệu chuẩn các dụng cụ [6]

Quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu

- Mua vật liệu với một lượng lớn Nên lựa chọn vật liệu có chất lượng tốt từ quá trình sản xuất, lượng thay đổi từ 20 g đến 500 g tùy thuộc vào nhu cầu dự kiến

- Đánh giá sơ bộ Xác nhận danh tính, độ tinh khiết, hàm lượng bằng các kĩ thuật như: HPLC, sắc ký lớp mỏng và phương pháp hóa lý khác như phổ NMR, MS hoặc phối hợp các phương pháp

- Phân tích protocol Đối với việc xác định chất:

+ Phổ - Infrared: phổ hồng ngoại so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính

+ HPLC, GC và TLC: thời gian lưu giữ, thời gian chết, khoảng cách di chuyển nên tương ứng với những tiêu chuẩn tham chiếu đã được quy định trước

+ Phương pháp khác: Đo quang, nhiệt độ nóng chảy… Đối với kiểm tra độ tinh khiết:

+ Kỹ thuật HPLC, GC và TLC: độ tinh khiết của chất hữu cơ hoặc các chất liên quan nên được đánh giá bằng cách so sánh với tiêu chuẩn tham chiếu chính

- Hợp tác giữa các phòng thí nghiệm quốc gia của các nước

Các dữ liệu (kết quả cân, pha loãng, quang phổ hồng ngoại, UV, TLC, HPLC ) sẽ được tổng kết và lập bảng Bảng bao gồm tên của phòng thí nghiệm, phương pháp, kết quả, phòng thí nghiệm có ý nghĩa và độ lệch chuẩn

Các kết quả được thẩm định bằng cách sử dụng Z-score Các giá trị với Z- score dưới 2 được chấp nhận sau đó giá trị trung bình với % RSD sẽ được báo cáo để xem xét và thông qua.

Tổng quan về đan sâm

Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia, họ Bạc hà (Lamiaceae)

(Nguồn: http://www.antim.vn/dan-sam-duoc-lieu-da-duoc-chung-minh-tot- cho-benh-tim.html)

Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm, huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7 Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa

Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14]

S miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc Nó cũng có mặt tại Nhật Bản [31] Cây đan sâm có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6] Cây trồng ở trại thuốc Sapa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được đã gieo đi gieo lại nhiều năm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6]

Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của đan sâm Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28]

Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước Đến nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu Các chất có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh tổng hợp [36]

Nhóm diterpenoid bao gồm rất nhiều chất có cấu trúc khác nhau được phân thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid, clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid và labdane diterpenoid Chủ yếu là abietane diterpenoid ở trong rễ, clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [31]

Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như tanshinon I, II và III, sau đó đến isotanshinon I và II, isocryptotanshinon và cryptotanshinon [31] (Hình 1.2)

25 R = R1 = H, Δ 5(10),6(7) 19-21.Tanshinon I, II, III 24 Isocryptotanshinon 22-23 Isotanshinon I, II 25 Cryptotanshinon

Hình 1.2 Cấu trúc một số abietane diterpenoid

1.2.3.2 Các dẫn xuất của acid phenolic

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của đan sâm Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A – K [35] (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc một số acid phenolic

Thành phần có mặt nhiều nhất chính là flavon, flavonol và các dẫn xuất của chúng [35]

- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’- trihydroxyflavon) và luteolin (5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylat của chúng

- Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến trong các loài thuộc chi Salvia L và nhiều nhất trong số đó là các flavon 7-glycosid như apigenin 7-glucosid (cosmosiin), luteolin 7-glucosid (cinarosid) và các

7-glucuronid tương ứng của chúng

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L

1.2.3.4 Một số thành phần khác

Triterpenoid phổ biến nhất và được tìm thấy trong đan sâm là acid ursolic và acid oleanolic (Hình 1.4) Ngoài ra còn tìm thấy một số triterpenoid khác như anagadiol, taraxerol acetate, germanicol, navidiol,…[ 31]

Ngoài ra còn có tanin và một số thành phần khác [35]

R=H, R1=R2=Me, R3=H 3 OH OH H Me Me R=R1=H, R2=R3=Me 5 OH H H Me Me

L Acid ursolic 2 Acid oleanolic 3 Anagadiol 4 Taraxerol 5.Germanicol

Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L

Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của Salvia miltiorrhiza Bunge Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ Các tác dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B, militron và salvinon Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [1,2,14,21,25,29]

- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25]

- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [2,10]

- Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng mất ngủ [7,10]

- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn

Staphylococus kháng thuốc Các thành phần như dihydrotanshinon I, hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus

- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày đay [10]

- Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ miễn dịch [11]

- Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,

B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12]

- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2]

- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11]

- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [7]

- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục: làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [21]

1.2.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

Tính vị: vị đắng, tính hàn [3]

Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can

Tác dụng và công dụng:

- Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn

- Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [1,3] Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [2]

- Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng Khi dùng với tính chất

- Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả [3,7]

- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3]

- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [1,2]

- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2]

Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].

Tổng quan về tanshinon IIA

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7,24,34]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion

- Khối lượng phân tử: 294,3444 g/mol

- Là bột màu cam hoặc đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25 o C), tan tốt trong các dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực, trong methanol

(5 mg/ml), ethanol (5 mg/ml) ở 25 o C, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25 mg/ml) [27]

- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton

Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy đủ tính chất của terpeniod

- Tanshinon IIA không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc với oxy Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy Đó có thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng tanshinon IIA trong toàn bộ quá trình chiết, cô đặc, sấy khô [27,34]

- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định lượng tanshinon IIA Tanshinon IIA hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254-280 nm

- Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có tác dụng giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của Angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sapa (Lào Cai) tháng 9/2016 và được TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà (Lamiaceae)

Tiêu bản của mẫu nghiên cứu (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm:

+ Ethanol (EtOH) + Methanol (MeOH) + n-Hexan

+ Dicloromethan (CH2Cl2) + Cloroform (CHCl3)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck,Đức

- Hạt nhồi dùng cho sắc kí cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản) +Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Đo điểm chảy trên máy Kofler micro-hotstage

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap

- Phổ cộng hưởng từ (1D và 2D- NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FT- NMR (Bruker, Đức)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 series, đầu dò PDA (Agilent Technologies, Mỹ)

- Thiết bị chiết siêu âm, cân phân tích có độ chính xác 0,1 và 0,01 mg, máy cất quay chân không, đèn soi tử ngoại UV, tủ sấy và các dụng cụ thí nghiệm khác.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

- Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 80% - nước

- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Quy trình: rễ đan sâm sau khi sơ chế (làm sạch, sấy khô, nghiền nhỏ) được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80%, 3 lần, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở

40 o C Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho cao chiết tổng ethanol Phân tán cặn chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố lần lượt với từng dung môi hexan, ethyl acetat

Copyright © School of Medicine and Pharmacy, VNU và butanol (3 lần) Phân đoạn hexan là phân đoạn tập trung các tanshinon bao gồm tanshinon IIA Các phân đoạn ethyl acetat và butanol được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng.

2.2.1.2 Phương pháp phân lập và tinh chế tanshinon IIA Để phân lâ ̣p các hợp chất, sử dụng một số phương pháp sắc ký gồm: sắc ký lớ p mỏng (dùng để khảo sát), sắc ký cô ̣t pha thường và sắc ký cô ̣t pha đảo

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiê ̣n trên bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) và Silica gel RP-18 F254s (Merck) Phát hiê ̣n chất bằng đèn tử ngoa ̣i ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoă ̣c dùng thuốc thử là dung di ̣ch H 2 SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điê ̣n từ từ đến khi hiê ̣n màu

+ Sắc ký cô ̣t (CC): được tiến hành với chất hấp phu ̣ là Silica gel pha thường và pha đảo

2.2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

Sử dụng các phương pháp vật lý (đặc điểm cảm quan, điểm chảy) và phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) kết hợp so sánh với dữ liệu công bố trong các tài liệu tham khảo

2.2.2 Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu Đánh giá chất lượng của chất chuẩn theo các chỉ tiêu chất lượng sau:

- Định tính: tiến hành phương pháp đo NMR hoặc phối hợp thêm HPLC

- Xác định độ tinh khiết: sử dụng phương pháp HPLC

- Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích pic khi áp dụng phương pháp HPLC:

Ctap %: tỉ lệ % tạp chất trong mẫu phân tích

Spic: diện tích pic tạp chất

∑Spic: tổng diện tích pic + Xác định hàm lượng: sử dụng phương pháp HPLC (Dựa trên cơ sở Chương

Hàm lượng tanshinon IIA trong dung dịch thử được tính theo công thức:

ST, SC: Diện tích pic tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng (mAU.min)

Cc: Nồng độ của tanshinon IIA trong dung dịch chuẩn (mg/ml) mcân: Khối lượng mẫu cân thực nghiệm (mg)

V: Thể tích dung dịch thử (ml)

Nguyên liệu sau khi được đánh giá theo qui trình và đạt yêu cầu về chất lượng được đưa vào đóng lọ theo các bước quy định trong VKN/TT/21.20 Sử dụng lọ thủy tinh nâu, nút xoáy có lớp đệm Teflon đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy định Để đảm bảo chất lượng của chất đối chiếu trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng thì việc đóng gói các CCĐC dự kiến được tiến hành trong Glove – Box là nơi có thể kiểm soát được độ ẩm Tiến hành trong Glove – box đã nạp khí nitơ 99,99%, độ ẩm tương đối trong buồng đóng khoảng 40% Khối lượng 20 mg/lọ Dán nhãn có ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự cho từng lọ

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê ứng dụng trong nghiên cứu phân tích, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel [6]

Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:

Tính giá trị trung bình:

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

𝑋 ̅: giá trị trung bình các mẫu thử xi: giá trị của mẫu thử n: số thử nghiệm/mẫu thử được sử dụng để tính giá trị trung bình

SD: độ lệch chuẩn RSD: độ lệch chuẩn tương đối

Sơ đồ và nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế tanshinon IIA từ dược liệu rễ đan sâm đạt độ tinh khiết cần thiết

+ Phân tích, xác định cấu trúc hóa học của tanshinon IIA tinh chế được

+ Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng tanshinon IIA: cảm quan, dữ liệu phổ

+ Phân tích xác định tạp chất, độ tinh khiết của tanshinon IIA tinh chế được.

Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu này được thực hiện tại Khoa Y dược Đại học Quốc gia Hà Nội, trong khuôn khổ Chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản trong khoa học tự nhiên và kỹ thuật của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), thuộc đề tài “Nghiên cứu dược liệu Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở Việt Nam: thành phần hóa học và tác dụng trên các dòng tế bào ung thư máu”, mã số: 106-YS.05-2015.05 (Chủ nhiệm Đề tài: TS Nguyễn Hữu Tùng)

Định dạng
Số trang	47
Dung lượng	1,71 MB