Rễ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một vị thuốc quan trọng trong các bài thuốc Đông y cổ truyền. Đây là nguồn dược liệu tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tim mạch. Các cây đan sâm được nhân giống in vitro với nguyên liệu khởi đầu là hạt được nhập khẩu từ Trung Quốc.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.000110 TÁI SINH CHỒI ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge) TỪ CALLUS CỦA MÔ LÁ Vũ Thị Bích Huyền1,*, Phạm Thị Hồng Hoa1, Nguyễn Xuân Viết1, Phạm Ngọc Bách2, Lê Thị Tuyết Mai1 Tóm tắt: Rễ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) vị thuốc quan trọng thuốc Đông y cổ truyền Đây nguồn dược liệu tiềm ứng dụng điều trị bệnh tim mạch Các đan sâm nhân giống in vitro với nguyên liệu khởi đầu hạt nhập từ Trung Quốc Hạt khử trùng với dung dịch NaOCl 20% phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm đạt cao 42,22% Callus tạo từ mảnh in vitro môi trường MS chứa 0,5 mg/L 2,4-D; 0,5 mg/L BAP với tỉ lệ tạo callus 100% cho khả tái sinh chồi cao Môi trường tối ưu tái sinh chồi từ callus MS bổ sung mg/L kinetin mg/L BAP cho tỉ lệ đạt 54,44% số lượng chồi/mẫu đạt 9,88 sau tuần nuôi cấy Chồi tái sinh nuôi dưỡng MS bổ sung 0,5 mg/L kinetin rễ môi trường MS Từ khóa: Salvia miltiorrhiza Bunge, callus, in vitro, tái sinh chồi MỞ ĐẦU Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), hay gọi huyết sâm, xích sâm, tử đan sâm…, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), Hoa môi (Lamiales), phân lớp Cúc (Asteridae), lớp Hai mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae) Lồi có nguồn gốc từ Trung Quốc nhập vào nước ta từ năm 1960 (Luật nnk., 2014) Rễ đan sâm vị thuốc quan trọng thuốc bổ huyết, điều huyết Đông y điều trị bệnh liên quan đến mạch vành mạch máu não (Su et al., 2015) Nó đánh giá nguồn dược liệu tiềm điều trị bệnh liên quan đến tim mạch (Wang et al., 2017) Tanshinone IIA, thành phần phát rễ đan sâm, có tác dụng ức chế hoạt hố tiểu cầu, làm giảm q trình tạo fibrin, làm giảm vón cục máu mạch máu (Maione et al., 2014) Các thành phần rễ đan sâm báo cáo với nhiều tác dụng chống oxy hoá (Jiang et al., 2015), ức chế tế bào ung thư (Lu et al., 2016), chống viêm, kháng khuẩn, chống xơ hoá (Ma et al., 2016; Su et al., 2015), có khả phục hồi tế bào Alzheimer (Zhang et al., 2019), ngăn ngừa điều trị bệnh đái tháo đường (Jia et al., 2019) Đan sâm có khả nhân giống vơ tính từ rễ củ hữu tính từ hạt (Luật nnk., 2014) Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng ngày tăng, việc ứng dụng kỹ thuật ni cấy mô, tế bào thực vật bảo tồn, nhân giống phát triển loài cấp thiết Cho đến nay, nhân giống in vitro loài đan sâm nghiên cứu rộng rãi Trung Quốc (Feng et al., 2004) Tsai et al., (2016) nhận định chất kích thích sinh trưởng 1Trường Đại học Sư phạm Hà Nội ty Cổ phần Y dược Hải Thiên *Email: bichhuyenbh88@gmail.com 2Công 888 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM TDZ (thidiazuron) có hiệu cao việc tái sinh chồi in vitro trực tiếp gián tiếp Thành phần hoá học đan sâm nhân giống in vitro có chứa tất chất có hoạt tính sinh học axit salvianolic B, dihydrotanshinon I, cryptotanshinon, tanshinon I tanshinon IIA (Tsai et al., 2015) Tại Việt Nam, nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ đan sâm từ ba vật liệu (lá, cuống đoạn thân) lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 cho thấy mô vật liệu thích hợp để cảm ứng rễ tơ Nghiên cứu hướng đến việc sản xuất sinh khối dược liệu phục vụ cho khai thác hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Thảo et al., 2015) Bên cạnh đó, Vinh nnk (2014) nhân giống in vitro đan sâm cách tạo cụm chồi từ đoạn thân (Vinh et al., 2014) Tuy nhiên, nghiên cứu tái sinh in vitro từ callus nước ta hạn chế Nghiên cứu báo cáo kết tái sinh Salvia miltiorrhiza Bunge từ callus mô nhằm bảo tồn nguồn gen in vitro cung cấp nguồn giống lớn cho việc phát triển vườn dược liệu nước ta VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Hạt đan sâm thu mua tỉnh An Huy, Trung Quốc Công ty Cổ phần Y dược Hải Thiên (Thanh Xuân, Hà Nội) 2.2 Bố trí thí nghiệm Hạt đan sâm khử trùng nuôi cấy môi trường MS tạo hoàn chỉnh, vật liệu khởi đầu để nhân giống in vitro Lá in vitro cắt thành mảnh nhỏ nuôi cấy môi trường tạo callus Callus tạo nuôi cấy môi trường tái sinh để tạo chồi tái sinh Chồi tái sinh dưỡng chồi để phát triển đến kích thước định cho rễ mơi trường MS Thí nghiệm thực sau: Khử trùng hạt: Hạt đan sâm rửa với xà phịng lỗng nước cất nhiều lần, sau tiến hành khử trùng tủ cấy theo phương pháp Lê Tiến Vinh cộng sự, có cải tiến (Vinh et al., 2014) Ngâm hạt với cồn 70o (1 phút), sau ngâm NaOCl 20% HgCl2 0,1% với khoảng thời gian khác Rửa hạt nước cất khử trùng nhiều lần gieo hạt môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose g/L agar để tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro Theo dõi ghi nhận tỉ lệ nảy mầm hạt sau tuần gieo hạt Tạo callus từ mô lá: Lá in vitro mọc từ hạt cắt thành mảnh nhỏ (5x5 mm) nuôi cấy môi trường tạo callus theo phương pháp Tsai cộng sự, có cải tiến (Tsai et al., 2015) Môi trường tạo callus môi trường MS có bổ sung BAP; 2,4-D với nồng độ khác nhau; 30 g/L đường sucrose; g/L agar; pH 5,7 - 5,8; 25 ± oC nuôi tối Sau tuần nuôi cấy, đánh giá tỉ lệ tạo callus đặc điểm callus Tái sinh chồi từ callus: Callus chuyển sang môi trường tái sinh chồi theo phương pháp Tsai cộng sự, có cải tiến công thức tái sinh chồi (Tsai et al., 2015) Callus tạo từ công thức môi trường khác nuôi cấy môi trường MS bổ sung 2,4-D; kinetin BAP với hàm lượng khác nhau; 30 g/L đường saccarose; g/L PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 889 agar; điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 2800 lux Sau tuần nuôi cấy, đánh giá tỉ lệ tái sinh chồi từ callus Dưỡng chồi, rễ: Chồi tái sinh từ callus với - lá; cao 2,0 - 2,5 cm chuyển sang môi trường MS bổ sung kinetin với hàm lượng khác nhau, 30 g/L đường saccarose, g/L agar để dưỡng chồi Theo dõi khả sinh trưởng chồi việc đo chiều dài chồi, số lượng chồi trước sau tuần nuôi cấy Chồi đạt kích thước 4,0 - 5,0 cm tiến hành rễ môi trường MS để tạo hoàn chỉnh 2.3 Xử lý số liệu Số liệu xử lý thống kê phần mềm Excel Stata 10.1 2.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành Phịng thí nghiệm Ni cấy mô tế bào thực vật (Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) từ tháng 5/2016 - tháng 5/2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khử trùng tạo vật liệu khởi đầu Hạt đan sâm khử trùng với dung dịch NaClO HgCl2 khoảng thời gian khác Kết xác định điều kiện khử trùng hạt tạo vật liệu khởi đầu thể Bảng 1, Hình Bảng Kết khử trùng hạt tỉ lệ nảy mầm hạt Thời gian khử Công Tỉ lệ mẫu Số hạt trùng (phút) thức Tỉ lệ mẫu bị thí khử nhiễm (%) NaClO HgCl2 Nảy mầm Không nảy nghiệm trùng 20% 0,1% (%) mầm (%) CT1 45 25,93b ± 2,05 28,89a,b ± 3,74 45,19c ± 1,70 c a CT2 45 42,22 ± 1,63 23,70 ± 3,68 34,07b ± 2,05 b b CT3 10 45 31,11 ± 0,82 30,37 ± 1,70 38,52b ± 1,25 CT4 45 18,52a ± 1,70 54,81c ± 2,49 26,67a ± 0,82 a c, CT5 5 45 16,30 ± 1,25 58,52 ± 0,94 25,19a ± 0,47 a d CT6 10 45 15,56 ± 0,82 64,44 ± 0,82 20,00a ± 1,41 a c,d CT7 10 45 17,04 ± 1,25 60,74 ± 2,62 22,22a ± 1,63 Các giá trị cột với chữ khác có ý nghĩa thống kê mức p