Trong nghiên cứu này, các phân đoạn của lá từ cây Bạch hoa xà thiệt thảo in vitro 3 tuần tuổi được cô lập và nuôi cấy trên môi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA hay NAA với nồng độ thay đổi 0,1; 0,2; hay 0,4 mg/L. Sự sinh phôi soma từ mô lá đạt tỉ lệ 100 % trên các môi trường MS½ có bổ sung BA 1 mg/Lkết hợp IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L, phôi soma phát sinh cũng trải qua các giai đoạn phát triển tương tự của phôi hữu tính.
SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Sinh phôi soma từ mô Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa Willd.) Nguyễn Thị Kim Anh Hồng Thị Thu Thấm Phan Ngơ Hoang Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: pnhoang@hcmus.edu.vn (Bài nhận ngày 25 tháng 10 năm 2017, nhận đăng ngày 18 tháng 12 năm 2017) TÓM TẮT Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) hợp IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L, phôi soma loại thảo dược thuộc họ Cà phê (Rubiaceae), phát sinh trải qua giai đoạn phát triển sử dụng để điều trị bệnh liên quan đến tương tự phơi hữu tính: phơi hình cầu, hình bạch cầu kháng tăng trưởng tế bào ung tim, hình cá đuối phơi trưởng thành Số lượng thư Ngồi ra, chứa hai loại triterpen chồi tăng trưởng sau giai đoạn phát triển phôi oleanolic acid, ursolic acid flavonoid có tác mơi trường đạt giá trị cao Trên dụng chống viêm, kháng khuẩn, hạ đường huyết, phân đoạn lá, số lượng phôi soma chống phát triển gốc tự do, giảm lipid máu xuất khác nhau: phần phần gốc kháng ung thư [1] Trong nghiên cứu này, có số phơi phát sinh cao hẳn so với phân đoạn từ Bạch hoa xà thiệt thảo in Những biến đổi hình thái vai trò chất vitro tuần tuổi cô lập nuôi cấy mơi điều hòa tăng trưởng nội sinh q trình phát trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA sinh phơi phân tích; mối liên hệ vị trí hay NAA với nồng độ thay đổi 0,1; 0,2; hay 0,4 khác lá, cường độ hô hấp lá, mg/L Sự sinh phôi soma từ mô đạt tỉ lệ 100 % hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/Lkết sinh phôi soma thảo luận Từ khóa: bạch hoa xà thiệt thảo, chất điều hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp, phôi soma kỹ thuật ni cấy in vitro mục đích nhân MỞ ĐẦU giống khai thác loại dược liệu Gần đây, việc sử dụng thảo dược để điều trị số bệnh nan y ngày phổ biến hiệu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP cao lại biểu tác dụng phụ Cây Bạch hoa xà Vật liệu Cây Bạch hoa xà thiệt thảo (Hedyotis diffusa) thiệt thảo (Hedyotis diffusa) sử dụng nhiều in vitro tuần tuổi tăng trưởng từ hột môi thuốc y học cổ truyền để điều trị hạn trường MS [4] với đa lượng giảm 50 % (MS½), chế phát triển tế bào ung thư số loại bệnh sacarose 30 g/l, nhiệt độ 27±2 0C, ánh sáng khác [2, 3] Các công bố khoa học 2.500±500lx (12/12) ẩm độ khơng khí 75±5 %, giới tập trung vào phân tích, khảo sát phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, Khoa Sinh chứng minh dược lý dịch trích, học – Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa cơng trình nghiên cứu ni cấy in vitro Bạch học Tự nhiên, ĐHQG-HCM hoa xà thiệt thảo chưa có nhiều Trong nghiên cứu Phương pháp này, tập trung khảo sát ảnh hưởng Sự sinh phôi soma từ mô chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả Các vị trí (tính từ ngọn) in phát sinh phôi soma từ mô nhằm xác định vitro tuần tuổi cô lập, tạo vết thương vuông Trang 76 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 góc với gân đặt lên mơi trường: MS½ (đối chứng), MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA NAA có nồng độ thay đổi 0,1 đến 0,4 mg/L Theo dõi phát sinh phôi nghiệm thức theo thời gian Ảnh hưởng vật liệu nuôi cấy lên q trình phát sinh phơi soma Các vị trí (tính từ ngọn) từ in vitro tuần tuổi cô lập, tạo vết thương vng góc với gân chia làm phân đoạn (ngọn, gốc lá) sau đặt mơi trường MS½ bổ sung BA mg/L kết hợp IAA 0,2 mg/L Theo dõi phát sinh phôi soma nghiệm thức theo thời gian Phân tích biến đổi hình thái q trình phát sinh phơi Sự biến đổi hình thái mẫu cấy quan sát trực tiếp mắt thường kính hiển vi soi nổi; thay đổi cấu trúc mô, phôi soma, chồi hay mơ sẹo quan sát kính hiển vi quang học sau giải phẫu ngang nhuộm hai màu Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Mẫu cấy phát sinh từ nghiệm thức ly trích lập mỏng silicagel F254 (1.0554, Merck), với hệ dung môi di chuyển isopropanol: ammonium hydroxide: H2O (10:1:1) 30±2 0C Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh IAA, zeatin, GA3 ABA xác định nhờ sinh trắc nghiệm [5] Cường độ hô hấp Hô hấp mẫu cấy xác định điện cực oxygen máy Leaf Lab (Hansatech, Anh) Cường độ hô hấp tính dựa lượng oxygen thay đổi buồng đo (µmolO2/g trọng lượng tươi/ giờ) Xử lý số liệu Số liệu ghi nhận từ thí nghiệm xử lý thống kê nhờ chương trình SPSS 20.0 cho windows Sự phân hạng, chia nhóm theo cơng thức Duncan, Dunnett dựa khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 (p: probability), giá trị khác biệt biểu mẫu tự khác kèm theo sau số trung bình KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự sinh phôi soma từ tế bào mô Sau ngày ni cấy, mơ bắt đầu có biểu đáp ứng, vùng vết thương thấy rõ phù lên, đến ngày thứ quan sát thấy mô sẹo Mô ngày thứ mơi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp IAA 0,1 mg/L 0,2 mg/L hay NAA 0,1 mg/L ghi nhận xuất nốt chồi Các phẫu thức cắt ngang nhuộm hai màu đỏ carmin-xanh iod cho thấy có diện phơi soma, mơ mơi trường đối chứng MS½ khơng có tượng (Hình 1) Hình Mơ sau ngày ni cấy mơi trường: (A) MS½ có BA IAA 0,1 mg/L; (B) MS½ có BA IAA 0,2 mg/L; (C) MS½ có BA IAA 0,4 mg/L; (D) MS½ có BA NAA 0,1 mg/L; (E) MS½ có BA NAA 0,2mg/L; (F) MS½ có BA NAA 0,4 mg/L Trang 77 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Trên mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L kết hợp IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L biệt hóa tạo phơi sớm vào ngày thứ 7, với tần suất xuất phôi soma cao Trong đó, mơi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp NAA 0,1mg/L tạo phôi xuất vào khoảng ngày thứ 12 sau nuôi cấy với tần suất thấp nhiều (Bảng 1) Bảng Tần suất xuất phôi soma từ mô môi trường nuôi cấy khác nhau, sau ngày Tần suất xuất Nghiệm thức phơi (%) MS½ ± 0c MS½ có BA IAA 0,1mg/L 100 ± 0a MS½ có BA IAA 0,2mg/L 100 ± 0a MS½ có BA IAA 0,4mg/L ± 0c MS½ có BA NAA 0,1mg/L 44,42 ± 7,04b MS½ có BA NAA 0,2mg/L ± 0c MS½ có BA NAA 0,4mg/L ± 0c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Cụm chồi phát sinh mẫu cấy bao gồm chồi tạo thành trực tiếp từ tế bào mô sẹo chồi tạo thành từ q trình phát sinh phơi soma (Hình 2) Số lượng chồi phát sinh nhiều mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L kết hợp IAA 0,1 mg/L IAA 0,2 mg/L (Bảng 2) Bảng Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng lên tạo cụm chồi từ mô lá, sau tuần Nghiệm thức MS½ MS½ có BA IAA 0,1 mg/L MS½ có BA IAA 0,2 mg/L MS½ có BA IAA 0,4 mg/L MS½ có BA NAA 0,1 mg/L MS½ có BA NAA 0,2 mg/L MS½ có BA NAA 0,4 mg/L Số chồi 0,00 ± 0,00 d 67,50 ± 0,87 a 72,20 ± 7,81 a 10,50 ± 0,96 c 20,33 ± 1,09 b 12,33 ± 1,12 bc 9,50 ± 0,99 c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Trong mẫu cấy có phát sinh phơi soma, mơi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L tương ứng với số chồi tạo nhiều hai mơi trường ln có cường độ hơ hấp cao (Bảng 3) Bảng Cường độ hô hấp mô môi trường nuôi cấy khác sau 10 ngày Nghiệm thức MS½ có BA IAA 0,1 mg/L MS½ có BA IAA 0,2 mg/L MS½ có BA IAA 0,4 mg/L MS½ có BA NAA 0,1 mg/L MS½ có BA NAA 0,2 mg/L MS½ có BA NAA 0,4 mg/L Cường độ hơ hấp (µmol O2/g TLT/ giờ) 72,53 ± 4,46a 68,26 ± 3,34a 33,67 ± 2,52c 37,74 ± 1,03bc 44,77 ± 1,37b 33,98 ± 2,53c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Hình Cụm chồi từ mơ sau tuần môi trường khác nhau: (A) MS½ có BA IAA 0,1 mg/L; (B) MS½ có BA IAA 0,2 mg/L; (C) MS½ có BA IAA 0,4 mg/L; (D) MS½ có BA NAA 0,1 mg/L; (E) MS½ có BA NAA 0,2 mg/L; (F) MS½ có BA NAA 0,4 mg/L Trang 78 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 Phân tích biến đổi hình thái q trình phát sinh phơi soma Trên mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L IAA 0,2 mg/L sau ngày mẫu cấy có biểu đáp ứng với môi trường, lát cắt giải phẫu ghi nhận phân chia tế bào biểu bì nhóm tế bào biểu bì; đến ngày thứ tế bào mô sẹo xuất vết thương với nhiều hình dạng khác nhau: dài, tròn, oval (Hình 3) Hình Phẫu thức cắt ngang qua vùng tạo mơ sẹo mơi trường MS½ có BA IAA 0,2 mg/L theo thời gian Phôi soma phát sinh từ mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L IAA 0,2 mg/L ghi nhận qua bước theo trình tự biến đổi tương tự phơi hữu tính: phơi hình cầu với biểu bì rõ ngày thứ 7, từ ngày thứ sau ni cấy ghi nhận phơi hình tim, ngày thứ phơi hình cá đuối hình thành sau ngày thứ 10 cực chồi cực rễ xuất (Hình 4) Trang 79 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Hình Các giai đoạn phát sinh phơi soma từ mơ mơi trường MS½ có BA IAA 0,2mg/L theo thời gian Ảnh hưởng vật liệu ni cấy lên q trình phát sinh phơi soma Sau ngày nuôi cấy, ba phân đoạn có đáp ứng với mơi trường ni cấy; ngày thứ 5, mô sẹo xuất nhiều vết cắt phân Trang 80 đoạncủa lá;từ ngày thứ 7, mẫu cấy phần phần gốc bắt đầu xuất nốt chồi phần chưa xuất chồi Trên ba loại mẫu cấy xuất nhiều chồi sau ngày thứ 10 (Hình 5) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 Hình Các phân đoạn mẫu cấy mơi trường MS½ có bổ sung BA IAA 0,2 mg/L theo thời gian: (A) lá; (B) lá; (C) gốc Tần suất xuất phôi ghi nhận ngày thứ sau đặt cấy mô môi trường cho thấy phần ln có phơi xuất hiện, phần ghi nhận tượng (Bảng 4) Các chồi phát sinh từ phần thường có kích thước nhỏ so với hai phân đoạn lại Ở thời điểm sau tuần nuôi cấy, số lượng chồi tiếp tục gia tăng chưa có xuất rễ (Hình 6); số lượng chồi phát sinh từ phân đoạn đạt giá trị cao nhất, trọng lượng tươi cao hẳn so với phần nhiên trọng lượng khơ khơng có khác biệt ba nghiệm thức (Bảng 5) Bảng Tần suất xuất phôi soma từ phân đoạn sau ngày mơi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L IAA 0,2 mg/L Nghiệm thức Phần Phần Phần gốc Tần suất xuất phôi (%) 7,14 ± 4,61b 100 ± 0,00 a 96,43 ± 3,57 a Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Hình Cụm chồi hình thành từ phân đoạn sau tuần mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L IAA 0,2 mg/L: (A) lá; (B) lá; (C) gốc Bảng Ảnh hưởng vật liệu nuôi cấy lên phát sinh cụm chồi, sau tuần Nghiệm thức Số chồi Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Phần 18,80 ± 1,07b 46,08 ± 0,86b 4,36 ± 0,19a a a Phần 28,60 ± 2,14 52,23 ± 1,53 5,00 ± 0,18a ab ab Phần gốc 23,50 ± 2,59 52,15 ± 2,27 4,97 ± 0,25a Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Trang 81 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Nhìn chung, hoạt tính zeatin, IAA GA3 phân đoạn gốc cao so với lá, đồng thời môi trường MS½ có bổ sung BA mg/L IAA 0,2 mg/L ln cao so với mơi trường MS½ Ngược lại, hoạt tính ABA phân đoạn gốc thấp so với mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L IAA 0,2 mg/L thấp so với môi trường đối chứng MS½ (Bảng 6) Bảng Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh từ phân đoạn q trình phát sinh phơi soma, sau ngày ni cấy Nghiệm thức MS½ MS½ có BA IAA 0,2mg/L IAA Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật (µg/l) Zeatin ABA GA3 0,06 ± 0,01 d 0,07 ± 0,01 d 1,77 ± 0,08 a 0,67 ± 0,05 d 0,06 ± 0,01 d 0,05 ± 0,02 cd 1,05 ± 0,11 b 1,03 ± 0,02 c gốc 0,09 ± 0,01 c 0,10 ± 0,02 c 1,14 ± 0,02 b 2,74 ± 0,16 a 0,09 ± 0,01 bc 0,10 ±0 ,01 bc 0,69 ± 0,05 c 0,60 ± 0,01 d 0,12 ± 0,00 ab a d 1,00 ± 0,02 c gốc 0,13 ± 0,01 a 0,34 ± 0,08 d 2,19 ± 0,11 b 0,15 ± 0,01 0,14 ± 0,01 ab 0,37 ± 0,02 Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05 Trên mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L kết hợp với loại auxin khác nhau, mô có biểu đáp ứng với mơi trường sau ngày nuôi cấy, sau ngày tế bào mơ sẹo hình thành quan sát kính hiển vi soi nổi; đến ngày thứ mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L kết hợp IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L hay NAA 0,1 mg/L ghi nhận xuất phơi hình cầu Sự hình thành phơi soma thực vật chịu ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật, auxin đóng vai trò quan trọng q trình khử phân hóa tế bào vào trạng thái có khả sinh phơi, trường hợp mơ cấy khơng mơ non hay chưa trưởng thành [6] Sự diện auxin riêng lẻ hay kết hợp với cytokinin cần thiết cho thành lập tế bào hay nhóm tế bào có khả sinh phơi, nhiên auxin với nồng độ cao cản phát triển giai đoạn phôi soma Trong giai đoạn phát triển, auxin ngoại bào không cần thiết, diện auxin ngoại bào ngăn cản di chuyển hữu cực auxin nội bào dẫn đến ức chế sinh phôi [7] Trong thí nghiệm này, sử dụng BA kết hợp với IAA hay NAA Trang 82 với nồng độ khác ảnh hưởng không giống đến phát sinh phôi soma (Bảng 1) Các công bố Jha cộng [8], Trần Thị Tuyết Nhung cộng [9] cho thấy chất điều hòa tăng trưởng thực vật sử dụng nồng độ khác yếu tố xác định hình thành mơ sẹo phát sinh phơi soma sau Jatropha curcashay Pseuderanthemum palatiferum Trong nghiên cứu này, mơi trường có bổ sung BA mg/L kết hợp với IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L cho tỷ lệ phát sinh phôi 100 %, tăng hàm lượng IAA tăng lên 0,4 mg/L khơng có phát sinh phơi Theo q trình phát sinh phơi cần có auxin để cảm ứng số q trình, nhiên hàm lượng auxin cao kích thích tế bào phân chia mạnh để tạo khối mơ sẹo hướng tế bào vào đường biệt hóa sinh phơi soma [6] Ngược lại, thay IAA NAA, tỷ lệ phơi soma hình thành bị giảm ngay, NAA nồng độ 0,1 mg/L tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,2 hay 0,4 mg/L khơng ghi nhận tạo phơi (Bảng 1) Kết thí nghiệm Bạch hoa xà thiệt thảo lần cho thấy vai trò loại TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 lượng auxin tác động q trình sinh phơi soma, góp phần kiểm chứng luận điểm ảnh hưởng hormone thực vật q trình sinh phơi cơng bố trước Những mẫu cấy hai mơi trường MS½ có bổ sung BA mg/L kết hợp với IAA 0,1 mg/L hay IAA 0,2 mg/L có cường độ hơ hấp đạt giá trị cao giai đoạn phát sinh phơi soma Q trình hình thành phát triển phơi soma trải qua bước phân chia phân hóa tế bào cần lượng ATP, nên biểu gia tăng hơ hấp phù hợp (Bảng 3) Ngồi ra, nhiều công bố cho thấy không hormone thực vật tác động trực tiếp trình phát sinh phôi soma mà yếu tố khác tuổi sinh lý, trạng thái mơ cấy, … có ảnh hưởng khơng nhỏ đến q trình phát sinh đặc biệt q trình phát sinh phơi soma Khi khảo sát phân đoạn khác đặt lên môi trường cảm ứng tạo phơi soma (MS½ có BA mg/L IAA 0,2 mg/L) ghi nhận khác biệt số lượng phôi soma phát sinh (Bảng 5) Sự phản phân hóa tế bào bước để tế bào tiếp tục tiến tới bước phân hóa mới, q trình khơng phụ thuộc vào loại nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật mà phụ thuộc vào khả đáp ứng mô cấy Thực tế cho thấy, xuất nốt chồi xảy sớm mẫu cấy phần tần suất xuất phôi soma cao phần gốc (trong phần tần suất thấp), mãnh mô từ phần gốc đáp ứng tốt với môi trường để phát sinh phát triển phôi nghiên cứu Ở thực vật, phơi soma hình thành trực tiếp gián tiếp thơng qua giai đoạn hình thành mơ sẹo, phơi soma có nguồn gốc từ tế bào hay cụm tế bào Phơi hình thành từ tế bào biểu bì có nguồn gốc tế bào từ tế bào biểu bì có nguồn gốc từ cụm tế bào [8] Ngồi ra, có quan điểm cho phơi phát sinh từ tế bào thấy giai đoạn phân chia tế bào đầu tiên, phơi kết nối với mô mẹ ban đầu thông qua dây treo, phôi phát sinh từ cụm tế bào ban đầu quan sát chỗ lồi lên từ mô mẹ thường trộn vào với mô mẹ [9] Với kết giải phẫu qua gân sau ngày nuôi cấy, ghi nhận phân chia tế bào biểu bì tế bào biểu bì ngày thứ có phân chia tạo mơ sẹo (Hình 3), tiếp sau phơi soma hình thành trải qua bước tạo phơi hình cầu, phơi tim, phơi cá đuối diện cực chồi, cực rễ (Hình 4) Do vậy, nói phát sinh phơi soma cảm ứng từ tế bào mơ sẹo có nguồn gốc từ tế bào nhu mơ biểu bì, trải qua q trình tương tự phát sinh phôi hợp tử nhiên phôi giai đoạn phơi mầm mà vào giai đoạn hình thành mơ phân sinh phát triển thành chồi hồn chỉnh sau Hàm lượng hormone thực vật có thay đổi rõ mẫu cấy phát sinh phôi so với mẫu cấy đặt môi trường đối chứng MS½ Kết sinh trắc nghiệm ngày thứ (tương ứng giai đoạn phơi hình cầu hình thành mẫu cấy) cho thấy hàm lượng IAA tăng phần phần cuối so với mẫu đặt mơi trường đối chứng MS½ Rõ ràng lượng auxin mẫu cấy tăng lên đáp ứng cho phản phân hóa kích thích mạnh phân chia tế bào, phát sinh phân cực phôi soma Bên cạnh đó, lượng cytokinin tăng lên phần ghi nhận có phơi hình cầu xuất hiện; q trình phát sinh phơi soma, tế bào cần phân chia mà không bị kiềm hãm tế bào xung quanh cho thấy cytokinin đóng vai trò quan trọng giai đoạn Cytokinin có tác động mạnh giai đoạn xảy phân chia tế bào tích cực để hình thành phơi hình cầu [10] Trên điều kiện môi trường nuôi cấy MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA 0,2mg/L lượng chồi phần phần gốc khác biệt, hai phần tạo nhiều chồi trọng lượng tươi cụm chồi cao so với phần trọng lượng khô cụm Trang 83 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 chồi lại khơng có khác biệt nhiều ba vị trí khác (Bảng 5) Các tế bào phần gốc dường đáp ứng với môi trường nuôi cấy dễ dàng so với phần q trình tạo chồi; mật độ hay cấu trúc tế bào vùng khác ảnh hưởng đến tần xuất tạo phơi soma phát triển hình thành chồi; vấn đề nhóm tác giả tiếp tục tìm hiểu tương lai KẾT LUẬN Mô Bạch hoa xà thiệt thảo in vitro phát sinh phôi soma với tần suất cao mơi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA 0,1 hay 0,2 mg/L Phôi soma phát sinh trải qua giai đoạn phát triển tương tự phơi hữu tính: phơi hình cầu, hình tim, hình cá đuối phơi trưởng thành Đặc biệt, số lượng phôi soma xuất từ phân đoạn khác nhau: phần phần gốc có số phơi phát sinh cao so với Hàm lượng IAA, Zeatin nội sinh tăng cao ngày thứ phát sinh phôi soma, cường độ hô hấp cụm chồi ngày thứ 10 mơi trường MS½ có BA IAA 0,1 mg/L cao Kiểu phát sinh phôi soma Bạch hoa xà thiệt thảo in vitro mơ hình nhân giống nhằm tạo nguồn nguyên liệu cung cấp cho ngành dược liệu Ngòai ra, kết hợp khảo sát tác động chất lượng tia sáng thông qua sử dụng ánh sáng đơn sắc (LED) định hướng cho việc thu nhận hợp chất thứ cấp hiệu loại dược liệu tương lai Somatic embryogenesis in the leaf tissue of Hedyotis diffusa Willd Nguyen Thi Kim Anh Hoang Thi Thu Tham Phan Ngo Hoang University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Hedyotis diffusa is a valuable medicinal herb belong to the Rubiaceae family It is widely used in the treatment of various types of cancer and other diseases related to leukemia Besides, the plant usually contains triterpenoids (oleanolic acid, ursolic acid) and flavonoids which have a range of pharmacological activities of antiinflammatory, antibacterial, hypoglycemic, antifree radicals, reducing blood lipids and anticancer Leaf segments of weeks old H diffusa were cultured on half strength Murashige and Skoog (½MS) medium supplemented with different concentrations of indole acetic acid (IAA; 0.1, 0.2 and 0.4 mg/L) or α-naphthalene acetic acid (NAA; 0.1, 0.2 and 0.4 mg/L) and benzyladenine (BA) at Trang 84 a concentration of 1mg/L In this study, the highest percentage of somatic embryogenesis was obtained using 0.1 mg/L IAA and mg/L BA, and 0.2 mg/L IAA and mg/L BA The somatic embryos develop through a series of morphological stages: globular type, heart, torpedo and mature embryos Besides, the highest number of shoots per explant was achieved in the same media The middle and the distal end segments were found the most suitable for somatic embryogenesis Morphological changes and the role of endogenous hormones in somatic embryo formation were analyzed The position of the leaf segments of the same leaf, respiration rate, and endogenous hormone and somatic embryo formation were also discussed TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 Keywords: Hedyotis diffusa Willd., phytohormones, respiration rate, somatic embryogenesis TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] C Soica, C Oprean, F Borcan, C Danciu, C Trandafirescu, D Coricovac, M Munteanu, The synergistic biologic activity of oleanolic and ursolic acid in complex with hydroxypropyl-γ-cyclodextrin, Molecules, 19, 4, 4924–4940 (2014) [2] Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 250–251 (2004) [3] Phạm Hoàng Hộ,Cây cỏ Việt Nam NXB Trẻ: 105–123 (2003) [4] T.Murashige, F Skoog,A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Plant Physiology, 15, 473– 497 (1962) [5] T.Yokota, N Murofushi, N Takahashi, Extraction, purification, and indentification, hormonal regulation of development Molecular aspects of plant hormones, Edited by J MacMilan – Encyclopedia of plant physiology, New series, Springer New York, 9, 113–201 (1980) [6] K Nomura, A Komamine,Physiological and morphological aspects of somatic embryogenesis Morphogenesis in Plant Tissue Cultures, 115–131 (1999) [7] K Mashayekhi-Nezamabadi,The protein synthesis spectrum during the induction phase of somatic embryogenesis in carrot (Daucus carota L.) cultures and the role of nitrogen forms for embryos development Dr Sci Thesis Justus Liebig University, Giessen, 4–8 (1999) [8] B.T.Jha, P Mukherjee, M.M Datta,Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn, An important biofuel plant, Plant Biotechnology Reports, 1, 3, 135–140 (2007) [9] Trần Thị Tuyết Nhung, Phan Ngô Hoang, Nguyễn Du Sanh, phát sinh phôi thể hệ từ mơ sẹo Hồn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk), Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐHQG-HCM, 17, 2, 100–107 (2014) [10] K.Mashayekhi-Nezamabadi, The protein synthesis spectrum during the induction phase of somatic embryogenesis in carrot (Daucus carota L.) cultures and the role of nitrogen forms for embryo development Dr Sci Thesis Justus Liebig University, Giessen: 11–22 (2000) Trang 85 ... tương lai KẾT LUẬN Mơ Bạch hoa xà thiệt thảo in vitro phát sinh phôi soma với tần suất cao môi trường MS½ có bổ sung BA 1mg/L kết hợp với IAA 0,1 hay 0,2 mg/L Phôi soma phát sinh trải qua giai đoạn... đuối phôi trưởng thành Đặc biệt, số lượng phôi soma xuất từ phân đoạn khác nhau: phần phần gốc có số phôi phát sinh cao so với Hàm lượng IAA, Zeatin nội sinh tăng cao ngày thứ phát sinh phôi soma, ... nghiệm Bạch hoa xà thiệt thảo lần cho thấy vai trò loại TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỐ 6, 2017 lượng auxin tác động trình sinh phơi soma,