Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước của bài thuốc cây Lược vàng và Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng. Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa). Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO THEO CHƯƠNG TRÌNH CỦA BÀI THUỐC CÂY LƯỢC VÀNG VÀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ Bùi Chí Bảo*, Phạm Thị Bình Minh*, Khổng Lê Trường Giang**, Trịnh Thị Diệu Thường* TĨM TẮT Tình hình chung mục tiêu nghiên cứu: Theo WHO, ung thư thách thức quan trọng sức khoẻ cộng đồng kỷ 21 Tại Việt Nam, số ca mắc ung thư không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 ca năm 2010 Năm 2018, số ca ung thư mắc tăng lên khoảng 165.000 ca/96,5 triệu dân Tỷ lệ loại ung thư phổ biến Việt Nam: ung thư gan 15,4%, ung thư phổi 14,4%, ung thư dày 10,6%, ung thư vú 9,2%, ung thư trực tràng 8,9%, ung thư khác 41,4% Do đó, việc nghiên cứu để tìm kiếm phương thuốc điều trị hỗ trợ điều trị ung thư cần thiết Tại tỉnh Sóc Trăng, người dân kinh nghiệm sử dụng thuốc kết hợp Lược vàng Bạch hoa xà thiệt thảo để hỗ trợ điều trị ung thư Cây Lược vàng có chứa quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa methylanthraquinon Theo nhiều nghiên cứu, quercetin methylanthraquinon có khả gây chết tế bào ung thư thông qua chế chết theo chương trình Tuy nhiên, đến chưa có nghiên cứu khoa học việc sử dụng thuốc điều trị ung thư Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu khảo sát khả kháng ung thư thuốc Lược vàng Bạch hoa xà thiệt thảo Sóc Trăng Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu cao chiết nước thuốc Lược vàng Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập địa bàn tỉnh Sóc Trăng Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp tiến sĩ Akira Nakagawa) Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II) Kết quả: Sử dụng nồng độ thuốc pha loãng theo tỷ lệ 1/2 (3,04 mg/ml) (6,08 mg/ml) số lượng tế bào ung thư vú chết theo chương trình khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng Kết hợp cao chiết Lược vàng bạch hoa xà thiệt thảo pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (1,22 mg/ml) Retinoic acid (RA) cho thấy tạo cụm ngày thứ 2, ngày thứ ngày thứ 10 tế bào tách biệt hoá So sánh marker OCT4 SOX2 nhóm tế bào RA nhóm kết hợp RA với cao chiết Lược vàng Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy có giảm biểu OCT4 SOX2 có ý nghĩa thống kê Kết luận: Đặc tính cao chiết thuốc Lược vàng Bạch hoa xà thiệt thảo sử dụng nồng độ pha loãng theo tỷ lệ 1/2 (3,04 mg/ml) đủ gây chết tế bào theo chế apoptosis dòng tế bào ung thư vú MDA-MB 231 Nếu sử dụng nồng độ pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (1,22 mg/ml) kết hợp với retionic acid đủ tác động đến biệt hóa tế bào ung thư kháng RA (tế bào SKN-DZ) Từ khóa: lược, bạch hoa xà thiệt thảo, apoptosis, phương pháp dòng chảy tế bào, biệt hóa ABSTRACT EVALUATING ABILITY TO APOPTOSIS OF THE HERBAL FORMULA CONSISTING OF CALLISIA FRAGRANS LINDL AND HEDYOTIS DIFFUSA WILLD IN SOC TRANG PROVINCE ON CANCER CELLS Bui Chi Bao, Pham Thi Binh Minh, Khong Le Truong Giang, Trinh Thi Dieu Thuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 82 – 90 *Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh **Trường ĐH Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.BS Phạm Thị Bình Minh ĐT: 0386932527 Email: ptbminh@ump.edu.vn 82 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Objectives: According to WHO, cancer is one of the most important challenges to the public health in the 21 century In Vietnam, incidence of cancer has continuously increased, from 68,000 (in 2000) to 126,000 (in 2010) In 2018, incidence of cancer increased to about 165,000 cases/ 96.5 million people The rate of popular cancers in Vietnam: liver cancer 15.4%, lung cancer 14.4%, stomach cancer 10.6%, breast cancer 9.2%, rectal cancer 8.9%, other cancers 41.4% Therefore, research to seek treatment or support treatment for cancer is very necessary In Soc Trang province, residents use herbal formular consisting of Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd to support cancer treatment Callisia fragrans Lindl contain quercetin, Hedyotis diffusa Willd contain methylanthraquinone According to many studies, quercetin and methylanthraquinone are capable of killing cancer cells by apoptotic mechanism However, there has not been any scientific research on the use of this herbal formular for cancer treatment Therefore, this study was conducted with the objective of examining the cancer resistance of the herbal formular including Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd st Materials and Methods: The object of the study is aqueous extract of Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd in Soc Trang province Cell lines: MDA-MB 231 human breast cancer cells (ATCC), SKN-DZ neuroblastoma cells (supplied by Dr Akira Nakagawa) Flow cytometry method - BD FACS Canto II Result: Using concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (3.04 mg/ml) or (6.08 mg/ml), the number of apoptotic breast cancer cells is statistically significant different from the control lot Combining RA with extract of Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd diluted at ratio 1/5 (1.22 mg/ml) formed clusters only day 2, on day and day 10 cells separate and differentiate Comparing OCT4 and SOX2 markers between RA group and RA combination with extract of Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd group, had a statistically significant reduction of OCT4 and SOX2 Conclusion: If using the extract of Callisia fragrans Lindl and Hedyotis diffusa Willd concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (3.04 mg/ml) sufficiently lethal dose on breast cancer cell lines MDA-MB 231 If using concentrations of diluted extract at ratio 1/5 (1.22 mg/ml) combined with retionic acid will affect the differentiation of RA-resistant cancer cells (SKN-DZ cells) Key words: callisia fragrans lindl., hedyotis diffusa ưilld., apoptosis, flow cytometry method, differentiate thuốc có nguồn gốc thảo dược có khả ĐẶT VẤN ĐỀ kháng ung thư, tác dụng phụ nhiều Theo WHO, ung thư nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tại Việt thách thức quan trọng sức Nam nói chung tỉnh Sóc Trăng nói riêng, khoẻ cộng đồng kỷ 21(1,12) Tại Việt Nam dân gian lưu truyền kinh nghiệm sử dụng tỉ lệ ung thư ngày tăng Số ca mắc ung số thuốc Nam có tác dụng điều trị ung thư không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 thư thuốc kết hợp Lược vàng lên 126.000 năm 2010 Năm 2018, số ca mắc Bạch hoa xà thiệt thảo Cây Lược vàng có chứa tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa gần 70% trường hợp tử vong, tương đương methylanthraquinon Theo nhiều nghiên cứu, 115.000 ca Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia quercetin methylanthraquinon có khả vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư gây chết tế bào ung thư thông qua chế 151,4/100.000 dân Tỷ lệ loại ung thư phổ chết theo chương trình(4,8,9) Tuy nhiên, biến Việt Nam: ung thư gan 15,4%, ung thư chưa có nghiên cứu khoa học phổi 14,4%, ung thư dày 10,6%, ung thư vú thức thuốc Nam tỉnh Sóc Trăng, 9,2%, ung thư trực tràng 8,9%, ung thư khác nghiên cứu dược lý thực nghiệm 41,4% Do đó, việc nghiên cứu để tìm kiếm Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục phương thuốc điều trị hỗ trợ điều trị đối tiêu tìm kiếm chứng có giá trị khoa học với bệnh nhân ung thư cần thiết Vai trò khả kháng ung thư thuốc lược Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 vàng bạch hoa xà thiệt thảo thu thập tỉnh Sóc Trăng (ATCC), tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp tiến sĩ Akira Nakagawa) Mục tiêu nghiên cứu Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II) Khảo sát khả kháng ung thư cao chiết từ thuốc lược vàng bạch hoa xà thiệt thảo Mục đích phương pháp Cao chiết nước từ thuốc lược vàng bạch hoa xà thiệt thảo thu thập địa bàn tỉnh Sóc Trăng Flow cytometry kỹ thuật có khả đo đặc tính huỳnh quang quang học tế bào đơn hạt vi sinh vật, nhân nhiễm sắc thể chuẩn bị dung dịch lỏng chúng qua nguồn sáng Phương pháp chiết cao Quy trình thực Các dược liệu thu hái Sóc Trăng, vào tháng 10/2015, người thu hái ông Võ Văn Thành Niệm Tế bào cấy lên đĩa giếng với mật độ 3x105 tế bào/ml ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Giai đoạn Chiết dược liệu nước cất theo nguyên tắc sau: Bộ phận dùng: Lược vàng dùng toàn cây, Bạch hoa xà thiệt thảo dùng toàn Sau thu hái, dược liệu rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô Cân dược liệu khô theo tỷ lệ Lược vàng: Bạch hoa xà thiệt thảo = 2:3, tổng khối lượng thuốc kg Xay thô dược liệu Cho nước ngập mặt dược liệu Sắc (chiết nóng) nước nồi inox Thời gian nấu: nấu (2 lần) Giai đoạn Cô cao thuốc: Lọc dịch chiết bơng gòn qua phễu Cơ cách thủy dịch chiết Thu cao thuốc nồng độ 6,08 mg/ml Giai đoạn Bảo quản cao thuốc nhiệt độ 40C Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Dòng tế bào Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 84 Xử lý tế bào nhiều nồng độ ủ tủ ủ tế bào 24 Xử lý Trypsin thu cắn Đếm tế bào với mật độ 106 tế bào/ml Lấy thể tích có 106 tế bào thêm PBS lạnh Cắn phân tán ml Binding buffer 1X Chuyển 100 ul dung dịch vào ống nuôi cấy ml Nhuộm tế bào với hóa chất cho kiểm tra apoptosis (5 ul PE Annexin V μl 7-AAD) Vortex tế bào ủ vòng 15 phút bóng tối nhiệt độ phòng với hóa chất kiểm tra apoptosis Thêm 400 μl Binding buffer 1X vào ống trước kiểm tra với máy BD FACS Canto II Kiểm tra quy trình thử nghiệm kit Annexin V/PI flow cytometry Bộ kit AnexinV/PI giúp phát apoptosis dựa chế bắt đầu trình apoptosis tế bào chuyển màng phosphatidylserine (PS) từ mặt màng plasma bề mặt tế bào Khi bề mặt tế bào, PS dễ dàng phát cách nhuộm với Annexin V, protein có lực cao với PS Quy trình nhuộm bước 10 phút Phát phân tích phương pháp dòng chảy tế bào kính hiển vi huỳnh Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 quang Bộ kit phân biệt chết tế bào theo chu trình apoptosis chết tế bào ngẫu Nghiên cứu Y học nhiên hay hoại tử (necrosis) Hình Chiến lược gating sử dụng để đo lường apoptosis sử dụng Annexin V / PI kit apoptosis đạt chuẩn Các tế bào phân biệt với mảnh vụn (mảnh vỡ tế bào, màu đen) đặc tính phân Phương pháp thống kê tán phía trước phía bên chúng (side Số liệu nhập vào MS Excel 2010 xử scatter) mối liên hệ tương đối chúng với lý phần mềm thống kê SPSS 16.0 nhuộm Annexin V-APC Propidium iodide Sử dụng phép kiểm chi bình phương để so (PI) (thể cột phải cột dưới) Các tế bào sánh tỷ lệ, khác biệt có ý nghĩa thống kê sống (Annex-V – /PI–), tế bào giai p