bài viết nghiên cứu cao chiết nước của bài thuốc lá Đu đủ và Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng. Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp bởi tiến sĩ Akira Nakagawa). Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II).
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO THEO CHƯƠNG TRÌNH CỦA BÀI THUỐC LÁ ĐU ĐỦ VÀ BẠCH HOA XÀ THIỆT THẢO THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ Phạm Thị Bình Minh*, Khổng Lê Trường Giang**, Bùi Chí Bảo*, Trịnh Thị Diệu Thường* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Hiện nay, Việt Nam quốc gia khác giới có tỉ lệ ung thư ngày tăng (theo WHO) Tại Việt Nam, số ca mắc ung thư không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 ca năm 2010 Năm 2018, số ca ung thư mắc tăng lên khoảng 165.000 ca/96,5 triệu dân Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia vùng lãnh thổ, với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100 000 dân Do đó, việc nghiên cứu để tìm kiếm phương thuốc điều trị hỗ trợ điều trị ung thư cần thiết Tại tỉnh Sóc Trăng, người dân kinh nghiệm sử dụng thuốc kết hợp Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo để hỗ trợ điều trị ung thư Lá Đu đủ có chứa quercetin, Bạch hoa xà thiệt thảo có chứa methylanthraquinon Theo nhiều nghiên cứu, quercetin methylanthraquinon có khả gây chết tế bào ung thư thơng qua chế chết theo chương trình Tuy nhiên, đến chưa có nghiên cứu khoa học thuốc điều trị ung thư tỉnh Sóc Trăng Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu khảo sát khả kháng ung thư thuốc Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo Sóc Trăng Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu cao chiết nước thuốc Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập địa bàn tỉnh Sóc Trăng Dòng tế bào: Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 (ATCC), Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp tiến sĩ Akira Nakagawa) Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry - BD FACS Canto II) Kết quả: Sử dụng nồng độ thuốc pha loãng theo tỷ lệ 1/2 (75 µg/ml) (150 µg/ml) số lượng tế bào ung thư vú bị apoptosis khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Kết hợp cao chiết Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo pha lỗng theo tỷ lệ 1/5 (30 µg/ml) Retinoic acid (RA) cho thấy tạo cụm ngày thứ 2, ngày thứ ngày thứ 10 tế bào tách biệt hoá So sánh marker OCT4 SOX2 nhóm tế bào RA nhóm kết hợp RA với cao chiết Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo cho thấy có giảm biểu OCT4 SOX2 có ý nghĩa thống kê Kết luận: Đặc tính cao chiết thuốc Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo sử dụng nồng độ pha lỗng theo tỷ lệ 1/2 (75 µg/ml) đủ gây chết apoptosis dòng tế bào ung thư vú Nếu sử dụng nồng độ pha loãng theo tỷ lệ 1/5 (30 µg/ml) kết hợp với retionic acid đủ tác động đến biệt hóa tế bào ung thư kháng RA (tế bào SKN-DZ) Từ khoá: Lá đu đủ, Bạch hoa xà thiệt thảo, phương pháp dòng chảy tế bào, biệt hóa ABSTRACT EVALUATING ABILITY TO APOPTOSIS OF THE HERBAL FORMULAR CONSISTING OF CARICA PAPAYA L AND HEDYOTIS DIFFUSA WILLD IN SOC TRANG PROVINCE ON CANCER CELLS Pham Thi Binh Minh, Khong Le Truong Giang, Bui Chi Bao, Trinh Thi Dieu Thuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 192 – 200 Objectives: Currently, Vietnam as well as other countries in the world have been increasing cancer rates (according to WHO) In Vietnam, incidence of cancer has continuously increased, from 68,000 (in 2000) to * Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.BS Phạm Thị Bình Minh 192 **Trường ĐH Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh ĐT: 0386932527 Email: ptbminh@ump.edu.vn.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học 126,000 (in 2010) In 2018, incidence of cancer increased to about 165,000 cases/ 96.5 million people Vietnam ranked 99/185 countries and territories, with cancer incidence of 151.4/100,000 Therefore, research to seek treatment or support treatment for cancer is very necessary In Soc Trang province, residents use herbal formular consisting of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd to support cancer treatment Carica papaya L contains quercetin, Hedyotis diffusa Willd contains methylanthraquinone According to many studies, quercetin and methylanthraquinone are capable of killing cancer cells by apoptotic mechanism However, until now, there has not been any scientific research on this herbal formular for cancer treatment in Soc Trang province Therefore, this study was conducted with the objective of examining the cancer resistance of the herbal formular consisting of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd Methods: The object of the study is aqueous extract of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd in Soc Trang province Cell lines: MDA-MB 231 human breast cancer cells (ATCC), SKN-DZ neuroblastoma cells (were supplied by Dr Akira Nakagawa) Flow cytometry method - BD FACS Canto II Results: Using concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (75 µg/ml) or (150 µg/ml), the number of apoptotic breast cancer cells is statistically significant different from the control lot Combining RA with extract of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd diluted at ratio 1/5 (30 µg/ml) formed clusters only on day 2, on day and day 10 cells separate and differentiate Comparing OCT4 and SOX2 markers between RA group and RA combination with extract of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd group, had a statistically significant reduction of OCT4 and SOX2 Conclusion: If using the extract of Carica papaya L and Hedyotis diffusa Willd concentrations of diluted extract at ratio 1/2 (75 µg/ml) sufficiently lethal dose on breast cancer cell lines If using concentrations of diluted extract at ratio 1/5 (30 µg/ml) combined with retionic acid will affect the differentiation of RA-resistant cancer cells (SKN-DZ cells) Keywords: Carica papaya L., Hedyotis diffusa willd., flow cytometry method, differentiate cần thiết Vai trò thuốc có nguồn ĐẶT VẤN ĐỀ gốc thảo dược có khả kháng ung thư, tác Hiện nay, Việt Nam quốc gia dụng phụ nhà khoa học quan tâm khác giới đứng trước nhiều nguy nghiên cứu Tại Việt Nam nói chung tỉnh Sóc sức khỏe như: già hóa dân số, nhóm bệnh Trăng nói riêng với tinh thần “Nam dược trị tích tuổi, bệnh khơng lây thối hóa khớp, Nam nhân”, dân gian lưu truyền kinh đái tháo đường týp 2, tăng huyết áp, ung thư, nghiệm sử dụng số thuốc Nam có tác đột quỵ não, ngày tăng(1,14) Trong đó, theo dụng điều trị ung thư Trong đó, thuốc Đu thống kê WHO ung thư đủ Bạch hoa xà thiệt thảo cho có khả bệnh có tỉ lệ ngày tăng Việt Nam Số ca kháng ung thư nhờ thành phần quercetin mắc ung thư Việt Nam không ngừng đu đủ methylanthraquinon tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm Bạch hoa xà thiệt thảo(7,10,15) Tuy nhiên, 2010 Năm 2018, số ca mắc tăng lên gần chưa có nghiên cứu khoa học 165.000 ca/96,5 triệu dân, gần 70% thức thuốc Nam tỉnh Sóc Trăng, trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca nghiên cứu dược lý thực nghiệm Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia vùng lãnh Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục thổ với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100.000 dân Tỉ lệ tiêu tìm kiếm chứng có giá trị khoa học tử vong ung thư 104,4/100.000 dân, xếp vị khả kháng ung thư thuốc Đu đủ trí 56/185 quốc gia vùng lãnh thổ Do đó, việc Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập tỉnh nghiên cứu để tìm kiếm phương thuốc điều trị Sóc Trăng hỗ trợ điều trị bệnh nhân ung thư Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 193 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Mục tiêu nghiên cứu (ATCC), tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ (được cung cấp tiến sĩ Akira Nakagawa) Khảo sát khả kháng ung thư cao chiết từ thuốc Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Cao chiết nước từ thuốc Đu đủ Bạch hoa xà thiệt thảo thu thập địa bàn tỉnh Sóc Trăng Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm Từ 1/6/2016 đến 30/10/2016 Phương pháp chiết cao Các dược liệu thu hái Sóc Trăng, vào tháng 10/2015, người thu hái ông Võ Văn Thành Niệm Giai đoạn Chiết dược liệu nước cất theo nguyên tắc sau: Bộ phận dùng: Đu đủ dùng lá, Bạch hoa xà thiệt thảo dùng toàn Sau thu hái, dược liệu rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô Cân dược liệu khô theo tỷ lệ Đu đủ: Bạch hoa xà thiệt thảo = 2:3, tổng khối lượng thuốc kg Xay thô dược liệu Cho nước ngập mặt dược liệu Sắc (chiết nóng) nước nồi inox Thời gian nấu: Nấu (2 lần) Giai đoạn Cô cao thuốc: Lọc dịch chiết bơng gòn qua phễu Cơ cách thủy dịch chiết Thu cao thuốc nồng độ 150 µg/ml Giai đoạn Bảo quản cao thuốc nhiệt độ 40oC Dòng tế bào Tế bào ung thư vú người MDA-MB 231 194 Phương pháp dòng chảy tế bào (Flow cytometry) Giúp phát apoptosis Flow cytometry kỹ thuật có khả đo đặc tính huỳnh quang quang học tế bào đơn hạt vi sinh vật, nhân nhiễm sắc thể chuẩn bị dung dịch lỏng chúng qua nguồn sáng Quy trình thực Tế bào cấy lên đĩa giếng với mật độ 3x105 tế bào/ml Xử lý tế bào nhiều nồng độ ủ tủ ủ tế bào 24 Xử lý Trypsin thu cắn Đếm tế bào với mật độ 106 tế bào/ml Lấy tích có 106 tế bào thêm PBS lạnh Cắn phân tán ml Binding buffer 1X Chuyển 100 ul dung dịch vào ống nuôi cấy ml Nhuộm tế bào với hóa chất cho kiểm tra apoptosis (5 ul PE Annexin V μl 7-AAD) Vortex tế bào ủ vòng 15 phút bóng tối nhiệt độ phòng với hóa chất kiểm tra apoptosis Thêm 400 μl Binding buffer 1X vào ống trước kiểm tra với máy BD FACS Canto II Kiểm tra quy trình thử nghiệm kit Annexin V/PI flow cytometry Bộ kit AnexinV/PI giúp phát apoptosis dựa chế bắt đầu trình apoptosis tế bào chuyển màng phosphatidylserine (PS) từ mặt màng plasma bề mặt tế bào Khi bề mặt tế bào, PS dễ dàng phát cách nhuộm với Annexin V, protein có lực cao với PS Quy trình nhuộm bước 10 phút Phát phân tích phương pháp dòng chảy tế bào kính hiển vi huỳnh quang (Hình 1) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Hình Chiến lược gating sử dụng để đo lường apoptosis sử dụng Annexin V/PI kit (Annex-V–/PI+) Lô lặp lại từ thí nghiệm Tế bào apoptosis sớm: tế bào đối kiểm soát xứng màng huyết tương, phosphatidylserine (PS) chuyển từ bên bên Như vậy, kit AnexinV/PI giúp phát màng plasma apoptosis đạt chuẩn Tế bào apoptosis trễ: tế bào có màng tế bào Phương pháp thống kê nguyên vẹn Số liệu nhập vào MS Excel 2010 xử Các tế bào phân biệt với mảnh vụn (mảnh vỡ tế bào, màu đen) đặc tính phân tán phía trước phía bên chúng (side scatter) mối liên hệ tương đối chúng với nhuộm Annexin V-APC Propidium iodide (PI) (thể cột phải cột dưới) Các tế bào sống (Annex-V – /PI–), tế bào giai đoạn sớm trình apoptosis (Annexin-V+/ PI-), tế bào hoại tử trạng thái apoptosisp muộn (Annexin V+/PI+) Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền lý phần mềm thống kê SPSS 16.0, sử dụng phép kiểm chi bình phương để so sánh tỷ lệ, khác biệt có ý nghĩa thống kê p