Đánh giá khả năng ức chế của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt đến hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 và ung thư ruột kết SW480

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn suất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày và đặc biệt là ung thư máu (Moongkarndi et al. 2004; Kijjoa et al. 2008).

Hóa học & Kỹ thuật mơi trường ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA α-MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT ĐẾN HAI DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI LU-1 VÀ UNG THƯ RUỘT KẾT SW480 Lê Minh Trí*, Đồn Thanh Huyền, Ngơ Thị Thúy Phương Tóm tắt: Hoạt tính chống ung thư dẫn suất xanthone măng cụt đặc biệt quan tâm thời gian gần chúng có khả ức chế mạnh phát triển nhiều dòng tế bào ung thư khác ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dày đặc biệt ung thư máu (Moongkarndi et al 2004; Kijjoa et al 2008) Các nghiên cứu Ee cộng (Ee et al 2006; Ee et al 2008) phát thấy dịch chiết n-hexan chloroform rễ vỏ măng cụt có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu CEM- SS Pedraza cộng (Pedraza-Chaverri et al 2008b) dẫn xuất xanthone α-mangostin, γ-mangostin, mangostanol garcinone D có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư máu với giá trị IC50 4,7; 5,5; 9,6 3,2 µg/ml Từ khố: Măng cụt, Ung thư gan, Ung thư phổi,α-mangostin, γ-mangostin MỞ ĐẦU Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) trồng rộng rãi nhiều nước Malaysia, Indonesia, Philippines Campuchia.Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác tannin, chất nhựa (resin), pectin đặc biệt dẫn xuất xanthone, chất thuộc nhóm chất phenolic (Đỗ Tất Lợi 2000; Ee et al 2006 ) Các chất xanthone vỏ măng cụt xác định là: -mangostin, -mangostin, mangostin, isomangostin, normangostin, bên cạnh có trioxyxanthon, pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydroxy methyl butenyl xanthon, pyrano xanthenon Các chất garcinone A, B, C, D, E, mangostinon, garcimangoson A, B, C, gartanin, egonol, epicatechin, procyanidin, benzophenon glucosid phát với hàm lượng thấp Hoạt tính chống ung thư dẫn suất xanthone măng cụt đặc biệt quan tâm thời gian gần chúng có khả ức chế mạnh phát triển nhiều dòng tế bào ung thư khác ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dày đặc biệt ung thư máu (Moongkarndi et al 2004; Kijjoa et al 2008) Các nghiên cứu Ee cộng (Ee et al 2006; Ee et al 2008) phát thấy dịch chiết n-hexan chloroform rễ vỏ măng cụt có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu CEM- SS Pedraza cộng (Pedraza-Chaverri et al 2008b) dẫn xuất xanthone α-mangostin, γ-mangostin, mangostanol garcinone D có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư máu với giá trị IC50 4,7; 5,5; 9,6 3,2 µg/ml Nghiên cứu của Matsumoto cộng (Matsumoto et al 2003; Matsumoto et al 2004) phát thấy tác dụng xanthone hàng loạt tế bào ung thư máu nhiều dòng tế bào ung thư gan khác Các tác giả phát thấy có xanthone từ vỏ măng cụt có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào ung thư máu HL-60 người -mangostin có khả ức chế hoàn toàn nồng độ 10 µM Nhóm nghiên cứu Ho (Ho et al 2002a)lại phát thấy garcinone E có hoạt tính gây độc mạnh tế bào ung thư gan (hepatocellular carcinomas- HCC) dòng ung thư dày 134 L.M Trí, Đ.T Huyền, N.T.T Phương, “Đánh giá khả … ung thư ruột kết SW480 ” Nghiên cứu khoa học công nghệ Moongkarndi cộng (Moongkarndi et al 2004) phát thấy dịch chiết methanol vỏ măng cụt, phận có chứa nhiều - -mangostin, có khả gây độc tế bào ung thư thông qua việc cảm ứng trình apoptosis Cụ thể α- mangostin tinh nồng độ 20 µM có tác dụng cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư máu HL60 thơng qua việc làm thay đổi hình thái tế bào hay thông qua chế phụ thuộc capase-3 Với chế phụ thuộc capase-3, apoptosis việc tăng cường giải phóng endonuclease-G từ ti thể cảm ứng tăng cường biểu micro iARN có tên miR-143, nhờ làm giảm tín hiệu gây ung thư KRAS (Nakagawa et al 2007) Trong nghiên cứu khác, Nakatani cộng (Nakatani et al 2004) lại phát thấy -mangostin gây độc tế bào dòng ung thư não (glioma) chuột thơng qua việc ức chế hoạt tính kinase tổ hợp chất kìm hãm- kappaB, đồng thời làm giảm biểu gene cyclooxygenase-2, nhờ hạn chế trình phát triển khối u Gần đây, Akao cộng (Akao et al 2008 -b) sâu nghiên cứu chế gây độc tế bào xanthone phát thấy chúng liên quan trực tiếp đến việc làm dừng chu trình tế bào (cell cycle) với việc ức chế biểu cyclin cdc2 p2 Các tác giả phase G1 chu trình tế bào bị dừng hoạt động αmangostin and β-mangostin, phase S lại bị dừng hoạt dộng γ-mangostin Hơn nữa, tác giả rõ α-mangostin cảm ứng q trình apoptosis thơng qua việc hoạt hóa liên tiếp đường tín hiệu có tên MAP kinases serine/threonine kinase Akt Có thể thấy rằng, đích tác dụng lên tế bào ung thư xanthone cho ti thể Bằng chứng hình ảnh ti thể chụp kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rõ chúng bị tổn thương bị truơng lên, bị chức màng, bị giảm hàm lượng ATP nội bào, tích lũy nhiều ROS bị giảm hàm lượng cytochrome c/AIF giải phóng Nhìn chung, nghiên cứu cho thấy nhiều dẫn xuất xanthone từ măng cụt, đặc biệt mangostin, có tác dụng ức chế có hiệu phát triển nhiều dòng tế bào ung thư người khác thơng qua việc cảm ứng q trình apotosis Bên cạnh chế gây độc tế bào thông qua cảm ứng apoptosis, chất chống ung thư gây độc thơng qua việc tác động trực tiếp lên màng, qua làm ly giải tế bào Nhiều nghiên cứu chất phenol chứng minh chúng có khả tương tác với màng tế bào gây tổn thương màng (Greenberg et al 2008) Các nhóm OH phân tử chất đóng vai trò việc tạo liên kết với số trung tâm tương tác đặc hiệu kiểu receptor màng tế bào ung thư Khi tương tác hình thành làm thay đổi tính thấm màng, thay đổi cấu hình tạo lỗ thủng màng Kết trình ly giải tế bào xảy Mangostin chất thuộc nhóm phenolic có chứa gốc OH phân tử Chính gốc có vai trò thể hoạt tính sinh học chúng tương tác với màng tế bào Nakagawa cộng (Nakagawa et al 2007) phát thấy việc xử lý αmangostin 5-FU, chất điều trị ung thư ruột hiệu nay, nồng độ 2,5 µM có tác dụng tăng cường ức chế phân chia tế bào ung thư ruột dòng DLD-1 so với mẫu xử lý riêng rẽ chất nồng độ µM Tương tự, Akao cộng (Akao et al 2008 -b) nhận thấy α- mangostin có khả ngăn chặn ung thư thực nghiệm chuột hiêu đặc biệt có hiệu kết hợp với 5-FU để điều trị ung thư ruột Các tác giả cho dùng chất để phòng chống ung thư hay sử dụng dạng liệu pháp kết hợp với thuốc điều trị ung thư để nâng cao hiệu chữa trị Như vậy, việc sử dụng mangostin chất xanthone chất CAM cho bệnh nhân ung thư có triển vọng Trên thực tế, sản phẩm có chứa xanthone, đó, có mangostin, dạng thực phẩm chức Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 135 Hóa học & Kỹ thuật mơi trường nước ép trái măng cụt thị trường hóa để sử dụng với mục đích tăng cường sực khỏe, chống lão hóa cho người PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu: Vỏ măng cụt sử dụng dạng khô Nguyên liệu chiết dung môi: ethanol, ether petroleum, chloroform, ethylacetate, acetone cách ngâm nguyên liệu nhiều dung môi chiết hồi lưu socklet Các dòng tế bào ung thư:Được Viện kiểm nghiệm dược/ Bộ Y tế cung cấp thử nghiệm Bảng Danh sách hóa chất sử dụng thí nghiệm Tên hóa chất Hãng sản xuất (nước) Cao nấm men, peptone, tris-base ICN (Mỹ) Chromadex (Mỹ) Chất chuẩn - mangostin Dichlomethane, methanol, ethanol, ethyl Trung Quốc acetate, ether petroleum n-hexane, silica gel, EDTA Scharlau Chemie S.A (Châu Âu) Peroxidase chuẩn, 3,3´-5,5´ tetramethyl Sigma (Mỹ) benzidine Thiobarbituric acid Merck (Pháp) Huyết bò FBS (Fetal bovine serum), Atlanta Biological (Hoa kỳ) trypsin, EDTA Tất hóa chất sử dụng có độ tinh (PA) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế bào ung thư ni cấy dạng đơn lớp môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm mM L- glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) Tế bào cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả kìm hãm phát triển diệt tế bào ung thư (TBUT) điều kiện in vitro (Monks et al 1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) giá trị OD lớn Phép thử thực điều kiện cụ thể sau: Chất thử (10 l) pha DMSO 10% đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; g/ml; 0.8 g/ml Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào đếm buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm Thêm vào giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l mơi trường) để chúng phát triển vòng từ 3-5 ngày Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử có TBUT (180l) sử dụng làm đối chứng ngày Sau giờ, đĩa đối chứng ngày cố định tế bào Trichloracetic acid – TCA 136 L.M Trí, Đ.T Huyền, N.T.T Phương, “Đánh giá khả … ung thư ruột kết SW480 ” Nghiên cứu khoa học công nghệ Sau giai đoạn phát triển tủ ấm CO2, tế bào cố định vào đáy giếng TCA 30 phút, nhuộm SRB 37 oC Đổ bỏ SRB giếng thí nghiệm rửa lần 5% acetic acid để khô không khí nhiệt độ phòng Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB bám nhuộm phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ 10 phút sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết hàm lượng màu chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ bước sóng 515 nm Khả sống sót tế bào có mặt chất thử xác định thơng qua cơng thức sau: % sống sót = [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) Các phép thử lặp lại lần để đảm bảo tính xác Ellipticine (Sigma) sử dụng chất đối chứng dương thử nghiệm nồng độ 10 g/ml; g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml DMSO 10% sử dụng đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% phát triển) xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve Chất thử có IC50< 20 g/ml (với chất chiết thơ, với phân đoạn hóa học) IC50 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) xem có hoạt tính gây độc tế bào có khả ức chế phát triển diệt tế bào ung thư (Skehan et al 1990) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hoạt chất -mangostin tinh từ vỏ măng cụt Garcinia mangostana L Việt Nam làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, nghiên cứu chúng tơi tiến hành xác định khả diệt kìm hãm phát triển tế bào ung thư hoạt chất αmangostin hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 Với phương pháp mô tả trên, kết cụ thể trình bày bảng Bảng Kết nghiên cứu Nồng độ -mangostin % OD TB ức chế 100 ug/ml 0,089 101,96 20ug/ml 0,089 101,91 ug/ml 0,874 0,8 ug/ml IC50 (ug/ml) 30,19 ellipticine % OD TB ức chế 0,145 (10 ug/ml) 96,81 0,466 (2 ug/ml) 67,53 1,043 (0,4 ug/ml) 14,79 1,209 (0,08 ug/ml) -0,36 1,25 1,263 -5,34 5,54 DAY= 0,1102 Ghi chú: OD giá trị mật độ quang học; ODTB giá trị OD trung bình thí nghiệm lặp lại Kết bảng cho thấy với nồng độ hoạt chất g/ml, hoạt chất α-mangostin kìm hãm sinh trưởng phát triển dòng tế bào ung thư phổi LU-1 tương ứng 30% Khi nồng độ hoạt chất tăng lên 20 g/ml, ức chế hồn tồn sinh trưởng phát triển dòng tế bào ung thư phổi, đạt tương ứng 101% Trong đó, chất đối chứng dương ellipticine nồng độ 10g/ml ức chế 96,8% (bảng 3) Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 137 Hóa học & Kỹ thuật mơi trường Hoạt chất -mangostin có hoạt tính diệt ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 phát triển với giá trị IC50 thấp Mẫu mangostin thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 = 5,54 g/ml Bảng Ảnh hưởng α-mangostin lên phát triển tế bào ung thư ruột kết SW 480 Nồng độ -mangostin OD TB %ức chế 100 ug/ml 0,104 100,96 20 ug/ml 0,123 99,69 ug/ml 1,242 26,62 0,8 ug/ml IC50 (ug/ml) ellipticine OD TB %ức chế 0,144 (10 ug/ml) 98,30 0,680 (2 ug/ml) 63,30 1,345 (0,4 ug/ml) 19,88 1,639 (0,08 ug/ml) 0,69 1,29 1,781 -8,61 5,97 day = 0,1182 Ghi chú: OD giá trị mật độ quang học; OD TB giá trị OD trung bình thí nghiệm lặp lại a) Nồng độ 100 g/ml b) Nồng độ 20 g/ml c) Nồng độ g/ml Hình Khả ức chế tế bào ung thư SW 480 α-mangostin nồng độ khác Trên dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 nồng độ hoạt chất g/ml ức chế 26- 60%, tăng nồng độ hoạt chất lên 20 g/ml ức chế 99- 101% sinh trưởng phát triển dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 (bảng 3) Hoạt chất α - 138 L.M Trí, Đ.T Huyền, N.T.T Phương, “Đánh giá khả … ung thư ruột kết SW480 ” Nghiên cứu khoa học công nghệ mangostin có hoạt tính với giá trị IC50 thấp thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 = 5,97 g/ml Hình ảnh chụp kính hiển vi đo khả ức chế tế bào ung thư SW 480 α-mangostin minh họa hình a) Ở nồng độ 100 g/ml, b) Ở nồng độ 20 g/ml, c) Ở nồng độ g/ml Hoạt chất tinh khiết với giá trị IC50 g/ml, hoạt chất có tiềm diệt tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, hoạt chất γ-mangostin với giá trị IC50= 3,54 g/ml (tế bào LU-1) đạt giá trị IC50 = 3,22 g/ml (tế bào ung thư SW 480), chứng tỏ hoạt chất mangostin thể hoạt tính mạnh việc kìm hãm ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 với giá trị IC50 thấp Kết kính hiển vi điện tử khẳng định thêm khả diệt tế bào ung thư hoạt chất γ-mangostin sau 72 nuôi cấy nồng độ hoạt chất khác hai dòng tế bào ung thư này, nồng độ hoạt chất 20-100 g/ml sau 72 ức chế hoàn toàn sinh trưởng phát triển tế bào ung thư KẾT LUẬN Chế phẩm -mangostin thể hoạt tính mạnh việc kìm hãm ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 với giá trị tương ứng IC50 = 5,54 g/ml (đối với dòng tế bào ung thư phổi), với giá trị tương ứng IC50 = 5,97 g/ml (đối với dòng tế bào ung thư ruột kết SW480) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chin, Y.; Kinghorn, A.D Structural characterization, biological effects, and synthetic studies on xanthones from mangosteen (Garcinia mangostana), a popular botanical dietary supplement Mini Rev Org Chem 2008, 5, 355–364 [2] Yapwattanaphun, C.; Subhadrabandhu, S.; Sugiura, A.; Yonemori, K.; Utsunomiya, N Utilization of some Garcinia species in Thailand Acta Hort 2002, 575, 563–570 [3] Pedraza-Chaverri, J.; Cárdenas-Rodríguez, N.; Orozco-Ibarra, M.; Pérez-Rojas, J.M Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana) Food Chem Toxicol 2008, 46, 3227–3239 [4] Sloan, E.W Getting ahead of the curve: Phytochemicals Nutraceutical World 2010, 13, 16–17 Obolskiy, D.; Pischel, I.; Siriwatanametanon, N.; Heinrich, M Garcinia mangostana L.: A phytochemical and pharmacological review Phytother Res 2009, 23, 1047–1065 Nutrients 2013, 3180 [5] Walker, E.B HPLC analysis of selected xanthones in mangosteen fruit J Sep Sci 2007, 30, 1229–1234 [6] Bumrungpert, A.; Kalpravidh, R.W.; Suksamrarn, S.; Chaivisuthangkura, A.; Chitchumroonchokchai, C.; Failla, M.L Bioaccessibility, biotransformation, and transport of α-mangostin from Garcinia mangostana (mangosteen) using simulated digestion and Caco-2 human intestinal cells Mol Nutr Food Res 2009, 53 (Suppl 1), 54–61 [7] Gutierrez-Orozco, F.; Chitchumroonchokchai, C.; Lesinski, G.; Suksamrarn, S.; Failla, M α-Mangostin: Anti-inflammatory activity and metabolism by human cells J Agric Food Chem 2013, 61, 3891–3900 [8] Pinto, M.; Sousa, M.; Nascimento, M.S Xanthone derivatives: New insights in biological activities Curr Med Chem 2005, 12, 2517–2538 [9] Shan, T.; Ma, Q.; Guo, K.; Liu, J.; Li, W.; Wang, F.; Wu, E Xanthones from mangosteen extracts as natural chemopreventive agents: Potential anticancer drugs Curr Mol Med 2011, 11, 666–677 Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 51, 10 - 2017 139 Hóa học & Kỹ thuật môi trường [10].Li, L.; Brunner, I.; Han, A.R.; Hamburger, M.; Kinghorn, A.D.; Frye, R.; Butterweck, V Pharmacokinetics of α-mangostin in rats after intravenous and oral application Mol Nutr Food Res 2011, 55 (Suppl 1), 67–74 [11].Syamsudin, L.; Faizatun, L.; Rahayu, L HPLC analysis and pharmacokinetic study of mangostin after orally administration in rats T Pharm Res 2009, 2, 43–49 ABSTRACT STUDYING POSSIBILITY INHIBITION OF α - MANGOSTIN TO THE TWO LINES CELL LUNG CANCER AND SW480 The mangosteen (Garcinia mangostana) is a tropical fruit native to Southeast Asia and has long been reported to contain multiple health promoting properties This fruit is an abundant source of xanthones, a class of polyphenolic compounds with a distinctive tricyclic aromatic ring system and is largely responsible for its biological activities including anti-cancer activity In cell lung cancer, αMangostin was found to be the most potent with an IC50 value of 5.54 μg/ml and SW480 is 5.97 μg/ml Keywords: Lung cancer, α-mangostin Nhận ngày 07 tháng 12 năm 2016 Hoàn thiện ngày 10 tháng năm 2017 Chấp nhận đăng ngày 25tháng 10 năm 2017 Địa chỉ: Viện Hóa học Vật liệu/ Viện KH&CNQS * Emai: leminhtri1975@yahoo.com.vn 140 L.M Trí, Đ.T Huyền, N.T.T Phương, “Đánh giá khả … ung thư ruột kết SW480 ” ... chế tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 với giá trị tương ứng IC50 = 5,54 g/ml (đối với dòng tế bào ung thư phổi) , với giá trị tương ứng IC50 = 5,97 g/ml (đối với dòng tế bào. .. tính mạnh việc kìm hãm ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 với giá trị IC50 thấp Kết kính hiển vi điện tử khẳng định thêm khả diệt tế bào ung thư hoạt chất γ-mangostin... trợ điều trị ung thư, nghiên cứu tiến hành xác định khả diệt kìm hãm phát triển tế bào ung thư hoạt chất αmangostin hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 tế bào ung thư ruột kết SW480 Với phương