Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xác định được các mẫu vi khuẩn đối kháng từ đất có hiệu lực ức chế cao với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ớt, cũng như một số tác nhân gây bệnh cây nguy hiểm truyền qua đất bao gồm Phytophthora spp., Fusarium spp., Rhizoctonia sp. và S. rolfsii.
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH CÂY CỦA VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Hàn Việt Cường*, Hà Viết Cường Khoa Nông học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam *Tác giả liên hệ: mendeleep@gmail.com TĨM TẮT Sáu mẫu vi khuẩn phân lập từ đất ký hiệu HT1, N2, A15, HT7, MSV4 TL4 ức chế mạnh sinh trưởng nhiều nấm gây bệnh điều kiện in vitro Mẫu vi khuẩn HT1 N2 ức chế mạnh nấm Colletotrichum gloeosporioides, C truncatum, C fructicola, C siamense C aeschynomenes gây bệnh thán thư ớt với hiệu lực 84,1 % 84,1 %; 84,4 % 84,8 %; 84,4 % 83,3 %; 87,8 % 82,6%; 79,3 % 79,3 % Mẫu vi khuẩn HT1 N2 ức chế mạnh nấm Phytophthora capsici gây chết nhanh hồ tiêu, P citrophthora gây thối gốc rễ có múi, Rhizoctonia sp gây chết héo dưa chuột, Fussarium oxysporum f sp cubense race (Foc 1) Foc gây bệnh héo fusarium chuối Sclerotium rolfsii gây héo rũ gốc mốc trắng cà chua với hiệu lực 77,8 % 81,9 %; 81,5 % 83,0 %; 70,4 % 65,2 %; 70,4 % 76,7 %; 73,3 % 70,4 %; 76,7 % 82,6 % Mẫu vi khuẩn TL4 có khả sản xuất IAA, phân giải lân phân giải urê Mẫu vi khuẩn TL4, HT1 N2 kết hợp với mà không ức chế lẫn Phân tích trình tự gen 16S RNA ribosome cho thấy mẫu HT1 Alcaligenes faecalis mẫu N2 Achromobacter xylosoxidans Đây hai loài vi khuẩn đối kháng lần phát thấy Việt Nam Từ khóa: Achromobacter xylosoxidans N2, Alcaligenes faecalis HT1, nấm gây bệnh cây, vi khuẩn đối kháng ASSESSMENT OF INHIBITED ABILITY OF ANTAGONISTIC BACTERIA ISOLATED FROM SOILS AGAINST SOME FUNGAL PHYTOPATHOGENS Han Viet Cuong*, Ha Viet Cuong Faculty of Agronomy, Vietnam National University of Agriculture *Corresponding author: mendeleep@gmail.com ABSTRACT Six soil bacterial isolates assigned as HT1, N2, A15, HT7, MSV4 and TL4 showed high inhibition of the growth of several plant fungal pathogens in vitro The isolate HT1 and N2 showed the strongest inhibition to Colletotrichum gloeosporioides, C truncatum, C fructicola, C siamense, and C aeschynomenes causing chilli anthracnose disease with efficacy of 84.1 % and 84.1 %, 84.4 % and 84.8 %, 84.4 % and 83.3 %, 87.8 % and 82.6 %, and 79.3 % and 79.3, respectively The isolate HT1 and N2 also inhibited strongly Phytophthora capsici causing the quick death disease of black pepper, P citrophthora causing the root rot disease of citrus, Rhizoctonia sp causing the damping-off disease of cucumber, Fusarium oxysporum f sp cubense race (Foc 1) and Foc causing the fusarium wilt disease of banana and Sclerotium rolfsii causing the southern blight disease of tomato with inhibition efficacy of 77.8 % and 81.9 %, 81.5 % and 83.0 %, 70.4 % and 65.2 %, 70.4 % and 76.7 %, 73.3 % and 70.4 %, and 76.7 % and 82.6 %, respectively The isolate TL4 produced IAA, solubilized phosphate, and urea The TL4, HT1, and N2 could be mixed without inhibition to each other Based on 16S RNA ribosome gene sequence, the isolate HT1 and N2 were identified as Alcaligenes faecalis and Achromobacter xylosoxidans, respectively These two antagonistic bacterium species are identified in Vietnam for the first time Keywords: Achromobacter xylosoxidans N2, Alcaligenes faecalis HT1, antagonistic bacterium plant fungal pathogens 419 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 TỔNG QUAN Nhiều vi sinh vật đối kháng vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Serratia, Alcaligenes nấm Chaetomium, Trichoderma Saccharomyces chứng tỏ ức chế tiêu diệt tác nhân gây bệnh thông qua enzyme thủy phân, chất kháng sinh, chất ức chế mà chúng tiết cạnh tranh trực tiếp dinh dưỡng với tác nhân gây bệnh Đồng thời, việc sử dụng vi sinh vật đối kháng giúp chủ động bảo vệ trồng trước công bệnh hại biện pháp an tồn người mơi trường (Souto et al., 2004) Bệnh thán thư ớt gây phức hợp loài nấm Colletotrichum bệnh nguy hiểm ớt Bệnh hại chủ yếu trái ớt trưởng thành gây trở ngại lớn đến sản xuất ớt Biện pháp hóa học để phịng trừ bệnh thán thư ớt áp dụng rộng rãi phổ biến Tuy nhiên, nhiều thuốc hóa học bị cấm không sử dụng làm nấm bệnh trở nên kháng thuốc để lại tác động xấu đến môi trường Ở Việt Nam, số lượng công bố việc ứng dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh thán thư ớt cịn hạn chế chưa có cơng bố việc sử dụng vi khuẩn đối kháng để phịng trừ nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt Vì vậy, việc xác định chủng vi khuẩn có hiệu lực đối kháng cao làm phong phú thêm nguồn vi sinh vật đối kháng để ứng dụng phòng trừ nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt điều cần thiết Bên cạnh bệnh thán thư ớt, bệnh hại nguy hiểm có nguồn gốc đất gây thiệt hại nghiêm trọng cho trồng chủ lực Việt Nam bệnh chết nhanh hồ tiêu gây nấm Phytophthora capsici, bệnh héo fusarium chuối gây nấm Fusarium oxysporum f sp cubense, bệnh thối rễ có múi gây nấm Phytophthora spp., bệnh chết héo dưa chuột gây nấm Rhizoctonia sp., bệnh héo rũ gốc mốc trắng cà chua nấm Sclerotium rolfsii Phòng chống bệnh nấm truyền qua đất biện pháp hóa học thường khơng hiệu Chính vậy, biện pháp sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng phân lập từ đất xem biện pháp hiệu phịng Kỷ yếu khoa học chống nhóm tác nhân gây bệnh Nghiên cứu thực nhằm mục tiêu xác định mẫu vi khuẩn đối kháng từ đất có hiệu lực ức chế cao với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt, số tác nhân gây bệnh nguy hiểm truyền qua đất bao gồm Phytophthora spp., Fusarium spp., Rhizoctonia sp S rolfsii VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn nấm gây bệnh Mẫu nấm Colletotrichum gloeosporioides, C truncatum, C fructicola, C siamense C aeschynomenes gây bệnh thán thư ớt, P capsici gây bệnh chết nhanh hồ tiêu, P citrophthora gây thối rễ có múi, Rhizoctonia sp gây chết héo dưa chuột, F oxysporum f sp cubense race (Foc 1) gây bệnh héo fusarium chuối, Sclerotium rolfsii gây héo rũ gốc mốc trắng cà chua cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới (Học viện Nông nghiệp Việt Nam) Mẫu nấm F oxysporum f sp cubense race (TR-4) (Foc 4) gây bệnh héo fusarium chuối cung cấp TS Trần Ngọc Hùng (Viện Nghiên cứu rau quả, Trâu Qùy, Gia Lâm, Hà Nội) Phân lập vi khuẩn Vi khuẩn phân lập trực tiếp từ đất nhiệt độ thường từ đất sau xử lý nhiệt 80 oC theo mô tả Kumar et al (2012b) Đánh giá khả đối kháng vi khuẩn nấm gây bệnh Khả đối kháng vi khuẩn nấm gây bệnh thực phương pháp đồng nuôi cấy môi trường PDA theo mô tả Kumar et al (2012b) Hiệu lực ức chế nấm = 100 x (C – T)/C (%), với C đường kính tản nấm đối chứng (mm), T đường kính tản nấm thí nghiệm (mm) (Kumar et al., 2012b) Hoạt tính enzyme mẫu vi khuẩn Hoạt tính enzyme thủy phân xác định phương pháp đục giếng thạch theo mô tả Williams (1983) Dịch lọc vi khuẩn sau ly tâm dịch nuôi cấy 10 000 g oC 15 phút nhỏ vào lỗ đục môi trường chất cảm ứng enzyme cellulase (1% Carboxymethyl cellulose, 1,5% 420 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 agar), chitinase (1% keo chitin, 1,5% agar), amylase (0,2% tinh bột, 0,5% NaCl, 0,5% peptone, 2% agar) protease (0,2% gelatin, 2% agar) Đường kính vịng phân giải enzyme V= (D – d) (mm) (D: đường kính vịng phân giải giếng nhỏ dịch lọc vi khuẩn; d: đường kính lỗ thạch đục để nhỏ dịch) Hoạt tính enzyme urease thử nghiệm cách cấy khuẩn lạc vi khuẩn môi trường Christensen’s medium theo mô tả hãng HiMedia - M112S (Mumbai, India) Hoạt tính enzyme lipase thử nghiệm theo mô tả Kumar et al (2012a) Hoạt tính enzyme catalase thử nghiệm theo mơ tả Ramyasmruthi et al (2012) Khả tạo Indole- 3- aceticacid (IAA) vi khuẩn Sản phẩm IAA (Auxin) nhận theo phương pháp Gordon and Weber (1951) Sản phẩm siderophore Sản phẩm siderophore xác định môi trường Chrome- azurol S agar (CAS agar) theo phương pháp Schwyn and Neilands (1987) Khả phân giải lân (phosphate) vi khuẩn Khả phân giải phosphate mẫu vi khuẩn nhận cách cấy chấm điểm khuẩn lạc chúng môi trường National Botanical Research Institute’s Phosphate Solubilization-Bromophenol Blue medium (NBRIP) (Nautiyal, 1999) Khả sử dụng citrat làm nguồn cacbon vi khuẩn Các mẫu vi khuẩn cấy vào môi trường Simmon’s citrate agar ống thạch nghiêng ủ 28 ± oC 24- 48 h Ống thạch xuất màu xanh da trời xác nhận mẫu vi khuẩn có khả sử dụng citrat làm nguồn cacbon Xác định lồi vi khuẩn giải trình tự gen 16S RNA ribosome Danh tính vi khuẩn xác định việc giải trình tự gen mã hóa 16S RNA ribosome dùng cặp mồi 27f 1525r (Lane, 1991) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn Nghiên cứu sử dụng mẫu đất Kỷ yếu khoa học lấy vùng gốc rễ loại trồng để phân lập vi khuẩn 20 mẫu vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc đặc trưng làm môi trường PDA tiếp tục sử dụng cho thí nghiệm Sàng lọc mẫu vi khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm Kết sàng lọc 20 mẫu vi khuẩn phân lập với nấm C gloeosporioides C truncatum cho thấy mẫu vi khuẩn kí hiệu A15, TL4, N2, MSV4, HT1 HT7 có hoạt tính đối kháng đồng thời với nấm Vì vậy, mẫu vi khuẩn lựa chọn để tiếp tục đánh giá cụ thể hiệu lực ức chế loài Colletotrichum số nấm gây bệnh truyền qua đất Hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt Sáu mẫu vi khuẩn kí hiệu A15, TL4, N2, MSV4, HT1 HT7 ức chế mạnh nấm C gloeosporioides C truncatum, C fructicola, C siamense C aeschynomenes (Bảng 1, hình 1) Mẫu vi khuẩn khuẩn HT1 N2 ức chế nấm C gloeosporioides với hiệu lực cao đạt 84,1 % Hiệu lực cao so với hiệu lực chủng Pseudomonas fluorescens (58,3 %) báo cáo Ramyasmruthi et al (2012) chủng Bacillus subtilis (57 %) báo cáo Ashwini and Srividya (2014) Mẫu vi khuẩn N2 ức chế nấm C truncatum với hiệu lực cao đạt 84,8 % khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với hiệu lực ức chế nấm mẫu vi khuẩn HT1 (84,4 %) MSV4 (84,1 %) Hiệu lực ức chế nấm C truncatum mẫu HT1 N2 cao so với hiệu lực chủng Burkholderia glumae Serratia marcescens (61,8 % 35,8 %) báo cáo Begum et al (2008) Hiệu lực ức chế nấm bệnh truyền qua đất Sáu mẫu vi khuẩn A15, TL4, N2, MSV4, HT1 HT7 ức chế nấm P capsici, P citrophthora, Rhizoctonia sp., F oxysporum f sp cubense race (Foc 1), Foc Sc rolfsii (Bảng 1, hình 1) Mẫu MSV4 ức chế nấm P capsici với hiệu lực cao đạt 85,2 %, tiếp đến mẫu N2 với hiệu lực đạt 81,9 % mẫu HT1 với hiệu lực đạt 77,8 % Hiệu lực ức chế nấm P capsici mẫu MSV4, HT1 N2 cao so với hiệu lực chủng Ba subtilis (55 %) báo 421 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 cáo Ashwini and Srividya (2014) chủng Ps fluorescens (72 %) báo cáo Paul and Sarma (2006) Mẫu HT1 ức chế nấm Rhizoctonia sp với hiệu lực cao đạt 70,4 %, tiếp đến mẫu N2 MSV4 với hiệu lực 65,2 % 64,1% Hiệu lực ức chế nấm Rhizoctonia sp mẫu HT1, N2 MSV4 cao so với hiệu lực chủng Ps fluorescens (50 %) báo cáo Ramyasmruthi et al (2012) chủng Ba subtilis (42 %) báo cáo Ashwini and Srividya (2014) Hoạt tính enzyme đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Mẫu vi khuẩn TL4 khơng có hoạt tính enzyme cellulase, chitinase protease Mẫu vi khuẩn HT1, HT7, A15, N2 MSV4 có hoạt tính enzyme cellulase, chitinase, protease catalase (Bảng 2, hình 2) Kết cho thấy, chế đối kháng nấm bệnh mẫu vi khuẩn HT1, N2 có tác động enzyme chitinase cellulase giúp phân hủy chitin thành phần cấu tạo lên thành tế bào nấm Colletotrichum, Fusarium, Rhizoctonia Sclerotium cellulose thành phần cấu tạo lên thành tế bào loài Phytophthora Kết trùng với báo cáo Gomashe et al (2014) enzyme chitinase sản xuất vi sinh vật đối kháng giúp phân hủy chitin ức chế nấm S rolfsii Mẫu vi khuẩn TL4 N2 có khả phân giải urê sử dụng citrate làm nguồn cacbon Mẫu TL4 có khả tạo IAA phân giải lân Mẫu vi khuẩn HT1, N2, MSV4 TL4 có sản xuất siderophore để tạo phân tử liên kết Fe3+ (Bảng 2, hình 2) Hợp chất sản xuất mẫu vi khuẩn TL4 sau chiết xuất dung môi etyl acetat n-hexan ức chế phát triển nấm bệnh Mẫu vi khuẩn HT1, N2 TL4 kết hợp với mà không ức chế lẫn Định danh phân tử hai mẫu vi khuẩn HT1 N2 Phân tích trình tự gen 16S RNA Ribosome cho thấy mẫu HT1 thuộc loài Alcaligenes faecalis mẫu N2 thuộc loài Achromobacter xylosoxidans (tên cũ Alcaligenes xylosoxidans) Mẫu Al faecalis HT1 Ac xylosoxidans N2 Kỷ yếu khoa học tạo sản phẩm siderophore chế kháng lại nấm bệnh mẫu vi khuẩn ứng dụng đồng ruộng Kết tương đồng với báo cáo Moretti et al (2008) Mẫu A faecalis HT1 ức chế mạnh nhiều nấm gây bệnh khác Colletotrichum spp., Fusarium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia Sc rolfsii Kết tương đồng với báo cáo Santoa et al (2011) Al faecalis có phổ đối kháng rộng với nhiều nấm gây bệnh khác KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã xác định mẫu vi khuẩn Al faecalis (HT1) Ac xylosoxidans (N2), mẫu vi khuẩn kí hiệu A15, HT7, MSV4 TL4 có hiệu lực ức chế mạnh với nấm mặt đất gồm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt, số nấm gây bệnh nguy hiểm truyền qua đất bao gồm P capsici gây bệnh chết nhanh hồ tiêu, P citrophthora gây thối rễ có múi, Rhizoctonia sp gây chết héo dưa chuột, Foc Foc gây bệnh héo fusarium chuối S rolfsii gây héo rũ gốc mốc trắng cà chua Trong đó, Al faecalis Ac xylosoxidans hai loài vi khuẩn đối kháng lần phát thấy Việt Nam Mẫu vi khuẩn HT1 N2 sản xuất enzyme chitinase cellulase, hai enyzme biết đến enzyme quan trọng vi sinh vật đối kháng ức chế nấm gây bệnh Mẫu vi khuẩn TL4 không sản xuất enzyme chitinase cellulase Sản phẩm chiết xuất dịch lọc mẫu vi khuẩn dung môi etyl acetat n-hexan có khả ức chế nấm gây bệnh Mẫu vi khuẩn TL4 có khả sản xuất IAA (Auxin), phân giải lân phân giải đạm urê Ngoài ra, mẫu vi khuẩn TL4, Al faecalis HT1 Ac xylosoxidans N2 cịn kết hợp với mà không ức chế lẫn Đề nghị Định danh đến loài mẫu vi khuẩn TL4 Thử khả phối trộn mẫu TL4, HT1, N2 với kết hợp thêm số vi sinh vật đối kháng có thị trường để đánh giá hiệu lực phòng chống bệnh Phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh từ mẫu TL4, HT1, N2 422 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Lời cảm ơn Tác giả xin gửi lời cám ơn tới Trung tâm Nghiên cứu Bệnh Nhiệt đới (Học viện Kỷ yếu khoa học Nơng nghiệp Việt Nam) hỗ trợ kinh phí trang thiết bị để thực đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO ASHWINI, N & SRIVIDYA, S 2014 Potentiality of Bacillus subtilis as biocontrol agent for management of anthracnose disease of chilli caused by Colletotrichum gloeosporioides OGC1 Biotech, 4, 127-136 BEGUM, M., SARIAH, M., ABIDIN, Z., PUTEH, A & RAHMAN, M 2008 Antagonistic potential of selected fungal and bacterial biocontrol agents against Colletotrichum truncatum of soybean seeds Pertanica J Trop Agric Sci, 31, 45-53 GOMASHE ASHOK, V., SHEIKH NEHA, A & GULHANE PRANITA, A 2014 Production of Bioactive Compound by Bacillus subtilis and its antagonistic activity against Sclerotium rolfsii Int J of Life Sciences, 2, 127-133 GORDON, S A & WEBER, R P 1951 Colorimetric estimation of indoleacetic acid Plant physiology, 26, 192-195 KUMAR, D., KUMAR, L., NAGAR, S., RAINA, C., PARSHAD, R & GUPTA, V K 2012a Screening, isolation and production of lipase/esterase producing Bacillus sp strain DVL2 and its potential evaluation in esterification and resolution reactions Arch Appl Sci Res, 4, 1763-70 423 ... Phân lập vi khuẩn Vi khuẩn phân lập trực tiếp từ đất nhiệt độ thường từ đất sau xử lý nhiệt 80 oC theo mô tả Kumar et al (2012b) Đánh giá khả đối kháng vi khuẩn nấm gây bệnh Khả đối kháng vi khuẩn. .. thời với nấm Vì vậy, mẫu vi khuẩn lựa chọn để tiếp tục đánh giá cụ thể hiệu lực ức chế loài Colletotrichum số nấm gây bệnh truyền qua đất Hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán... Ở Vi? ??t Nam, số lượng công bố vi? ??c ứng dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh thán thư ớt cịn hạn chế chưa có cơng bố vi? ??c sử dụng vi khuẩn đối kháng để phòng trừ nấm Colletotrichum gây bệnh