Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn từ dịch chiết một số thực vật thu thập tại lào

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Kitsamone Sihavong ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT MỘT SỐ THỰC VẬT THU THẬP TẠI LÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Kitsamone Sihavong ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT MỘT SỐ THỰC VẬT THU THẬP TẠI LÀO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.Nguyễn Quang Huy Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội người Thày trực tiếp giao đề tài hướng dẫn Tôi tận tình, cho kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực hiện, hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Phó Hiệu trưởng trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN nhắc nhở động viên vượt qua khó khăn thời gian lưu học sinh Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội truyền thụ kiến thức vô quý báu suốt trình học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quan nơi công tác, Bộ khoa học công nghệ Lào tạo điều kiện cho học tập Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị học viên cao học em sinh viên thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh đặc biệt ThS Nguyễn Cửu Nguyệt Huế, ThS Lê Huy Hoàng, sinh viên Đỗ Thị Hải Anh chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện để thực đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình bạn bè ký túc xá Mễ Trì chỗ dựa tinh thần vững nguồn động viên sống suốt trình học tập Hà Nội, ngày 09 tháng 03 năm 2016 Học viên Kitsamone Sihavong MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi sinh vật gây bệnh ngƣời 1.1.1 Cơ chế gây bệnh vi khuẩn 1.1.2 Một số vi khuẩn gây bệnh người 1.2 Khả kháng khuẩn thực vật 10 1.2.1 1.3 Cơ chế kháng khuẩn thực vật 11 Tình hình nghiên cứu thực vật có khả kháng khuẩn 17 CHƢƠNG 26 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên liệu 26 2.1.1 Chủng vi sinh vật 26 2.1.2 Mẫu thực vật nghiên cứu 26 2.1.3 Hóa chất 27 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn 27 2.2.2 Tách chiết hợp chất thực vật thứ sinh dịch chiết 28 2.2.3 Xác định khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch 30 2.2.4 Nghiên cứu định tính thành phần số hợp chất tự nhiên có dịch chiết thực vật 31 2.2.5 Định lượng polyphenol tổng số dịch chiết mẫu thực vật 32 2.2.6 Định lượng Flavonoids tổng số dịch chiết mẫu thực vật 32 2.2.7 Phân tách thành phần chất thực vật thứ sinh mẫu 33 2.2.8 Phương pháp xác định khả quét gốc tự DPPH 33 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƢƠNG 35 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Quy trình tách chiết phân đoạn từ mẫu thực vật 35 Kết sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cao chiết mẫu thực vật 36 3.2.1 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết mẫu n-Hexan 36 3.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết mẫu thực vật Ethanol 80%37 3.2.3 Kết hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cao chiết Ethyl acetat39 3.3 Kết định tính loại hợp chất mẫu thực vật 42 3.3.1 Cây Sầu đâu (Azadirachta indica A.Juss.var) 42 3.4 Kết định lƣợng flavonoid tổng số mẫu thực vật 44 3.5 Kết định lƣợng polyphenol tổng số 45 3.5.1 Hàm lượng polyphenol dịch chiết Sầu đâu 46 3.5.2 Hàm lượng polyphenol dịch chiết Núc nác 47 3.6 Phân tách chất Sầu đâu núc nắc sắc ký mỏng 48 3.7 Kết xác định khả quét gốc tự DPPH 50 MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt EPEC : Enteropathogenic Escherichia coli ETEC : Enterotocigenic Escherichia coli EIEC : Enteroinvasive Escherichia coli EHEC : Enterohaemorrhagic Escherichia coli OMP : Outer membrane protein EA : Ethyl acetate EtOH : Ethanol MetOH : methanol TLC : Thin layer chromatography TEAF : toluen: Ethyl acetat: axeton: axit formic DPPH : Diphenyl picrylhydrazyl ĐC : Đối chứng ĐCEA : Đối chứng Ethyl acetat DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên thƣờng gọi loại sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 3.1 Hiệu suất tách chiết phân đoạn hợp chất tự nhiên từ mẫu thực 36 Bảng 3.2 Kế hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Croton, trinh nữ, tầm gửi, nhàu 38 Bảng 3.3 Kết hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết ethnol 80% 39 Bảng 3.4 Đƣờng kính vòng kháng khuẩn cao chiết Ethyl acetate 41 Bảng 3.5 Kết thử định tính chất Sầu đâu 44 Bảng 3.6 Kết thử định tính số chất Núc nác (Oroxylum indicum Linn.) 44 Bảng 3.7 Kết xây dựng đƣờng chuẩn theo chất chuẩn Quercetin 45 Bảng 3.8 Kết định lƣợng flavonoid mẫu thực vật 46 Bảng 3.9 Tỉ lệ dung dịch kết xây dựng đƣờng chuẩn axit galic 47 Bảng 3.10 Hàm lƣợng polyphenol tổng số từ dịch chiết Sầu đâu 48 Bảng 3.11 Hàm lƣợng polyphenol tổng số từ dịch chiết Núc nác 48 Bảng 3.12 Kết thử hoạt tính quét gốc tự DPPH mẫu thực vật 50 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Escherichia coli Hình 1.2 Vi khuẩn Bacillus cereus Hình 1.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis… 10 Hình 1.5 Nhóm hợp chất glycoside 12 Hình 1.6 Axit gallic 13 Hình 1.7 Flavan (2-phenyl chroman) 14 Hình 1.8 Nhóm flavonoid 14 Hình 1.9 Nhóm Tannins 15 Hình 1.10 Nhóm hợp chất alkaloids 16 Hình 1.11 Cây sƣơng sâm 18 Hình 1.12 Cây Tầm gửi 19 Hình 1.13 Cây Sầu đâu 20 Hình 1.14 Cây Cù đèn 21 Hình 1.15 Cây Trinh nữ 21 Hình 1.16 Cây Nhàu 22 Hình 1.17 Cây Muồng đen 24 Hình 1.18 Cây Keo dậu 26 Hình 1.19 Cây Núc nác 23 Hình 2.1 Quy trình thu dịch chiết cao chiết mẫu thực vật n-Hexan 29 Hình 2.2 Quy trình thu dịch chiết cao chiết mẫu thực vật Ethanol 80% 30 Hình 2.3 Quy trình thu dịch chiết cao chiết mẫu thực vật ethyl acetate 31 Hình 3.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn mẫu cao n-Hexan thực vật chủng B subtilis B cereus 38 Hình 3.2 Khả kháng B subtilis dịch chiết Ethyl acetate 41 Hình 3.3 Khả kháng B subtilis dịch chiết etyl acetate 42 Hình 3.4 Khả kháng E coli dịch chiết 42 Hình 3.5 Khả kháng B.cereus dịch chiết 42 Hình 3.6 Kết thử định tính số chất Sầu đâu 44 Hình 3.7 Kết định tính số chất Núc nác 45 Hình 3.8 Đƣờng đồ thị chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo quercetin 46 Hình 3.9 Đồ thị đƣờng chuẩn axit gallic 47 Hình.3.10 Hệ số Rf sắc kí mỏng cao chiết Sầu đâu 49 Hình 3.11 Hệ số Rf sắc kí mỏng cao chiết Núc nác 50 MỞ ĐẦU Ngày nay, đời sống kinh tế xã hội ngƣời ngày đƣợc nâng cao vấn đề chăm sóc sức khoẻ ngƣời ngày đƣợc quan tâm ý Các ứng dụng khoa học đại y học giúp sàng lọc nhiều loại thuốc đặc trị bệnh trƣớc đƣợc xem bệnh nan y Không dừng lại chữa trị, nhà khoa học sâu tìm hiểu nguyên nhân, chế bệnh để đƣa phƣơng pháp điều trị tối ƣu Hiện nay, nhiều loại kháng sinh tổng hợp có hiệu cao việc chữa trị bệnh vi sinh vật gây đƣợc sản xuất với quy môi công nghiệp Tuy nhiên việc lạm dụng sử dụng kháng sinh tổng hợp làm gia tăng khả kháng kháng sinh vi sinh vật số kháng sinh tổng hợp chƣa nhiều Do đó, việc phát hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ tự nhiên trở thành hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm ứng dụng điều trị bảo vệ sức khỏe [1] Việc sử dụng loại thuốc nguồn gốc tự nhiên không giúp cho việc bảo vệ chăm sóc sức khỏe mà có tác dụng bảo vệ môi trƣờng Trong số sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, hợp chất tách chiết từ thực vật đƣợc quan tâm đặc biệt số lƣợng chất lƣợng Từ lâu, nhiều hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật nhƣ gừng, bạc hà… đƣợc sử dụng thuốc dân gian để điều trị Ngày nay, với phát triển khoa học việc xác định hoạt chất thực vật dùng làm thuốc chứng minh hiệu từ kinh nghiệm chữa bệnh dân gian Bằng kết thực nghiệm, nhà khoa học số hợp chất đặc biệt chất thứ sinh có giá trị chữa bệnh, ức chế phát triển vi sinh vật gây bệnh Quercetin chè xanh, măng cụt, có tác dụng diệt khuẩn, chữa sâu mà không độc với ngƣời Silymarin kê có tác dụng chống oxi hoá ngăn ngừa phát triển tế bào ung thƣ Catechin có nhiều loài thực vật ngăn chặn làm chậm phát triển tế bào khối u Lào quốc gia Đông Nam Á có khí hậu thảm thực vật phong phú đa dạng, dân tộc Lào có truyền thống lâu đời sử dụng loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh Để góp phần nghiên cứu tách chiết xác định bƣớc đầu thử hoạt tính Luận văn thạc sĩ Kisamone SIHAVONG tƣơng tự với mẫu khả kháng chủng E coli tốt với đƣờng kính vòng kháng khuẩn 18mm Khả kháng khuẩn mẫu cao chiết thực vật so sánh với mẫu thực vật với nghiên cứu đƣợc công bố với chủng vi khuẩn kiểm định tƣơng tự [15, 17] Tuy nhiên, kết thu đƣợc chƣa đƣợc ý nghiên cứu Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu với mẫu thực vật tƣơng tự 3.2.3 Kết hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cao chiết Ethyl acetat Tƣơng tự với thí nghiệm nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cao chiết dịch chiết mẫu thực vật dung môi n-Hexan Ethanol 80%, kết kháng khuẩn dịch chiết mẫu thực vật Ethyl acetate thể khả kháng khuẩn Tiếp tục cô cạn dung môi Ethyl acetate, thu hồi cao chiết, kết kháng khuẩn cao chiết thực vật dung môi Ethyl acetate đƣợc thể bảng 3.4 Các mẫu cao chiết cho kết kháng khuẩn tốt với đƣờng kính kháng khuẩn rõ ràng Luận văn thạc sĩ 39 Kisamone SIHAVONG Bảng 3.4 Khả kháng khuẩn cao chiết Ethyl acetate Khả kháng khuẩn Tên mẫu Ký hiệu (mm) mẫu E coli Sƣơng sâm Tầm gửi Sầu đâu B cereus B subtilis S aureus 0 0 4 9 Croton 5 Trinh nữ 0 Cây nhầu 0 Muồng đen 0 Keo đậu 18 Núc nác 10 10 12 11 Bảng 3.4 hình 3.2, 3.3, 3.4 3.5 kết thể khả kháng khuẩn 7/9 mẫu dịch chiết thực vật đƣợc chiết Ethyl acetate có khả kháng lại chủng E coli, 4/9 mẫu dịch chiết thực vật có khả kháng lại chủng B cereus, 5/9 mẫu dịch chiết thực vật có khả kháng lại chủng B subtilis, 7/9 mẫu dịch chiết thực vật có khả kháng lại chủng S aureus Hình 3.2 Khả kháng B subtilis dịch chiết Ethyl acetate Chú thích: giếng 1: dịch chiết sương sâm, giếng 3: dịch chiết tầm gửi, giếng 4: dịch chiết Sầu đâu, giếng (+): đối chứng dương, giếng ĐCEA: đối chứng âm Ethyl acetat Luận văn thạc sĩ 40 Kisamone SIHAVONG Hình 3.3 Khả kháng B subtilis dịch chiết etyl acetate Chú thích: giếng dịch chiết Sầu đâu, giếng 9: dịch chiết Keo đậu, giếng 10: dịch chiết Núc nác, giếng (-): đối chứng dương EA, giếng (+): đối chứng dương B subtilis Hình 3.4 Khả kháng E coli dịch chiết Chú thích: giếng 5: dịch chiết Croton, 6: dịch chiết Trinh nữ, 7: dịch chiết Cây nhầu, giếng 8: dịch muồng đen, (+): đối chứng dương E.coli, (-): đối chứng âm Ethyl acetat Hình 3.5 Khả kháng B.cereus dịch chiết Chú thích giếng 1: dịch chiết sương sâm, 3: dịch chiết Tầm gửi, 4: dịch chiết Sầu đâu, giếng (+): đối chứng dương B.cereus, giếng (-): đối chứng âm Ethyl acetate Luận văn thạc sĩ 41 Kisamone SIHAVONG Kết thử khả kháng khuẩn dịch chiết cao chiết mẫu thực vật đƣợc thu hái từ Lào nhận thấy dịch chiết cao chiết mẫu thực vật Sầu đâu, croton Núc nác có khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định Tuy nhiên dịch chiết cao chiết Sầu đâu Núc nác có khả kháng khuẩn mạnh đồng (cây Núc nác có khả kháng vi khuẩn thể khả kháng khuẩn từ 5-12mm; Sầu đâu có khả kháng khuẩn từ 4-9mm) Dựa kết sàng lọc, lựa chọn hai mẫu dịch chiết Núc nác Ethanol dịch chiết Sầu đâu ethyl axetat để tiếp tục tiến hành thí nghiệm định lƣợng chất thứ vật thứ sinh, phân tách hợp chất thứ sinh thông qua sắc ký mỏng thử hoạt tính quét gốc tự DPPH 3.3 Kết định tính loại hợp chất mẫu thực vật Với kết nghiên cứu kháng khuẩn đƣợc thực lần cho kết kháng khuẩn tốt với cao chiết loại thực vật Sầu đâu Núc nác Trong thực tế tự nhiên loài Núc nác Sầu đâu đƣợc sử dụng để chữa nhiều loại bệnh nhƣ: sốt rét, tả, nhiễm trùng, mụn nhọt… nhƣng việc sử dụng dựa kinh nghiệm dân gian Để nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết, thực thí nghiệm khảo sát có mặt số hợp chất thứ cấp có dịch chiết hai loài 3.3.1 Cây Sầu đâu (Azadirachta indica A.Juss.var) Kết nghiên cứu định tính thành phần polyphenols, flavonoid glycoside từ dịch chiết mẫu Sầu đâu đƣợc trình bày bảng 3.5 Đối với phản ứng định tính polyphenol, flavonoid, glycoside bảng 3.5 cho thấy: Cả loại dịch chiết Sầu đâu dung môi khác thể có mặt polyphenol, flavonoid glycoside Dịch chiết Sầu đâu Ethanol 80% thể có mặt rõ ràng polyphenol dịch chiết nHexan Ethyl acetate thể yếu Dịch chiết Sầu đâu Ethyl acetate thể có mặt rõ ràng flavonoid glycoside loại dịch chiết lại thể phản ứng màu chƣa rõ Bảng 3.5 Kết thử định tính chất Sầu đâu Nhóm chất Luận văn thạc sĩ Thuốc thử Cao chiết 42 Kisamone SIHAVONG n-Hexan Polyphenol Ethanol 80% Ethyl acetate NaOH + + + FeCl3 + +++ + Flavonoid H2SO4 đặc + + +++ Glycoside Keller-Killian - + ++ Chú thích: + : có phản ứng, ++ phản ứng chƣa mạnh, +++ phản ứng mạnh, - phản ứng Hình 3.6 Kết thử định tính số chất Sầu đâu 3.3.2 Cây Núc nác (Oroxylum indicum Linn.) Kết nghiên cứu định tính thành phần polyphenols, flavonoid glycoside từ dịch chiết mẫu Núc nác đƣợc trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Định tính số chất Núc nác (Oroxylum indicum Linn.) Cao chiết thực vật Nhóm chất Thuốc thử Polyphenol NaOH 10% + ++ + FeCl3 1% + + +++ Flavonoid H2SO4 đặc + + ++ Glycoside Keller-Killian + _ + n-Hexan Ethanol 80% Ethyl acetat Chú thích: + có phản ứng, ++ phản ứng chƣa cao, +++ phản ứng mạnh, - phản ứng Luận văn thạc sĩ 43 Kisamone SIHAVONG Hình 3.7 Kết định tính số chất dịch chiết Núc nác Cả loại dịch chiết thực vật dung môi n-Hexan, Ethyl acetate, Ethanol 80% thể có mặt loại nhóm chất polyphenol, flavonoid, glycoside cho kết định tính rõ rệt Dịch chiết Núc nác Ethanol 80% cho kết định tính polyphenol trong n-Hexan Ethyl acetate cho phản ứng màu Dịch chiết Núc nác Ethyl acetate cho phản ứng màu định tính flavonid hiệu 3.4 Kết định lƣợng flavonoid tổng số mẫu thực vật Từ kết phần định tính nhóm chất mẫu thực vật, mẫu thực vật thể có mặt rõ ràng flavonoid polyphenol, tiến hành định lƣợng polyphenol tổng số flavonoid tổng số mẫu thực vật Để xác định flavonoid tổng số mẫu thực vật, tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn chất chuẩn quercetin: Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn quercetin với nồng độ xác 25, 50, 100 200 mg/l (bảng 3.5 hình 3.8) Bảng 3.7 Kết xây dựng đƣờng chuẩn theo chất chuẩn Quercetin Nồng độ Quercetin (mg/l) Độ hấp thụ quang A510nm (Abs) Luận văn thạc sĩ 25 50 100 200 0,145 0,270 0,448 0,997 44 Kisamone SIHAVONG Hình 3.8 Đƣờng đồ thị chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Quercetin Dựa vào đƣờng chuẩn với phƣơng trình tuyến tính hồi quy xác định flavonoid toàn phần theo quercetin, flavonoid Kết bảng 3.8 trình bày hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc mẫu thực vật nghiên cứu Bảng 3.8 Kết định lƣợng flavonoid mẫu thực vật Khối lƣợng Hàm lƣợng flavonoids toàn phần tính mẫu (g) theo quercetin (%) Sầu đâu 2,188 Núc nác 1,278 Tên mẫu Hàm lƣợng flavonoid tính theo quercetin nằm khoảng từ 1%-2%, riêng Croton có hàm lƣợng flavonoid thấp 0,158%, Tầm gửi có hàm lƣợng flavonioid cao 4,403% Kết thể tƣơng quan phù hợp với kết nghiên cứu khả kháng khuẩn đƣợc lựa chọn Hàm lƣợng hợp chất kháng khuẩn thuộc nhóm flavonoid tƣơng ứng với khả kháng khuẩn với chủng vi sinh vật kiểm định với Sầu đâu hàm lƣợn flavonoid 2,19% Núc nác có hàm lƣợng flavonoid tƣơng ứng 1,28% 3.5 Kết định lƣợng polyphenol tổng số Trong mẫu dịch chiết chứa tƣơng đối nhiều nhóm hợp chất thứ sinh, nhóm hợp chất thứ sinh đƣợc nghiên cứu có nhiều ứng dụng polyphenol Tiến hành định lƣợng polyphenol tổng số mẫu Luận văn thạc sĩ 45 Kisamone SIHAVONG nghiên cứu theo phƣơng pháp Folin–Ciocalteu xây dựng đƣờng chuẩn với chất chuẩn axit galic (bảng 3.9) Bảng 3.9 Tỉ lệ dung dịch kết xây dựng đƣờng chuẩn axit galic STT V dung dịch gốc (l) Vnước (l) Nồng độ axit galic (mg/l) 100 0,02 99 10 0,139 98 20 0,244 97 30 0,38 96 40 0,49 95 50 0,614 OD765nm Từ kết đo độ hấp thụ dung dịch mẫu chuẩn axit gallic với nồng độ khác nhau, xây dựng đƣờng đồ thị axit gallic chuẩn 0.7 y = 0.118x - 0.101 R² = 0.999 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10độ axit20 30 Nồng Galic (mg/l) 50 (Nồng độ axit Galic (mg/l)) Linear 40 Hình 3.9 Đồ thị đƣờng chuẩn axit gallic Đƣờng chuẩn axit galic xác định hàm lƣợng polyphenol mẫu thực vật thông qua phƣơng trình y = 0,1188x – 0,1014 (độ tin cậy R2 = 0,9992) 3.5.1 Hàm lượng polyphenol dịch chiết Sầu đâu Bằng phƣơng pháp Folin-Ciocalteau, tiến hành định lƣợng polyphenol từ loại dịch chiết từ Sầu đâu (bảng 3.10) Bảng 3.10 Hàm lƣợng polyphenol tổng số từ dịch chiết Sầu đâu Luận văn thạc sĩ 46 Kisamone SIHAVONG STT % hàm lƣợng/cao khô Dịch chiết thực vật OD765nm n-Hexan 0,04 2,19 Ethanol 80% 0,203 10,56 Ethyl acetat 0,156 8,16 Nồng độ polyphenol mẫu thực vật tồn dịch chiết, cao chiết n-Hexan, Ethanol, Ethyl axetat nhƣng với tỷ lệ khác Trong hàm lƣợng polyphenol dịch chiết Ethanol 80% cao 10,56%, cao chiết ethyl axetat 8,16%, cuối thấp hàm lƣợng polyphenol cao chiết n-Hexan 2,19% Kết hòan tòan trở thành sở giải thích cho kết kháng vi khuẩn thực với cao chiết, dịch chiết Sầu đâu tƣơng ứng, khả kháng vi khuẩn cao chiết Ethanol 80% tốt nhất, sau giảm dần từ dịch chiết ethyl axetat, n- hexan 3.5.2 Hàm lượng polyphenol dịch chiết Núc nác Với mẫu từ dịch chiết Núc nác tiến hành tƣơng tự thu đƣợc kết thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Hàm lƣợng polyphenol tổng số từ dịch chiết Núc nác % hàm lƣợng/cao khô STT Dịch chiết thực vật OD765nm n-Hexan 0,05 2,27 Ethanol 80% 0,231 10,81 Ethyl acetate 0,131 7,96 Kết định lƣợng polyphenol cho % hàm lƣợng polyphenol/ khối lƣợng cao khô mẫu Núc nác cho kết tƣơng tự nhƣ Sầu đâu Tất cao chiết thực vật dung môi n-Hexan, Ethanol 80% Ethyl axetat chứa hàm lƣợng polyphenol nhƣng hàm lƣợng khác Cụ thể, hàm lƣợng polyphenol cao chiết Ethanol 80% lớn (10,81%) giảm dần tới cao ethyl axetat (7,96%) cuối cao n-Hexan (2,27%) Kết cho thấy khả kháng vi khuẩn Núc nác, hay hàm lƣợng polyphenol tổng số cho tác dụng kháng khuẩn tập trung cao chiết Ethanol 80% Với kết nghiên cứu trên, cao chiết Ethanol 80% Sầu đâu Núc nác đƣợc sử dụng nghiên cứu đánh giá có mặt chất Luận văn thạc sĩ 47 Kisamone SIHAVONG (Quercetin) phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng khả chống gốc oxi hóa tự DPPH 3.6 Phân tách chất Sầu đâu núc nắc sắc ký mỏng Để khảo sát thành phần hóa học phân lập chất có mẫu thí nghiệm, xác định nhóm chất có hoạt tính kháng khuẩn sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Mẫu cao thu đƣợc từ phân đoạn dịch chiết đƣợc tiến hành chạy sắc kí silicagel Hệ dung môi đƣợc sử dụng TEAF với tỷ lệ tƣơng ứng (Toluen: Ethyl acetat: Acetone: Axit Formic) 5:3:1:1 Hiện màu H2SO4 10% Chất chuẩn Quecertin Kết thu đƣợc hình 3.9 3.10 Rf = 0,7 Rf = 0,65 Rf = 0,6 Hình.3.10 Hệ số Rf sắc kí mỏng cao chiết Sầu đâu Kết chạy sắc ký mỏng TLC Sầu đâu cho phân đoạn gần với vị trí Rf quercetin với Rf = 0,65 Rf = 0,7 (hình 3.9) Rf= 0,8 Rf= 0,73 Rf= 0,7 Hình 3.11 Hệ số Rf sắc kí mỏng cao chiết Núc nác Luận văn thạc sĩ 48 Kisamone SIHAVONG Tiến hành chạy sắc ký cao chiết Núc nác thu đƣợc băng trùng với băng quercetin (Rf = 0,8 Rf = 0,73 so với Rfquercetin = 0,7) Các vạch chất có màu sắc độ đậm nhạt khác chứng tỏ dịch chiết có nhiều chất flavonoid Các kết thành phần chất thứ cấp dịch chiết Núc nác Sầu đâu chƣa đƣợc công bố Việt Nam Kết xác định khả quét gốc tự DPPH 3.7 Xác định khả quét gốc tự DPPH, dựa nguyên tắc 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả tạo gốc tự bền dung dịch methanol Khả quét gốc tự mẫu vitamin C, mẫu dịch chiết Sầu đâu Núc nác cho kết dƣơng tính Khả quét gốc tự tốt tƣơng ứng với mức độ hấp thụ bƣớc sóng 517nm thấp Với nồng độ chất tăng dần làm giảm mức độ hấp thụ màu bƣớc sóng 517nm Kết thử hoạt tính mẫu thực vật đƣợc so sánh với chất chuẩn vitamin C đƣợc thể bảng 3.12 Bảng 3.12 Kết thử hoạt tính quét gốc tự DPPH mẫu thực vật Tên mẫu Nồng độ thử nghiệm (µg/ml) IC50 1000 750 500 250 Vitamin C 89,69 82,38 20,89 17,49 2,59 Sầu đâu 54,57 20,50 15,80 10,44 1,01 Núc nác 53,52 39,43 22,06 26,63 0,21 Khả quét gốc tự mẫu dịch chiết Sầu đâu Núc nác thể làm giảm khả hấp thụ thấp vitamin C (2,59) Mặc dù kết chống gốc tự DPPH nghiên cứu trƣớc vitamin C thể số IC50 lớn (IC50 = 9,52) [19, 28] Tuy nhiên kết IC50 mẫu thử nghiệm bị ảnh hƣởng tạp chất nhiễu có mẫu nghiên cứu Luận văn thạc sĩ 49 Kisamone SIHAVONG KẾT LUẬN Qua nghiên cứu thực đề tài, thu đƣợc kết luận Đã nghiên cứu khả kháng khuẩn từ dịch chiết dung môi loài thực vật thu thập từ Lào Dịch chiết với dung môi Ethanol Núc nác dịch chiết Ethyl axetat Sầu đâu thể hoạt tính kháng với vi sinh vật kiểm định tốt so với dịch chiết lại Đã xác định hợp chất thứ sinh có dịch chiết dung môi Núc nác Sầu đâu gồm polyphenols, glycoside flavonoids Trong hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo quercetin Sầu đâu 2,2% Núc nác 1,3%; hàm lƣợng polyphenol tổng số chiếm từ 2,2% đến 10,8% dịch chiết khác Sầu đâu Núc nác Bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho thấy dịch chiết Ethyl axetat Sầu đâu có băng dịch chiết Ethanol Núc nác có băng tƣơng ứng gần với băng quercetin chuẩn Bƣớc đầu xác định đƣợc khả quét gốc tự DPPH mẫu thực vật: Sầu đâu với IC50 = 1,01 µg/ml, Núc nác với IC50 = 0,21µg/ml KIẾN NGHỊ Tinh nghiên cứu hoạt tính nhóm chất có Sầu đâu Núc nác Nghiên cứu khả chống oxi hóa mẫu thực vật Luận văn thạc sĩ 50 Kisamone SIHAVONG TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Văn Tạo (1997) “Bệnh E.coli gây Những thành tựu nghiên cứu phòng chống bệnh vật nuôi, tài liệu giảng dạy sau đại học cho bác sĩ thú y kỹ sƣ chăn nuôi” Viện thú y quốc gia, tr 207-210 Lƣơng Đức phẩm 1998, Công nghiệp thực phẩm 1998, Nhà xuất khoa học ky thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Văn Đức, Đặng Hồng Mai, Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1996) Sinh lý học gia súc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Nhƣ Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hƣơng (1997), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 81-84 Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1978), “Bệnh truyền nhiễm gia súc”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy, (2001) Thuốc biệt dược cách sử dùng, Nhà xuất Y học Tổng kết tình hình nuôi trồng thủy sản năm 2002, Báo cáo Bộ Thủy sản Trần Linh Thƣớc (2002), “Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật nƣớc, thực phẩm mỹ phẩm” NXB Giáo dục Tiếng Anh 10 Agrawal P.K and Bansal M C 1989, Flavonoid glycosides In: Carbon-13 NMR of Flavonoids (P.K.Agrawal, ed), 283-285 11 Antolovich M, Prenzler P, Robards K, Ryan D 2000, “Sample preparation in the determination of phenolic compounds in fruits”, Analyst, 215: 989-1009 12 Bowen W H., 1972, “Dental caries”, Archives of Disease in Childhood, 47: 849 13 Cannell R J P 1989, “Natural Products Isolation”, Humana Press, pp 354 Luận văn thạc sĩ 51 Kisamone SIHAVONG 14 Cuyckens, F, Claeys, M, 2004 Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids J Mass Spectrom 39: 1-15 15 Cushnie T.P., Lamb A.J, 2005, “Antimicrobial activity of flavonoids”, Int J Antimicrob Agents, 26: 343-356 16 Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM 2000, “Exotoxins of Staphylococcus aureus” Clin Microbiol Rev., 13: 16-34 17 Erdogrul O.T., 2002, “Antibacterial activities of some plant extracts used in folk medicine”, Pharm Biol, 40: 269–273 18 Harbonne J B., 1994, “The flavonoids advance in research since 1986”, Chapman and Hall, pp 1-676 19 Hashem F.A., 2007, “Investigation of free radical scavenging activity by ESR for coumarins isolated from Tecoma radicans”, J Med Sci., 7(6):1027-1032 20 Hoffmaster, A., Hill, K., Gee, J., Marston, C., De, B., Popovic, T., Sue, D., Wilkins, P., Avashia, S., Drumgoole, R., Helma, C., Ticknor, L., Okinaka, R., and Jackson 2006, J “Characterization of Bacillus cereus Isolates Associated with Fatal Pneumonias: Strains Are Closely Related to Bacillus anthracis and Harbor B anthracis Virulence.” J Clin Microbiol 44(9): 3352-3360 21 Karamali Khanbabaee, Teunis, Ree, 2001, “Tannins: Classfication and Dèinition”, Nat.Prod.Rep, 18: 641-649 22 Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H (1997) “Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks” Clin Microbiol Rev 10: 505-20 23 L.R Fukumoto, G Mazza 2000, Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds J.Agric Food Chem 48: 3597-3604 24 Nilubon J-A, Megh BR, Kawabata J 2006, “Alpha-Glucosidase inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris)”, Food Chemistry, 103: 1319-1323 25 Orskov, F 1998, “Vilurence Factor of the bacterial cell surface”, J Infect., pp 630 26 Pace N.R., 2006 “Time for a change” Nature 441(7091): 289 Luận văn thạc sĩ 52 Kisamone SIHAVONG 27 Panlilio AL, Culver DH, Gaynes RP, Banerjee S, Henderson TS, Tolson JS, 1992, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in U.S hospitols, 1975-1991 Infect Control Hosp Epidemiol, 13:1123-1125 28 Patel Rajesh M., Patel Natvar J 2011, “In vitro antioxidant activity of coumarin compounds by DPPH, Super oxide and nitric oxide free radical scavenging methods”, J Adv Phar Edu Res, pp 52-68 29 Rence J G., Tetsusok, 2000, “Plant – fungal interaction the search for phytoalexin and other antifungal compounds from higher plants” Phytochemistry, 56: 253-263 30 Richard J Comi 1996, “Drug-induced diabetes”, Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven, New York, 491 – 495 31 Ronald Khan C.2000, “The pathogenesis of type non-insulin-dependent diabetes”, Atlats of diabetes, 71-81 32 Sirichai.A, Kasem.S, Sophon R, Amorn P, Nattaya N, Warinthorn, C, Sujitra D and Sirintorn, 2004, “Structure-actitivity relationship of transcinnamic acid derivatives on alpha-gucosidase inhibition”, Bioorganic Med.Chem Lett., 14: 2893-2896 33 https://vi.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli 34 https://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_cereus 35 https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus 36 http://www.thucaz.net/bacillus-subtilis Luận văn thạc sĩ 53 Kisamone SIHAVONG [...]...kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh của các chất thứ sinh có trong một số loài thực vật phổ biến ở Lào, chúng tôi lựa chọn đề tài: Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn từ dịch chiết một số thực vật thu thập tại Lào với mục đích tách chiết và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết đến khả năng phát triển của một số chủng vi sinh vật gây bệnh Luận... bằng nhân đôi, tùy thu c điều kiện môi trƣờng mà thời gian nhân lên của chúng khác nhau Luận văn thạc sĩ 3 Kisamone SIHAVONG Kháng lại thực bào: tùy vào đặc tính của từng loài vi sinh vật, từng loại kháng nguyên của chúng mà các chủng vi sinh vật có thể chống lại sự thực bào của hệ thống miễn dịch trong cơ thể vật chủ [26] 1.1.1.2 Tạo độc tố Độc tố vi khuẩn là những chất của vi khuẩn tạo ra có tác... vi sinh vật hay vi khuẩn có hại cho con ngƣời nhƣng một số lại có lợi nhƣ các loại vi khuẩn có trong đƣờng tiêu hóa chúng giúp hỗ trợ quá trình hấp thu thức ăn, sản xuất vitamin và tăng cƣờng miễn dịch [1] 1.1.1.1 Độc tính với các tính chất như kết dính, nhân lên và phát triển Kết dính: bƣớc quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa vi khuẩn và vật chủ là sự bám dính của chúng lên bề mặt vật. .. mặt tế bào vật chủ, vi khuẩn có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu nhƣ tăng sinh, tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các tín hiệu của tế bào vật chủ [26] Nhân lên và phát triển: sau khi xâm nhập vào vật chủ vi sinh vật gây bệnh có thể sống ký sinh nội bào hoặc ký sinh ngoại bào, và chúng sử dụng dinh dƣỡng của cơ thể vật chủ để tạo năng lƣợng phục vụ cho các hoạt động sống Vi khuẩn sinh... Một số vi khuẩn gây bệnh ở người 1.1.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Là một nhóm vi khuẩn sống trong đƣờng tiêu hóa (ruột) của ngƣời và động vật (hình 1.1) Trong đƣờng tiêu hoá E coli chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%), hầu hết các chủng E coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong vi c ổn định sinh lý đƣờng ruột Tuy nhiên có 4 nhóm vi khuẩn E coli có khả. .. sinh vật khác nhau ở một nồng độ nhỏ Những tính chất này có thể khác nhau tùy thu c vào cấu trúc hóa học của các nhóm chất nhƣ alkaloid, tannin, flavonoid, tinh dầu…[3] 1.2.1 Cơ chế kháng khuẩn của thực vật Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do... Vi khuẩn phát triển trong môi trƣờng hiếu khí tuy nhiên nó vẫn có thể phát triển trong môi trƣờng thiếu oxy Nhiệt độ tối ƣu của vi khuẩn là 37oC, pH thích hợp là 7-7,4[9] Hình 1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis (B subtilis) [36] B subtilis cũng sản sinh một chất độc gọi là subtilisin Subtilisin có thể gây ra phản ứng dị ứng nếu có tiếp xúc lặp đi lặp lại ở nồng độ cao [9] 1.2 Khả năng kháng khuẩn của thực. .. TÀI LIỆU 1.1 Vi sinh vật gây bệnh đối với con ngƣời 1.1.1 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Vi khuẩn là các sinh vật đơn bào có hình dạng và hoạt động đơn giản do chúng chƣa có màng nhân Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp mọi nơi, sống trong mọi khí hậu và vị trí trên trái đất, trong không khí, nƣớc hoặc đất Nhiều vi sinh vật gây hại cho sức khỏe, chúng là tác nhân gây nên các bệnh nhƣ vi m da, vi m màng não... loài thực vật mà chỉ tập trung ở một số ít loài, chủ yếu đƣợc tìm thấy trong các loài thực vật có hoa, nhƣng chỉ có khoảng 20% số loại thực vật có hoa là có thể sản sinh ra alkaloids Đa số alkaloids không có mùi, vị đắng, một số ít có vị cay, ở dạng chất rắn có màu trắng, trừ một vài chất có màu vàng (berberin, palmatin) [30] Về vai trò sinh học, các alkaloids bảo vê chống sự tấn công của vi sinh vật. .. thấu Ức chế chức năng của màng tế bào Gồm có: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lƣợng lớn và các ion bị thoát ra ngoài Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế