Nghiên cứu này được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của các chất đối kháng chọn lọc trên thụ thể CCK-A, CCK-B, các chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK trên dòng tế bào ung thư phổi C38 và ung thư ruột kết MAC16.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu SO SÁNH TÁC ĐỘNG KHÁNG KHỐI U GIỮA CÁC CHẤT ĐỐI KHÁNG THỤ THỂ CHOLECYSTOKININ (CCK) TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI BIỂU MÔ C38 VÀ UNG THƯ RUỘT KẾT MAC16 Nguyễn Thị Thùy Anh*, Eric Lattmann** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cholecystokinin (CCK) biết đến hormon đường ruột giúp điều hoà tiết enzym tuyến tụy CCK gây tăng sinh nhiều dòng tế bào ung thư (dạ dày, đại tràng, tụy, phổi, não) Vì vậy, nhiều nghiên cứu riêng lẻ tác động chống ung thư chất đối kháng CCK thực Tuy nhiên, tranh toàn cảnh hiệu tác động chất đối kháng CCK dòng tế bào ung thư khác chưa hoàn thiện Mục tiêu: Nghiên cứu tiến hành nhằm so sánh hiệu chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-A, CCK-B, chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK dòng tế bào ung thư phổi C38 ung thư ruột kết MAC16 Phương pháp: Tỉ lệ tế bào sống đánh giá thử nghiệm MTT Chuột cấy ghép khối u MAC16 uống chất thử nghiệm Kích thước khối u đo ngày ngày Kết quả: Thử nghiệm in vitro dòng tế bào ung thư phổi C38 cho thấy giá trị IC50 chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-B (PNB-001) không chọn lọc thụ thể CCK (Bz) không khác biệt mặt thống kê Đồng thời giá trị thấp 3,3 lần so với chất chuẩn 5-fluorouracil Thử nghiệm in vivo cho thấy tính ức chế tăng trưởng khối u chất đối kháng thụ thể CCK không chọn lọc (F-Bz) cao chất lại dòng tế bào ung thư ruột kết MAC16 Kết luận: Các chất kháng CCK-B chất kháng CCK không chọn lọc gây độc tế bào ung thư phổi C38 có chất kháng CCK khơng chọn lọc có tác dụng ức chế phát triển khối u ruột kết MAC16 in vivo Từ khoá: cholecystokinin, ung thư phổi, ung thư ruột kết ABSTRACT COMPARISON OF THE ANTI-TUMOR EFFECT AMONG CHOLECYSTOKININ RECEPTOR ANTAGONISTS (CCK) ON C38 LUNG CANCER CELL LINE AND MAC16 COLON CANCER CELL LINE Nguyen Thi Thuy Anh, Eric Lattmann * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 24 - No - 2020: 79 - 84 Background: Cholecystokinin (CCK) is known as an intestinal hormone that helps regulate pancreatic enzyme secretion CCK induces the proliferation of cancer cell lines (stomach, colon, pancreas, lung, brain) Therefore, various individual studies on the anti-neoplastic effect of CCK antagonists have been conducted However, a comprehensive picture of the effect of CCK antagonists on different cancer cell lines has not been completed Objectives: The aim of this study was to compare the effectiveness of selective CCK-A, CCK-B receptor antagonist, non-selective CCK receptor antagonist on C38 lung cancer cell line and MAC16 colon cancer cell line Methods: Cell viability was determined by MTT test The mice were injected with MAC 16 tumor and were administered test substances Tumor size was measured every day for days *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ** Khoa Dược lý, Đại học Aston, Anh Tác giả liên lạc: ThS Nguyễn Thị Thùy Anh B - Khoa học Dược ĐT: 0917934957 Email: thuyanh@ump.edu.vn 79 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 24 * Số * 2020 Results: The in vitro IC50 values of selective CCK-B antagonist (PNB-001) and non-selective CCK antagonist (Bz) were not statistically different These values were 3.3 times lower than that of the standard 5fluorouracil in C38 cell line In vivo, the anti-tumor effect of non-selective CCK antagonist (F-Bz) was higher than that of other antagonists in MAC16 colon cancer Conclusions: Selective CCK-B receptor antagonists and non-selective CCK antagonists have superior antitumor activity than others on the C38 lung cancer cell line and colon cancer cell line, respectively Key words: cholecystokinin, lung cancer, colon cancer ung thư phổi ruột kết Tuy nhiên, liệu ĐẶT VẤNĐỀ pháp gây tác dụng phụ nghiêm Cholecystokinin (CCK) phát lần trọng(7) Gastrin yếu tố tăng trưởng có tác đầu tác nhân gây co thắt túi mật vào dụng sinh học tương tự với CCK phát năm 1928 CCK không hoạt động với nồng độ tăng cao ung thư phổi hormon đường ruột giúp điều hoà tiết enzym ung thư đại trực tràng Các thụ thể CCK-B tuyến tụy mà yếu tố tăng trưởng tìm thấy hầu hết mẫu ung thư chất điều biến thần kinh(1) CCK gây tăng sinh phổi không phát sinh thiết phổi khỏe mạnh Ngược lại, thụ thể CCK-A nhiều dòng tế bào ung thư ung thư dày, tìm thấy nhiều ung thư ruột kết(8) Vì đại tràng, tụy, phổi, não(2,3) Vì vậy, chất đối vậy, nghiên cứu thực nhằm so kháng thụ thể CCK xem tác nhân sánh tác động chống khối u chất đối chống ung thư có triển vọng kháng chọn lọc thụ thể CCK-A, CCK-B Thụ thể CCK phân loại tập trung không chọn lọc thụ thể CCK dịng tế bào chủ yếu đường tiêu hóa (CCK-A) não ung thư phổi C38 ung thư ruột kết MAC16 hỗ (CCK-B) Cả hai thụ thể CCK-A B thuộc trợ việc xác định mục tiêu nghiên cứu thuốc họ G-Protein Coupled Receptor (GPCR) Các ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU GPCR tham gia vào nhiều trình khác Các chất thử nghiệm ung thư như: tạo mạch máu, viêm tăng Các hợp chất với vòng pyrazolon giúp cải sinh tế bào Đáng ý hơn, GPCR cầu thiện khả dụng sinh học đường uống với trọng nối ung thư viêm Thật vậy, tăng biểu lượng phân tử thấp (xấp xỉ 300 Da) log P COX-2 viêm mạn tính liên quan chặt chẽ đến tiến triển khối u Ví dụ, chất ức chế COX-2 làm giảm nguy tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại tràng(4) Các chất đối kháng CCK sử dụng nghiên cứu có tác động chống viêm, đóng góp vào tác dụng chống ung thư chúng(5) Ding cộng (2002) phát biến thể quan trọng thụ thể CCK-B có mơ ác tính, khơng có mơ bình thường Những thụ thể gọi thụ thể CCK-C/ cancer receptor, diện chúng tìm thấy mơ ung thư đại tràng, tuỵ(6) Liệu pháp kép sử dụng platinum 5-fluorouracil liệu pháp hoá trị tiêu chuẩn cho 80 khoảng 3, bao gồm IB chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-A, PNB-001 chất đối kháng chọn lọc thụ thể CCK-B, Bz F-Bz chất đối kháng không chọn lọc thụ thể CCK F-Bz Bz nghiên cứu q trình tối ưu hố mối liên quan cấu trúc tác động Trong đó, thêm nhóm halogen (F, Cl) lên vịng (Tại vị trí X Hình 1) giúp tăng lực liên kết, có lẽ tăng tính thân dầu(9) Cơng thức hợp chất trình bày Hình Các chất pha lỗng từ dung dịch mẹ có nồng độ 10 mM DMSO/H2O (3:1) Chất đối chứng sử dụng 5-fluorouracil B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 IB Nghiên cứu PNB-001 Bz (X = H) F-Bz (X = F) Hình Các hợp chất vịng pyrazolon dùng thử nghiệm Hố chất – Dung mơi Phương pháp nghiên cứu Môi trường Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Fetal Bovine Serum (FBS), môi trường RPMI-1640, thuốc thử 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromua (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), 5-fluorouracil (5-FU) từ Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ NaCl 0,9%, penicilin, streptomycin, dầu ô liu cung cấp phịng thí nghiệm Sinh học Dược lý, Bộ môn Dược lý, Đại học Aston, Anh Nghiên cứu khả ức chế tăng sinh tế bào ung thư in vitro thử nghiệm MTT Dòng tế bào Dịng tế bào ung thư phổi biểu mơ C38 (ATCC CRL-2779), dịng tế bào ổn định có nguồn gốc từ tế bào IB3-1, mua từ American Type Culture Collection (ATCC) Dịng tế bào ni cấy môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) FBS, 1% L-glutamin-penicilin-streptomycin (SigmaAldrich, Hoa Kỳ) bình 75 cm2, 250 ml 37°C, 5% CO2 cấy chuyền đạt độ bão hòa 80% Dòng tế bào MAC16 nhận từ Tiến sĩ Eric Lattmann (Bộ môn Dược lý, Đại học Aston, Anh) Động vật thử nghiệm Chuột nhắt Naval Medical Research Institute (NMRI) chủng (6 - tuần tuổi) ni cho lai dịng phịng thí nghiệm dược lý thuộc đại học Aston, Anh Chuột ni ổn định điều kiện bình thường với chu kỳ sáng/tối = 12 giờ/12 giờ, nhiệt độ từ 18-23 oC, cho ăn theo chế độ RM3E (Lillco-Anh) uống nước tự B - Khoa học Dược Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào ung thư in vitro thử nghiệm MTT Thí nghiệm thực đĩa 24 giếng Cho ml dịch chứa tế bào (10.000 tế bào) vào giếng ủ 48 Sau đó, thêm vào giếng hợp chất thử nghiệm với nồng độ tăng dần (1 – 100 µM) mẫu chứng với dung mơi pha chất thử nghiệm (DMSO/H2O = 3/1) Mỗi nồng độ thực giếng Các tế bào giếng ủ 24 để đánh giá độc tính tế bào hợp chất thử nghiệm Thuốc thử MTT 50 µL bơm vào giếng ủ Tiếp đó, 500 µL DMSO cho vào giếng ủ Độ hấp thu giếng đo bước sóng 570 nm máy Elisa Plate Reader với đĩa 96 giếng(10) Đánh giá tác động ức chế phát triển khối u in vivo Tiêm khối u Khối u MAC16 lấy từ chuột cho, chia thành nhiều mảnh lập phương có kích thước khoảng mm nhúng vào NaCl 0,9% bổ sung streptomycin (2 mg/ml) penicillin (2000 U/ml) Những mảnh cấy da vào vùng bẹn bên phải chuột thử nghiệm tiêm trocar với thể tích 0,2 ml Tỉ lệ chuột mang khối u đạt 100% tổng số chuột tiêm Tác dụng phụ thường gặp cấy ghép khối u MAC16 suy giảm trí nhớ giảm cân dần chuột dù không giảm lượng thức ăn, tượng loét khối u gặp hơn(11) 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 24 * Số * 2020 Các nhóm thử nghiệm Phân tích thống kê Thử nghiệm tiến hành khối u đạt kích thước tối thiểu 100 mm3 (khoảng 10 ngày sau tiêm) Những chuột mang khối u phân ngẫu nhiên thành nhóm (mỗi nhóm chuột) gồm nhóm chứng bệnh nhóm điều trị chất thử nghiệm sau: F-Bz, IB, PNB-001 Các chất thử nghiệm phân tán đồng dầu ô liu cho chuột uống liều 200 mg/kg Chuột cân trọng lượng đo kích thước khối u ngày ngày thước kẹp điện tử Thể tích khối u suy từ cơng thức: (chiều dài × chiều rộng2)/ Tác động chống khối u xác định gia tăng thể tích khối u theo thời gian thử nghiệm nhóm điều trị chất thử nghiệm so với nhóm chứng bệnh Thử nghiệm chấp thuận Uỷ ban Đạo đức sinh học Đại học Aston Các kết trình bày dạng trung bình ± SD liệu xác định thống kê cách sử dụng phương pháp phân tích ANOVA với p < 0,05 KẾT QUẢ Độc tính tế bào chất đối kháng CCK dòng tế bào C38 Tất hợp chất thử nghiệm gây độc tế bào phụ thuộc liều, đặc biệt PNB-001 Bz Tỉ lệ sống sót tế bào tỉ lệ thuận với độ hấp thu Độc tính tế bào cao hợp chất đạt nồng độ 100 µM với độ hấp thu thấp (khoảng 0,3) thấp đáng kể so với nhóm đối chứng (p < 0,05) (Hình 2) Các giá trị IC50 PNB-001 Bz thấp đáng kể so với 5-FU (3,3 lần) (p 0,05) (Bảng 1) Hình Độ hấp thu theo nồng độ chất đối kháng CCK khảo sát Bảng Các giá trị IC50 cho chất khảo sát sử dụng thử nghiệm MTT IC50 (μM, Khoảng tin cậy 95%) 5-FU 60,1 ± 18,6 Thử nghiệm in vivo dòng tế bào ung thư ruột kết MAC16 Trong thời gian ngày, nhóm chuột điều trị chất đối kháng CCK-A chọn lọc (IB) không gây ức chế rõ ràng tỷ lệ tăng trưởng khối u so với nhóm chứng bệnh Ngồi ra, độc tính thuốc làm trầm trọng thêm cân chuột mang khối u (Hình 3) 82 Bz 18,3 ± 7,4 PNB-001 18,3 ± 9,1 IB 65,7 (KTC 95% rộng) Việc điều trị chất đối kháng chọn lọc CCK-B (PNB-001) khơng có tác dụng ức chế tăng trưởng thể tích khối u mà cịn làm giảm đáng kể trọng lượng thể chuột thử nghiệm Ngược lại, tỷ lệ tăng thể tích khối u nhóm điều trị chất đối kháng khơng chọn lọc (F-Bz) thấp so với nhóm chứng bệnh nhóm PNB-001 IB Đồng thời, cân chuột thử nghiệm nhóm nhóm cịn lại (Hình 3) B - Khoa học Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số * 2020 Nghiên cứu Hình Tỉ lệ % tăng trưởng thể tích khối u MAC16 % giảm trọng lượng so với ban đầu tác động chất khảo sát xuyên mầm bệnh dẫn đến viêm mạn BÀNLUẬN tính với tăng sản xuất gốc tự oxy Độc tính tế bào chất đối kháng CCK hóa cao Các tác nhân ngăn chặn trình dịng tế bào C38 tự gây chết tế bào, tăng cường phá hủy DNA Nhiều nghiên cứu yếu tố tăng kích hoạt gen tiền ung thư dẫn đến ung thư trưởng chất đối kháng hormon trực phổi(13) PNB-001 khơng tác nhân chống tiếp gây tác dụng gây độc tế bào tế tăng sinh, mà tác nhân kháng viêm hiệu bào ung thư tác động hiệp đồng với góp phần giải triệu chứng thuốc chống ung thư khác Ở đây, viêm ung thư phổi(5) tất chất đối kháng CCK gây Tóm lại, vịng 24 giờ, chất đối kháng độc trực tiếp dòng tế bào ung thư phổi C38 CCK-B chọn lọc đối kháng CCK khơng chọn phụ thuộc vào nồng độ (khoảng 1-100 µM) Hơn lọc có tác dụng gây độc tế bào cao so với nữa, giá trị IC50 chất đối kháng CCK-B chọn chất đối kháng chọn lọc CCK-A dịng tế bào lọc (PNB-001) khơng chọn lọc (Bz) thấp ung thư phổi C38 đáng kể so với 5-FU chất đối kháng CCK-A Thử nghiệm in vivo dòng tế bào ung thư chọn lọc (IB) Do đó, hiệu ứng độc tế bào ruột kết MAC16 PNB-001 Bz cao so với 5-FU IB Bên Kết thí nghiệm tác động cạnh đó, thí nghiệm thực chất đối kháng CCK-A chọn lọc (IB) dòng 24 ủ với thuốc Do đó, tác động gây MAC16 khơng tương thích với nghiên cứu độc tế bào C38 đến từ tác động trước Lattmann cộng (2016) thực đối kháng CCK thụ thể tương ứng thí nghiệm chuột ghép khối u MAC16 chúng Thật vậy, có thụ thể CCK-B tìm (11) điều trị IB (Pyrolon 9) cho thấy giảm thấy ung thư phổi Hơn nữa, tác dụng đáng kể tốc độ tăng trưởng khối u giai chống tăng sinh PNB-001 Bz cần đoạn 2-3 tuần so với nhóm chứng bệnh(10) Vì nghiên cứu thêm nghiên cứu trước vậy, cần lặp lại thí nghiệm với IB kéo dài thời Moody Jensen (2001) chất đối gian ghi nhận kết chuột để có kết luận kháng CCK-B chọn lọc (CI-988) gây tác xác dụng chống tăng sinh dòng tế bào ung thư phổi tế bào nhỏ NCI-H209 tác dụng chống khối u ghép ngoại lai NCI-H209(12) Viêm bảo vệ phổi khỏi chất độc bên Tuy nhiên, xâm nhập thường B - Khoa học Dược Ngược lại, có tương thích kết thí nghiệm chất đối kháng chọn lọc CCK-B (PNB-001) Gonza´lez-Puga cộng (2005) cho thấy chất đối kháng CCK-B chọn lọc 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 24 * Số * 2020 L-365, 260 tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư ruột kết HT-29 Nguyên nhân thụ thể CCK-B biểu ung thư đại tràng: Imdahl cộng (1995) tìm thấy thụ thể CCK-B tìm thấy khoảng 11% 102 khối u đại trực tràng người; số 75% thụ thể CCK-C(13) Cũng từ thí nghiệm này, chúng tơi tìm thấy tác động ức chế tăng trưởng khối u của chất đối kháng không chọn lọc F-Bz cao so với PNB-001 IB có lẽ đến từ tác động ức chế hợp chất thụ thể CCK-C với mức độ biểu cao u đại tràng(14) thụ thể CCK-C trở thành đích trị liệu cho loại ung thư KẾT LUẬN Kết thu cho thấy chất kháng CCK-B chất kháng CCK không chọn lọc gây độc tế bào ung thư phổi C38 có chất kháng CCK khơng chọn lọc có tác dụng ức chế phát triển khối u ruột kết MAC16 in vivo Nghiên cứu góp phần phát triển hợp chất có tác dụng kháng khối u gợi ý thêm đích tác động nghiên cứu phát triển thuốc kháng ung thư TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 Rehfeld JF (2004) Cholecystokinin Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18(4):569-586 Lee HK, Lee HJ, Hur K, Lee HS, et al (2005) Growth effect of gastrin on gastric cancer and its clinical implications for gastric cancer surgery Oncol Rep, 14(2):383-388 Camby I, Salmon I, Danguy A, Pasteels JL, et al (1996) Influence of gastrin on human astrocytic tumor cell proliferation Journal of the National Cancer Institute 88(9):594-600 10 11 12 13 14 Brown JR, DuBois RN (2005) COX-2: a molecular target for colorectal cancer prevention J Clin Oncol, 23(12):2840–2855 Lattmann E, Sattayasai J, Narayanan R, Benyamen J, et al (2018) CCK2–gastrin antagonist: development of PNB-001 (4-chloro- 5-hydroxy-1-phenylethyl-5-phenyl-1, 5-dihydropyrrol-2-one) as anti-inflammatory analgesic SAJ Pharmacy and Pharmacology, 5(1):1-12 Smith JP, Fonkoua LK, Moody TW (2016) The role of gastrin and CCK receptors in pancreatic cancer and other malignancies Int J Biol Sci, 12(3):283-291 Socinski MA, Crowell R, Hensing TE, et al (2007) Treatment of non-small cell lung cancer, stage IV: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2nd ed) Chest, 132(3S):277S-289S Müerköster S, Isberner A, Arlt A,Witt M, Reimann B, et al (2005) Gastrin suppresses growth of CCK2 receptor expressing colon cancer cells by inducing apoptosis in vitro and in vivo Gastroenterology, 129(3):952-968 Lattmann E, Russell ST, Schwalbe CH, Shortt A, et al (2016) Cholecystokinin-1 receptor antagonists: 5-hydroxy5-aryl-pyrrol-2-ones as anticancer agents Med Chem Commun, 7(6):1138-1145 Reubi JC, Schaer JC, Waser B (1997) Cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B gastrin receptors in human tumors Cancer Research, 57(7):1377-1386 Bibby MC, Double JA, Ali SA, Fearon KC, et al (1987) Characterization of a transplantable adenocarcinoma of the mouse colon producing cachexia in recipient animals J Natl Cancer Inst, 78(3):539-546 Moody TW, Jensen RT (2001) CI-988 inhibits growth of small cell lung cancer cells J Pharmacol Exp Ther, 299(3):1154-1160 Azad N, Rojanasakul Y, Vallyathan V (2008) Inflammation and lung cancer: roles of reactive oxygen/nitrogen species J Toxicol Environ Health B Crit Rev, 11(1):1-15 Imdahl A, Mantamadiotis T, Eggstein S, Farthmann EH, Baldwin GS (1995) Expression of gastrin, gastrin/CCK-B and gastrin/CCK-C receptors in human colorectal carcinomas J Cancer Res Clin Oncol, 121(11):661-666 Ngày nhận báo: 15/05/2020 Ngày phản biện nhận xét báo: 31/05/2020 Ngày báo đăng: 20/07/2020 B - Khoa học Dược ... nhi? ?u dòng tế bào ung thư ung thư dày, tìm thấy nhi? ?u ung thư ruột kết( 8) Vì đại tràng, tụy, phổi, não(2,3) Vì vậy, chất đối vậy, nghiên c? ?u thực nhằm so kháng thụ thể CCK xem tác nhân sánh tác động. .. thấp ung thư phổi C38 đáng kể so với 5-FU chất đối kháng CCK-A Thử nghiệm in vivo dòng tế bào ung thư chọn lọc (IB) Do đó, hi? ?u ứng độc tế bào ruột kết MAC16 PNB-001 Bz cao so với 5-FU IB Bên Kết. .. tri? ?u chứng thuốc chống ung thư khác Ở đây, viêm ung thư phổi( 5) tất chất đối kháng CCK gây Tóm lại, vòng 24 giờ, chất đối kháng độc trực tiếp dòng tế bào ung thư phổi C38 CCK-B chọn lọc đối kháng