Bài viết So sánh tác động môi trường nuôi dưỡng và nồng độ oxy khác nhau tới tình trạng bất thường nhiễm sắc thể của phôi trình bày đánh giá sự bất thường nhiễm sắc thể của phôi khi nuôi cấy ở nồng độ oxy và môi trường nuôi cấy khác nhau (môi trường đơn bước/ đa bước và nồng độ oxy 20%/5%).
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 SO SÁNH TÁC ĐỘNG MÔI TRƯỜNG NI DƯỠNG VÀ NỒNG ĐỘ OXY KHÁC NHAU TỚI TÌNH TRẠNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ CỦA PHÔI Nguyễn Linh Chi1,2, Ngơ Thị Tường Châu2, Nguyễn Đình Tảo1, Nguyễn Ngọc Diệp3 TÓM TẮT 29 Mục tiêu: Đánh giá bất thường nhiễm sắc thể phôi nuôi cấy nồng độ oxy môi trường nuôi cấy khác (môi trường đơn bước/ đa bước nồng độ oxy 20%/5%) Phương pháp: Đánh giá phân tích dựa 257 chu kỳ IVF/ICSI từ tháng 10/2019 đến tháng 2/2021, sử dụng loại tủ nuôi cấy: tủ nuôi cấy khí K-system G-210 (Úc) (5% O2, 5%CO2, 90%N2) tủ ni cấy khí Thermo Scientific 371 (Đan Mạch) (5%CO2, 75%N2, nồng độ Oxy theo khí quyển) Nỗn trưởng thành (MI MII) nuôi cấy môi trường đa bước G1PLUSTM (Vitrolife) môi trường đơn bước Lifeglobal Lựa chọn bệnh nhân 1,2 ng/ml, AFC≥4 Kết sàng lọc PGT-A phôi ngày cho thấy, tỷ lệ phơi bất thường cao nhóm ni cấy phơi nồng độ oxy cao 20% với môi trường đa bước, mức 46.02±5.31%, thấp nhóm oxy thấp 5%, đơn bước mức 30.74±3.50% ( Khi nuôi cấy môi trường đa bước, khác biệt số Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Học viện Quân Y Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Linh Chi Email: linhchi148@gmail.com Ngày nhận bài: 25/7/2022 Ngày phản biện khoa học: 10/08/2022 Ngày duyệt bài: 29/08/2022 208 lượng phôi bất thường/chu kỳ cho kết có ý nghĩa thống kê với Cụ thể, nhóm 5% 1.60±0.22 phơi/chu kỳ nhóm oxy 20% 2.08±0.28 phôi/chu kỳ Kết luận: Nuôi cấy phôi môi trường nồng độ oxy thấp giúp phôi phát triển bất thường nhiễm sắc thể so với ni cấy nồng độ khí Từ khóa: IVF, mơi trường ni cấy, nồng độ, bất thường nhiễm sắc thể SUMMARY COMPARISON THE IMPACTS OF CULTURE MEDIA AND DIFFERENT OXYGEN CONCENTRATION TO CHROMOSOMAL A BNORMALITIES OF EMBRYOS Objective: Evaluating the chromosomal abnormalities of embryos when cultured at different oxygen concentrations and culture medium (single step/multistep medium, oxygen concentration 20%/5%) Methods: analytical evaluation based on 257 cycles of IVF/ICSI from October 2019 to February 2021, using types of incubator: Ksystem G-210 3-gas incubator (Australia) (5) %O2, 5%CO2, 90%N2) and Thermo Scientific 371 (Denmark) 2-gas incubator (5%CO2, 75%N2 and using atmospheric Oxygen concentration) Mature oocytes (MI and MII) were cultured in G1-PLUSTM multistep medium (Vitrolife) or Lifeglobal single step medium Select patients TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 1.2 ng/ml, AFC≥4 The results of embryo PGT-A screening on day showed that the percentage of abnormal embryos was highest in the group of embryo culture with high oxygen concentration 20% with multistep medium, at 46.02±5.31%, the lowest in low oxygen group %, single step at 30.74±3.50% ) When cultured in the same multistep medium, the difference in number of abnormal embryos/cycle was statistically significant with Specifically, in the 5% group it was 1.60±0.22 embryos/cycle while in the 20% oxygen group it was 2.08±0.28 embryos/cycle Conclusion: Embryo culture in a low-oxygen environment helped embryos develop fewer chromosomal abnormalities than when cultured at atmospheric concentrations Keywords: IVF, culture medium, concentration, chromosomal abnormalities I ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản IVF ngày phát triển hoàn chỉnh hơn, giúp mang lại thành công lớn cho cặp vợ chồng mong muộn Bên cạnh nghiên cứu kiểm tra hình thái phơi, nhà khoa học tiến hành xét nghiệm sinh thiết sàng lọc phôi PGT-A để đánh giá chất lượng phôi cách tồn diện Kết sàng lọc phơi PGT-A cho phép bệnh nhân xác định lựa chọn phơi tốt nhất, có tiềm phát triển để chuyển vào thể mẹ, giúp cải thiện kết thụ tinh ống nghiệm lần chuyển phôi Tuy nhiên, để chẩn đoán di truyền trước làm tổ cách hiệu quả, cần sinh thiết phôi giai đoạn phôi nang để lấy mẩu tế bào đặc trưng nhất, mà không gây ảnh hưởng đến phát triển phơi sau Theo đó, mơi trường ni cấy phôi nồng độ oxy hai nhân tố ảnh hưởng đến phát triển phơi giai đoạn, định hình thành chất lượng phơi nang Thời điểm tại, có hai loại môi trường thương mại sử dụng rộng rãi trung tâm hỗ trợ sinh sản giới: Môi trường nuôi cấy đơn bước mơi trường ni cấy đa bước Bên cạnh đó, nồng độ oxy vấn đề tranh cãi 5% O2 20% O2 phòng labo Từ ngày đầu IVF, phịng labo ln sử dụng nồng độ oxy 20%, nhiên chuyên gia nghiên cứu thấy nồng độ oxy thực tế tử cung mẹ động vật có vú giao động khoảng 2-8% [1] Trước người ta cho phôi bất thường di truyền bố mẹ, tuổi mẹ, ti thể số nghiên cứu gần cho thấy môi trường nuôi cấy nồng độ oxy ảnh hưởng đến kết PGT-A, chưa đưa khẳng định thống Mặc dù có nhiều nghiên cứu vấn đề này, chưa đủ chứng để đưa kết luận cụ thể mối quan hệ môi trường nuôi cấy kết sàng lọc PGT-A [2] [3] Thực chất, phòng Labo Hỗ trợ sinh sản có hệ thống ni cấy riêng, điều trị nhóm bệnh nhân đặc thù khác nhau, nên dẫn đến kết nghiên cứu khác trung tâm hỗ trợ sinh sản Để đóng góp thêm vào kết luận, làm nghiên cứu so sánh kết sàng lọc phôi PGT-A (phôi ngày 5) nuôi cấy môi trường đơn bước (Global total)/môi trường đa bước (G1-PlusTM /G2-PlusTM) nồng độ oxy khí quyển/nồng độ oxy thấp 209 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 II THỰC NGHIỆM Nghiên cứu thực từ tháng 10/2019 đến tháng 2/2021, dựa chu kỳ IVF/tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) Trung tâm hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông Nghiên cứu sử dụng tủ ni cấy khí K-system G-210 (Úc) tủ ni cấy khí Thermo Scientific model 371 (Đan Mạch), môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường đa bước G-1, G-2 plus hãng Vitrolife-Thụy Điển môi trường nuôi cấy đơn bước Life Global – Mỹ Các chu kỳ IVF/ICSI thực phịng Lab với quy trình lâm sàng, quy trình phịng thí nghiệm vật liệu tiếp xúc Khơng có thay đổi nhân viên phịng thí nghiệm phôi học, thay đổi thay đổi môi trường nuôi cấy nồng độ oxy Đã có chấp thuận Hội đồng quản trị Trung tâm Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện 16A Hà Đông, liệu thu thập từ hồ sơ bệnh án Trung tâm Nghiên cứu lựa chọn bệnh nhân có nang thứ cấp vào ngày chu kỳ kinh, tuổi mẹ 1,2 ng/ml Tổng số chu kỳ IVF/ICSI đưa vào nghiên cứu 341 chu kỳ với 3509 phôi Bệnh nhân sau kích thích buồng trứng có kiểm soát 9-12 ngày, sau 36 tiêm rụng, bệnh nhân hút nang qua hướng dẫn siêu âm Nang trứng lấy chuyển vào phòng thụ tinh ống nghiệm phút, đặt tủ ấm 2-4 để chuẩn bị cho chu kỳ ICSI Sau ICSI, tất nỗn đặt vào mơi trường rửa (có chứa 10% chất thay huyết tổng hợp 210 25 vi giọt) phân chia ngẫu nhiên thành nhóm: Nhóm I: Phơi ni cấy tủ khí (20% O2, 6% CO2) với mơi trường ni cấy đơn bước Lifeglobal Nhóm II: Phơi ni cấy tủ khí (20% O2, 6% CO2) với môi trường nuôi cấy đa bước Vitrolife Nuôi phôi ngày môi trường G-1TMPLUS; Sang ngày chuyển sang đĩa giếng có chứa mơi trường G-2TMPLUS Nhóm III: Phơi ni cấy tủ khí (5% O2, 6% CO2, 90% N2) với môi trường nuôi cấy đơn bước Nhóm IV: Phơi ni cấy tủ khí (5% O2, 6% CO2, 90% N2) với mơi trường nuôi cấy đa bước Vitrolife Nuôi phôi ngày môi trường G-1TMPLUS; Sang ngày chuyển sang đĩa giếng có chứa mơi trường G-2TMPLUS Tất phơi trải qua phân loại chất lượng tiêu chuẩn ngày ngày theo phương pháp đồng thuận Istanbul (Alpha Scientists in Reproductive Medicine (2011) [4]) Sau phơi sinh thiết mang mẫu sàng lọc chẩn đoán tiền làm tổ, kết PGT-A so sánh nhóm mơi trường ni cấy So sánh nhóm phát triển phơi phương pháp phân tích phương sai yếu tố để đánh giá ảnh hưởng tác nhân nghiên cứu lên đối tượng nghiên cứu Kiểm định sử dụng kiểm định III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng số có 257 chu kỳ thụ tinh ống nghiệm thực với trứng TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 thụ tinh Trong đó, nhóm I có 338 phơi tương đương với 72 chu kỳ, nhóm II có 228 phơi tương đương với 52 chu kỳ, nhóm III có 268 phơi tương đương với 58 chu kỳ, nhóm IV có 328 phơi tương đương với 75 chu kỳ Trong chu kỳ IVF, nhóm nghiên cứu, tuổi trung bình bệnh nhân thời gian vơ sinh thời điểm chọc nỗn, số nội tiết khơng có khác biệt (bảng 1) (với giá trị ) Bảng 1: Phân loại thông tin bệnh nhân Chỉ tiêu Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV Thời gian vơ 4.13±0.55 3.66±0.50 4.12±0.56 4.28±0.49 0.9661 sinh/chu kỳ Tuổi trung 31.27±0.88 31.45±1.01 30.94±1.01 31.20±0.92 0.1811 bình/chu kỳ AMH (ng/mL) 3.63±0.44 3.99±0.73 3.88±0.64 3.52±0.56 0.527 Số nang thứ 10.87±0.84 11.56±1.10 11.49±1.07 10.32±0.85 1.5194 cấp AFC Số nỗn trung bình sau chọc hút số nỗn trưởng thành bệnh nhân bốn nhóm tương đương Tỷ lệ thụ tinh noãn trưởng thành cao, khác biệt tỷ lệ thụ tinh nhóm khơng có ý nghĩa thống kê Tương tự, số lượng phơi trung bình hai nhóm tương đương (bảng 2) Bảng Đặc điểm KTBT bệnh nhân hai nhóm Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV Số nỗn/chu kỳ 11.17±1.02 12.51±1.55 12.20±1.19 11.55±1.10 0.9856 Số phôi ngày 9.80±0.99 11.11±1.50 10.68±1.14 9.80±0.98 1.2716 1/chu kỳ Tỷ lệ thụ tinh 86.26±1.83 85.77±2.29 86.20±2.28 83.76±2.39 1.2228 (%)/chu kỳ Kết từ bảng cho thấy, khác biệt số lượng phôi ngày trung bình sàng lọc chu kỳ nhóm nghiên cứu khơng có ý nghĩa thống kê, số lượng phơi sàng lọc nhóm giao động khoảng - phôi chu kỳ Sự khác biệt số lượng phôi bất thường trung bình chu kỳ tỷ lệ phơi bất thường cho kết có ý nghĩa thống kê Bảng Kết sàng lọc PGT phôi ngày Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV Số lượng bệnh nhân sàng lọc 72 52 58 75 211 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Tổng số phôi sàng 338 228 268 328 lọc Số phôi sàng 4.69±0.43 4.38±0.53 4.62±0.48 4.37±0.44 0.3615 lọc/chu kỳ Số phôi bất thường 138 108 90 120 Số lượng phôi bất 1.92±0.23 2.08±0.28 1.55±0.22 1.60±0.22 3.0017 thường/chu kỳ Tỷ lệ phôi bất 39.74±3.43 46.02±5.31 30.74±3.50 34.97±3.82 6.7682 thường (%) Tỷ lệ phôi bất thường cao nhóm ni cấy phơi nồng độ oxy cao 20% với môi trường đa bước, mức 46.02±5.31%, thấp nhóm oxy thấp 5%, đơn bước mức 30.74±3.50% Hình Biểu đồ Histogram phân bố tỷ lệ phơi bất thường nhóm nghiên cứu (bước dao động 10% trục X) Từ kết hình vẽ, nhóm I nhóm II nuôi cấy nồng độ oxy cao, tỷ lệ phôi bất thường chiếm cao 40-50% Đối với nhóm III nhóm IV ni cấy trog điều kiện nồng độ oxy thấp, tỷ lệ phôi bất thường chiếm cao 212 mốc 30-40% Sử dụng so sánh F-kiểm định để phân tích so sánh khác biệt kết bất thường phôi cặp nhóm nghiên cứu nghiên cứu ni cấy điều kiện (hoặc môi trường, nồng độ oxy): TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Bảng So Sánh bất phường nhiễm sắc thể cặp nhóm nghiên cứu Đặc điểm Phơi ni điều kiện oxy cao (Nhóm I, nhóm II) Phôi nuôi điều kiện oxy thấp (Nhóm III, nhóm IV) Phơi ni mơi trường đơn bước (Nhóm I, nhóm III) Phơi ni mơi trường đa bước (Nhóm II, nhóm IV) Khi so sánh kết sàng lọc phôi bất thường nhóm ni dưỡng (bảng 4): - Trong điều kiện nồng độ oxy (khác loại môi trường nuôi cấy), kết cho thấy số lượng trung bình tỷ lệ phơi bất thường chu kỳ có khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với - Trong loại môi trường nuôi dưỡng (khác nồng độ oxy), kết so sánh số lượng phôi bất thường/chu kỳ cho thấy: +) Khi nuôi cấy môi trường đơn bước, (bảng 4) khác biệt số lượng phôi bất thường/chu kỳ bắt đầu có khác (1.92±0.23 so với 1.55±0.22 phôi bất thường/chu kỳ) (bảng 3) +) Khi nuôi cấy môi trường đa bước, khác biệt số lượng phôi bất thường/chu kỳ cho kết có ý nghĩa thống kê với (bảng 4) Cụ thể, nhóm 5% 1.60±0.22 phơi/chu kỳ Đối với số phôi sàng lọc/chu kỳ Đối với số phôi bất thường/chu kỳ Đối với tỷ lệ phôi bất thường/chu kỳ 0.5897 0.5462 3.0477 0.4051 0.0682 1.7939 0.0367 3.6064 9.3676 0.0008 5.2066 8.5239 nhóm oxy 20% 2.08±0.28 phơi/chu kỳ (bảng 3) - Trong loại môi trường nuôi dưỡng (khác nồng độ oxy), kết so sánh tỷ lệ phôi bất thường cặp nhóm, khác biệt cho ý nghĩa thống kê với (bảng 4) Đối chiếu với bảng 3, cho thấy nuôi cấy phôi điều kiện oxy thấp 5% cho kết tốt hơn, thể số lượng phôi bất thường tỷ lệ phôi bất thường thấp hẳn so với nhóm cịn lại Thành phần loại môi trường nuôi cấy khác nhau, đặc biệt nguồn bổ sung protein, tồn hợp chất chung hai loại môi trường nồng độ khác [5] [6] Bên cạnh đó, hai loại môi trường đểu bổ sung albumin huyết người tinh chế theo cách khác nhau, làm ảnh hưởng đến tác động môi trường nuôi cấy đến phôi người Trong môi trường đơn bước cung cấp tất dưỡng chất công thức nhất, môi trường đa bước hướng tới việc bắt chước điều kiện sinh lý mà giao tử 213 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 phơi tiếp xúc di chuyển từ ống dẫn trứng vào tử cung mẹ Bên cạnh đó, thực tế điều kiện thể, nỗn phơi giai đoạn phân chia sớm phát triển vòi tử cung nồng độ oxy – % Như việc hạ thấp nồng độ oxy điều kiện ni cấy phơi xuống 5% thích hợp cho thụ tinh phát triển phôi giai đoạn phôi phân chia sớm Trong nghiên cứu này, số lượng bệnh nhân, tuổi, số nội tiết AMH tương tự nhóm; vậy, so sánh khách quan nhóm với điều kiện nuôi cấy khác (về nồng độ oxy mơi trường ni dưỡng) Phân tích phát triển phôi nang: Tỷ lệ phôi cao chất lượng hình thái phơi tốt quan sát phôi ngày với phôi nuôi cấy môi trường đơn bước, kết tương tự với nghiên cứu Cimandomo et.al [8] Kết sàng lọc phơi PGT-A khơng có ý nghĩa thống kê tỷ lệ phôi bất thường so sánh nhóm phơi ni cấy hai loại mơi trường khác (đơn bước đa bước), liệu tương quan với kết nghiên cứu thử nghiệm SuMMIT [3] – chứng minh tỷ lệ bất thường phôi nang không bị ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, nồng độ oxy thấp cho kết phơi bất thường nhiễm sắc thể nhóm cịn lại Kết giải thích nồng độ oxy cao tạo nhiều gốc oxy tự (trong điều kiện bình thường có khoảng – 4% phân tử oxy chuyển thành gốc tự do) Các gốc tự nhân tố khử phản ứng cực mạnh gây độc cho sinh hoá tế bào, bao gồm gen di truyền Các ADN ty thể mẫn cảm với thay đổi tác động chất oxy hóa này, chúng khơng có protein histon bảo vệ khơng có 214 hệ thống sửa chữa sai sót Điều dễ dẫn đến hậu làm gia tăng tỷ lệ đột biến, gây ảnh hưởng đến trình phiên mã ARN q trình mã thân ADN ty thể ADN đột biến tổng hợp nên protein bất thường, thân protein đích cơng gốc tự do, gây thay đổi mặt cấu trúc chức [9] V KẾT LUẬN Nuôi cấy phôi môi trường nồng độ oxy thấp giúp phơi phát triển bất thường nhiễm sắc thể so với ni cấy nồng độ khí TÀI LIỆU THAM KHẢO Fischer B, Bavister BD, "Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys, hamsters and rabbits," J Reprod Fertil , vol 99, No.2, 1993, pp 673–679 Desai N, Flyckt R, Austin CM., "Can culture medium affect morphokinetics, embryo dysmorphisms and euploidy rate?," Fertil Steril vol 108, No.3, 2017, e.160 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2017.07 482 Werner MD, Hong KH, Franasiak JM, Forman EJ, Reda CV, Molinaro TA, et al., "Sequential versus Monophasic Media Impact Trial (SuMMIT): a paired randomized controlled trial comparing a sequential media system to a monophasic medium.," Fertil Steril, vol 105, No.5, 2016, pp.1215–21 https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2016.0105 ALPHA Scientists in Reproductive Medicin, "The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting," Human Reproduction, Vol.26, No.6, 2011, pp.1270-1283, https://doi.org/10.1093/humrep/der037 ... lệ bất thường phôi nang không bị ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, nồng độ oxy thấp cho kết phôi bất thường nhiễm sắc thể nhóm cịn lại Kết giải thích nồng độ oxy cao tạo nhiều gốc oxy. .. tỷ lệ phôi bất thường chu kỳ có khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với - Trong loại môi trường nuôi dưỡng (khác nồng độ oxy) , kết so sánh số lượng phôi bất thường/ chu kỳ cho thấy: +) Khi nuôi. .. phôi bất thường tỷ lệ phôi bất thường thấp hẳn so với nhóm cịn lại Thành phần loại mơi trường nuôi cấy khác nhau, đặc biệt nguồn bổ sung protein, tồn hợp chất chung hai loại môi trường nồng độ