Nghiên cứu chỉnh sửa gen bằng hệ thống CRISPR/Cas9 trong dòng tế bào ung thư

Hệ thống CRISPR/Cas9 là một trong những công cụ đem lại hiệu quả chỉnh sửa gen cao và có triển vọng trong ứng dụng lâm sàng. Với mục tiêu chỉnh sửa gen RAPTOR và Atg5 trên dòng tế bào bạch cầu mạn tính dòng tủy K562 và tế bào ung thư não TGS04 bằng hệ thống CRISPR/Cas9.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC NGHIÊN CỨU CHỈNH SỬA GEN BẰNG HỆ THỐNG CRISPR/ CAS9 TRONG DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ Vũ Thị Hà1,2,  , Bùi Tường An1, Đoàn Thị Kim Phượng1,2 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Hệ thống CRISPR/Cas9 công cụ đem lại hiệu chỉnh sửa gen cao có triển vọng ứng dụng lâm sàng Với mục tiêu chỉnh sửa gen RAPTOR Atg5 dòng tế bào bạch cầu mạn tính dịng tủy K562 tế bào ung thư não TGS04 hệ thống CRISPR/Cas9, thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 cách chèn đoạn trình tự đích vào plasmid PX330 Plasmid đưa vào tế bào đích xung điện Để đánh giá hiệu trình chỉnh sửa gen chúng tơi sử dụng kỹ thuật PCR, giải trình tự gen Western blotting Kết cho thấy CRISPR/Cas9 thiết kế gây xóa exon3 gen RAPTOR; gây đột biến đoạn gen Atg5 dẫn đến tăng rõ rệt mức độ biểu protein LC3I giảm đáng kể mức độ biểu protein LC3II Nghiên cứu hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen đích dẫn đến biến đổi protein sản phẩm đường hoạt hóa gen Từ khóa: CRISPR/Cas9, liệu pháp gen, tế bào ung thư I ĐẶT VẤN ĐỀ CRISPR/Cas9 viết tắt từ chữ đầu cụm Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-associated (Cas) protein, hệ miễn dịch sinh vật nhân sơ giúp chúng có khả ghi nhớ tạo miễn dịch với yếu tố di truyền ngoại lai Trình tự CRISPR lần nhà khoa học Nhật Bản Yoshizumi Ishino cộng tìm vào năm 1987 E coli nhiều vi khuẩn khác sau Đến năm 2013 chế hoạt động CRISPR/enzym Cas làm sáng tỏ sử dụng tế bào động vật có vú, đặt sở cho việc áp dụng CRISPR / Cas9 công cụ chỉnh sửa gen Hoạt động hệ CRISPR/Cas9 có tham gia hai thành phần Cas9 protein đoạn dẫn RNA khơng mã hóa (được gọi sgRNA) Phân tử sgRNA bắt cặp với trình tự vùng Tác giả liên hệ: Vũ Thị Hà, Trường Đại học Y Hà Nội Email: vuthiha@hmu.edu.vn Ngày nhận: 13/12/2019 Ngày chấp nhận: 03/03/2020 TCNCYH 126 (2) - 2020 đệm spacer DNA đích xâm nhập giúp protein Cas (CRISPR-associated) nhận thực cắt đứt, sửa chữa sợi DNA vùng bắt cặp Kết DNA sửa đổi nhanh dễ dàng nhiều so với khả sử dụng phương pháp chỉnh sửa gen trước đó.1,2 Trên giới, nhiều nghiên cứu sử dụng hệ thống để sửa chữa DNA gen số dòng tế bào ung thư tế bào gốc.³ Heckl D cộng sự, năm 2014, dùng hệ thống CRISPR/Cas9 tạo đột biến gây ung thư tủy bào chuột.⁴ Ở nghiên cứu khác, Xue W cộng gây đột biến gen ung thư gan chuột với mục đích phá vỡ chức gen ung thư.⁵ Tuy nhiên Việt Nam, nghiên cứu hệ thống CRISPR/Cas9 mẻ chưa sử dụng rộng rãi Vì vậy, thực nghiên cứu với mục tiêu ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen RAPTOR dòng tế bào ung thư máu gen Atg5 dòng tế bào ung thư não, đồng thời đánh giá hiệu q trình chỉnh sửa TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Aldrich) DMEM/F12 (Wako) tương ứng Thời gian địa điểm nghiên cứu Các kỹ thuật kiểm tra hiệu gây đột Nghiên cứu tiến hành tại: Bộ môn Y Sinh học – Di truyền, Trường ĐH Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: 10/2018 - 10/2019 Thiết kế sử dụng hệ thống CRISPR/ Cas9 Đoạn trình tự đích sgRNA thích hợp lựa chọn từ thư viện sgRNA6 gồm 20 pb biến tính chèn vào plasmid PX330 sau cắt enzym BbsI Plasmid mang đoạn trình tự đích đưa vào tế bào xung điện (Amaxa Mouse neural stem Nucleofector Kit, Lonza, Basel, Switzerland) Sử dụng đồng thời hai sgRNA đích vùng intron exon2 với exon3 vùng (GCCGAAATACAAATGAACGT) intron exon3 với exon4 (GAAATTTACCACGGACTCCA) để gây xóa đoạn exon3 gen RAPTOR dòng tế bào ung thư máu, sgRNA gen biến hệ thống CRISPR/Cas9 Tế bào sau gây đột biến thu hoạch khuếch đại vùng đột biến kỹ thuật PCR với ba mồi đồng thời Sử dụng phần mềm primer3 để thiết kế mồi vùng intron trước sau exon3 gen RAPTOR (Mồi xuôi: CTGGAACCCACTCCTGAAAT, thứ nhất: mồi mồi ngược CGATGGTTTCCAGAGCTTTC ngược thứ hai: CACACCCACCTTGTTGAAGA) Sử dụng cặp mồi xuôi: GGCCATCAATCGGAAACTCA, mồi ngược: TGAGTTTCCGATTGATGGCC cho kỹ thuật giải trình tự gen cho gen Atg5 Các sản phẩm phản ứng PCR kiểm tra gel Agarose 2% Protein gen tương ứng kiểm tra kỹ thuật Western blotting với kháng thể tương ứng ATG5 (Novusbio, Littleton, CO, USA, NB110 - 53818; 1:500), LC3 Atg5 (GGCCATCAATCGGAAACTCA) để gây (NanoTools, Teningen, Germany; clone 5F10, đột biến gen Atg5 dòng tế bào ung thư 0231; 1:200), β - actin (Sigma - Aldrich A5441; não 1:2000) Trình tự DNA hay trình tự mRNA Tạo đột biến tế bào nuôi cấy kiểm tra kỹ thuật giải trình tự gen dịng tế bào Sử dụng tế bào Leukemia mạn tính dịng tủy K562 tế bào ung thư não TGS04 cung máy giải trình tự 3500 Applied Biosystems – Thermo Fisher Scientific Đạo đức nghiên cứu cấp giáo sư Atsushi Hirao, Trung tâm ung Nghiên cứu tuân thủ quy định đạo thư, trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản7 đức nghiên cứu y sinh Các thí nghiệm Tế bào ung thư máu tế bào ung thư não nghiên cứu tuân thủ theo quy ni cấy mơi trường RPMI (Sigma- trình, quy tắc phịng thí nghiệm TCNCYH 126 (2) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ Hệ thống CRISPR/Cas9 xóa hồn tồn exon3 gen RAPTOR bp Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát xóa đoạn exon3 gen RAPTOR Cột 1- Thang chuẩn Cột 2- Tế bào K562 không gây đột biến Cột 3- Tế bào không ung thư Cột 4- Tế bào K562 gây đột biến 2000 1000 500 300 (Hình 1) Cột 2: Xuất băng exon3 tế bào không gây đột biến Cột 3: khơng hiển thị sản phẩm PCR kích thước đoạn intron lớn, cặp mồi bắt cặp, phản ứng PCR khơng xảy Cột 4: xuất băng đột biến chứng tỏ exon bị xóa bỏ Để khẳng định thêm chứng exon bị xóa bỏ hồn tồn, chúng tơi kiểm tra trình tự genome trình tự mRNA tế bào đột biến (Hình 2) A) Đoạn DNA nằm khoảng hai sgRNA đích bao gồm exon phần intron trước sau exon bị xóa bỏ B) Trên mRNA, exon bị xóa bỏ hoàn toàn, exon exon kết nối lại với Intron2 Intron3 Exon3 bị xóa DNA Exon2 Exon4 Exon3 bị xóa mRNA Hình Kết giải A trình tự DNA (A) trình tự mRNA (B) B gen RAPTOR tế bào K562 bị gây đột biến TCNCYH 126 (2) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC CRISPR/Cas9 gây knockout gen Atg5 dẫn đến biến đổi protein sản phẩm đường hoạt hóa gen (Hình 3) Mẫu đột biến bị xóa trình tự gen tương ứng với axit amin K, L, M, E Sự xóa đoạn gen Agt5 khẳng định thí nghiệm kiểm tra biến đổi protein mà bị ảnh hưởng gen WT AC AGA TTT GAC CAG TTT TGG GCC ATC AAT CGG AAA CTC ATG GAA TAT CCT GCA GAA GAA AAT R F D Q F W A I N R K L M E Y P A E E N GGA TTT CGT TAT ATC CCC TTT AGA ATA TAT CAG G MT AC AGA TTT GAC CAG TTT TGG GCC ATC AAT CGG AAA CTC ATG G AA TAT CCT GCA GAA GAA AAT R F D Q F W A I N R K L M E N I L Q K K M GGA TTT CGT TAT ATC CCC TTT AGA ATA TAT CAG G Hình Kết giải trình tự gen Atg5 acid amin tương ứng bị đột biến tế bào ung thư não4 dòng kDa ATG5 50 25 LC3-I LC3-II actin 37 Hình Hình ảnh xóa gen Atg5 dòng tế bào ung thư não TGS04 Mẫu đột biến kiểm tra Western blotting Mẫu bình thường: 1, 4; Mẫu đột biến: 2,3,5,6 (Hình 4) Gen Atg5 có vai trị hoạt hóa LC3I thành LC3II trong trình tự thực bào tế bào Nếu gen Atg5 bị đột biến chức phân tử LC3I khơng kích hoạt thành LC3II, dẫn tới khơng hình thành LC3II Hình cho thấy mẫu đột biến, protein Atg5 LC3II biến hoàn toàn, đồng thời LC3I tăng lên đáng kể IV BÀN LUẬN Hoạt động hệ thống CRISPR/Cas9 biết đến với hiệu cao chỉnh sửa gen, từ mở ứng dụng vơ to lớn hữu ích tương lai để nghiên cứu chức gen điều trị bệnh di truyền So sánh với kỹ thuật chỉnh sửa gen khác, hệ thống CRISPR/Cas9 cho chi phí sử dụng thấp, sử dụng đơn giản dễ thực Nó khơng đòi hỏi phải thiết kế phức hợp protein kỹ thuật liên quan khác kỹ thuật Meganucleases (MNs), Zinc Finger Nucleases (ZNFs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs).1,2 RAPTOR thành phần cấu tạo nên gen mTOR – gen quan trọng đường hoạt hóa PI3K-mTOR tham gia nhiều hoạt động tế bào.8 Atg5 gen tham gia vào trình tự thực bào tế bào Nghiên cứu Ha cộng TCNCYH 126 (2) - 2020 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC sự, năm 2018, cho thấy dòng tế bào ung thư não bị đột biến gen Atg5 kết hợp với số thuốc chống ung thư, kết điều trị có hiệu rõ rệt so với dịng tế bào khơng bị đột biến.⁹ Nhiều nghiên cứu gần vai trò quan trọng gen tế bào ung thư, đột biến gen đưa lại hiệu điều trị khác biệt rõ rệt ung thư máu ung thư não.8–10 Nghiên cứu hệ thống CRISPR/Cas9 xóa hồn tồn exon3 gen RAPTOR cách sử dụng hai sgRNA đích khác vùng khác gen Thí nghiệm tương tự với exon4 số exon khác, cho hiệu xóa đoạn tương tự Như vậy, với việc sử dụng đồng thời hai hay nhiều sgRNA đích gen gen khác nhau, xóa bỏ exon nhiều exon, xóa bỏ nhiều gen mong muốn khác Điều mở khả nghiên cứu rối loạn mang tính chất đa gen phức tạp.³ Nghiên cứu tạo hệ thống CRISPR/Cas9 gây xóa gen Atg5 dẫn đến thay đổi mức độ biểu protein tương ứng Điều chứng tỏ CRISPR/Cas9 có khả xóa hoàn toàn chức gen, làm biến đổi sản phẩm protein đường hoạt hóa chúng Nhiều nghiên cứu giới CRISPR/Cas9 gây nhiều dạng đột biến khác đột biến điểm với mất, thêm nucleotide, xóa bỏ hay nhiều gen, xếp lại cấu trúc nhiễm sắc thể Ứng dụng khả gây đột biến đa gen hệ thống CRISPR/ Cas9, Heckl cộng gây đột biến đồng thời gen tế bào gốc tạo máu chuột để tạo mơ hình bệnh bạch cầu tủy cấp tính Tương tự vậy, nhiều tác giả sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để bất hoạt hai nhiều gen ức chế khối u ung thư gan, phổi chuột.4,5,11 Với nhiều kết nghiên cứu TCNCYH 126 (2) - 2020 khả quan hiệu chỉnh sửa gen, hệ thống CRISPR/Cas9 thử nghiệm lâm sàng, đặc biệt trị liệu gen liệu pháp điều trị miễn dịch ung thư.2,9,10 V KẾT LUẬN Nghiên cứu hiệu gây đột biến gen RAPTOR Atg5 dòng tế bào ung thư máu ung thư não hệ thống CRISPR/Cas9 Hiệu gây đột biến biểu ba mức độ gen, mRNA protein Trong tương lai tiếp tục ứng dụng khả gây đột biến đa gen hệ thống để đồng thời knockout hai hay nhiều gen không mong muốn, ứng dụng liệu pháp gen liệu pháp miễn dịch lâm sàng, đặc biệt bệnh ung thư bệnh di truyền Lời cảm ơn Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Bộ môn Y Sinh học – Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà nội giúp đỡ giáo sư Atsushi Hirao, Trung tâm Ung thư, Đại học Kanazawa, Nhật Bản cung cấp nguồn vật liệu cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Gaj T, Sirk SJ, Shui S-L, Liu J Genome-Editing Technologies: Principles and Applications Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8(12):a023754 doi:10.1101/cshperspect a023754 Doudna JA, Charpentier E The new frontier of genome engineering with CRISPRCas9 Science 2014;346(6213):1258096 doi:10.1126/science.1258096 Cong L, Ran FA, Cox D, et al Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems Science 2013;339(6121):819-823 doi:10.1126/science.1231143 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Heckl D, Kowalczyk MS, Yudovich D, et al Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing Nat Biotechnol 2014;32(9):941-946 doi:10.1038/ nbt.2951 Xue W, Chen S, Yin H, et al CRISPRmediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver Nature 2014;514(7522):380-384 doi:10.1038/nature13589 Wang T, Birsoy K, Hughes NW, et al Identification and characterization of essential genes in the human genome Science 2015;350(6264):1096 doi:10.1126/science aac7041 Ikushima H, Todo T, Ino Y, Takahashi M, Miyazawa K, Miyazono K Autocrine TGF-β Signaling Maintains Tumorigenicity of GliomaInitiating Cells through Sry-Related HMG-Box Factors Cell Stem Cell 2009;5(5):504-514 doi:10.1016/j.stem.2009.08.018 Earwaker P, Anderson C, Willenbrock F, Harris AL, Protheroe AS, Macaulay VM RAPTOR up-regulation contributes to resistance of renal cancer cells to PI3K-mTOR inhibition PloS One 2018;13(2):e0191890-e0191890 doi:10.1371/journal.pone.0191890 Vu HT, Kobayashi M, Hegazy AM, et al Autophagy inhibition synergizes with calcium mobilization to achieve efficient therapy of malignant gliomas Cancer Sci 2018;109(8):2497-2508 doi:10.1111/cas.13695 10 Ghosh J, Kapur R Regulation of Hematopoietic Stem Cell Self-Renewal and Leukemia Maintenance by the PI3K-mTORC1 Pathway Curr Stem Cell Rep 2016;2(4):368378 doi:10.1007/s40778-016-0067-z 11 Platt RJ, Chen S, Zhou Y, et al CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling Cell 2014;159(2):440455 doi:10.1016/j.cell.2014.09.014 Summary A STUDY ON GENE EDITING BY CRISPR/CAS9 SYSTEM IN CANCER CELL LINE CRISPR/Cas9 system is one of the most high efficiency tool that could allow for clinical utilization to editing the gene of interest The aim of study is editing RAPTOR and Atg5 gene on chronic myeloid leukemia cell line K562 and human glioma cell line TGS04 by using CRISPR/ Cas9 system The targeted sequences of sgRNA were designed and inserted into the pX330 plasmid The pX330- inserted target sgRNA plasmids were transfected to targeted cells by electroporation RAPTOR and Atg5 gene disruption were confirmed by PCR, sequencing and Western blotting The results showed that CRISPR/Cas9 system could delete exon3 on RAPTOR gene; knockout Atg5 gene consequently significantly simultaneously increase and decrease protein expression levels of LC3I and LC3II Therefore, CRISPR/Cas9 system could edit gene of interest resulting in alteration of proteins and other products in their pathway Keywords: CRISPR/Cas9, gene therapy, cancer cell line TCNCYH 126 (2) - 2020 ... Atsushi Hirao, Trung tâm ung Nghiên cứu tuân thủ quy định đạo thư, trường Đại học Kanazawa, Nhật Bản7 đức nghiên cứu y sinh Các thí nghiệm Tế bào ung thư máu tế bào ung thư não nghiên cứu tuân thủ... sàng, đặc biệt trị liệu gen liệu pháp điều trị miễn dịch ung thư. 2,9,10 V KẾT LUẬN Nghiên cứu hiệu gây đột biến gen RAPTOR Atg5 dòng tế bào ung thư máu ung thư não hệ thống CRISPR/Cas9 Hiệu gây... vai trò quan trọng gen tế bào ung thư, đột biến gen đưa lại hiệu điều trị khác biệt rõ rệt ung thư máu ung thư não.8–10 Nghiên cứu hệ thống CRISPR/Cas9 xóa hồn tồn exon3 gen RAPTOR cách sử dụng