Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Cattleya mini

Bài viết Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan đến quá trình nhân giống in vitro cây lan Cattleya mini tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (auxin, cytokinin) và chitosan lên sự tăng trưởng và nhân nhanh chồi của lan Cattleya mini.

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ CHITOSAN ĐẾN QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN CATTLEYA MINI Nguyễn Trọng Nguyễn Nguyễn Thị Xuân Đào* *Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD:: TS Trịnh Thị Lan Anh TÓM TẮT Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (auxin, cytokinin) chitosan lên tăng trưởng nhân nhanh chồi lan Cattleya mini Kết cho thấy việc bổ sung mg/l BA kết hợp với 1,5 mg/l NAA mẫu cấy tăng trưởng tạo chồi tối ưu sau 12 tuần nuôi cấy Khi bổ sung chitosan với nồng độ (0; 5; 10;15; 20; 25) vào môi trường nuôi cấy tối ưu thu kết cho thấy việc bổ sung chitosan nồng độ mg/l mẫu cấy tăng trưởng phát triển tối ưu trọng lượng tươi, số chồi, số lá, hình thái mẫu cấy, chất lượng chồi, thí nghiệm cho thấy việc bổ sung chitosan nồng độ (5; 10;15; 20; 25) không phù hợp cho trình tạo chồi lan Cattlaya mini Từ khóa: chất điều hịa sinh trưởng thực vật, nhân giống, Cattlaya mini, chitosan, tạo hoàn chỉnh ĐẶT VẤN ĐỀ Cattleya giống lan đẹp họ Orchidaceae, gồm nhiều loài xuất phát từ châu Mỹ, Ben tham Hooker chấp nhận có khoảng 20 loài, số tăng lên nhiều khoảng 65 lồi, chưa kể vơ số lai Được biết, Cattleya giống lan có nhiều lai họ lan Kích thước hoa lớn với bề rộng 15 – 20 cm hoa có màu sắc phong phú Cattleya gọi Nữ hồng lồi hoa hoa to mà hương sắc lại vẹn toàn, Queen of the flowers: (William Cattlye 1818) Ngồi Cattleya có đặc tính nở hoa quanh năm Đa số hoa nở vào mùa Xuân Thu lai ghép giống nở lúc năm Đặc biệt dòng lan Cattleya mini nhiều người ưa chuộng Kích thước nhỏ, hương thơm, nhiều màu sắc lạ dịng lan Cattleya phổ thơng giúp tạo nhiều ấn tượng lòng người chơi lan Đối với nước có cơng nghiệp hoa lan phát triển mạnh Thái Lan, Hà Lan, Đài Loan Trung Quốc, lan nói chung Cattleya nói riêng đầu tư sâu nghiên cứu để khơng tạo giị lan đẹp mà cịn có giá cạnh tranh Do việc giảm giá thành giống để cung cấp cho người sản xuất, mở rộng diện tích vấn đề xúc Chính để giải vấn đề tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục đích tìm hiểu rõ mơi trường ni cấy Mục tiêu đề tài này: Xác định nồng độ BA NAA thích hợp lên khả tạo chồi lan Cattleya mini, đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi bổ sung chitosan môi trường nuôi cấy mô lan Cattleya mini VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 505 Nguồn mẫu sử dụng đề tài tạo từ chồi có chiều cao mm, giống phong lan Cattleya mini phịng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng Hutech, Trường Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh 2.2 Mơi trường ni cấy Các thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật thường quy Mơi trường sử dụng thí nghiệm mơi trường MS (Murashige Shoog, 1962), tùy vào giai đoạn ni cấy mà hóa chất khác nhau, chất điều hòa sinh trưởng khác sử dụng riêng lẻ kết hợp Các chất bổ sung bao gồm: chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzylaminopurine); chitosan (là polysaccharide mạch thẳng cấu tạo từ D-glucosamine NGlucosamine liên kết vị trí β-(1-4) sản xuất từ q trình xử lý vỏ lồi giáp xác: tơm, cua, ), agar, nguồn carbon: sucrose; nước dừa 2.3 Phương pháp 2.3.1 Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vơ trùng, thí nghiệm thực phịng ni riêng với điều kiện: nhiệt độ: 25 ± 2oC; cường độ sáng: 2500 – 3000 lux; thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày; độ ẩm trung bình: 85 – 90% 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini Bảng 1: Bố trí nghiệm thức kết hợp BA với nồng độ cố định NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l) A0 0,5 A1 0,5 1,0 A2 1,5 A3 2,0 A4 2,5 A5 2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi lan Cattleya mini Bảng 2: Bố trí nghiệm thức kết hợp NAA với nồng độ BA cố định lên tạo chồi lan Cattleya mini Nghiệm thức NAA (mg/l) 506 BA (mg/l) A0 0,5 A1 1,0 1,0 A2 1,5 A3 2,0 A4 2,5 A5 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya mini Bảng 3: Bố trí nghiệm thức kết hợp Chitosan với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi lan Cattleya mini Nghiệm thức Chitosan A0 A1 A2 10 A3 15 A4 20 A5 25 BA (mg/l) NAA (mg/l) 1,0 1,5 2.3.2 Chỉ tiêu theo dõi Các tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu sinh học thông dụng: khối lượng tươi (g), số chồi (chồi/mẫu), số (lá/cây), số rễ (rễ/cây), đặc điểm 2.3.3.Thống kê xử lý số liệu Xử lý số liệu thu phần mềm Microsoft Excel 2010® phần mềm SAS 9.1 Tất số liệu sau thu thập ứng với tiêu theo dõi, thống kê biểu diễn dạng giá trị trung bình ký tự a,b,… khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a,b,…) sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 507 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya mini cấy trực tiếp vào môi trường MS phản ứng chúng khác nuôi cấy môi trường thạch MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, g/l agar, g/l than hoạt tính, 20% nước dừa nồng độ BA tăng dần (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5) mg/l Chúng tiến hành thu thập số liệu Kết trình bày bảng Bảng 4: Ảnh hưởng BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên tạo chồi lan sau 12 tuần nuôi cấy NT A0 BA Khối Số chồi Số Số rễ (mg/l) lượng (chồi/mẫu (lá/cây) (rễ/mẫu) tươi (g) ) 2,170c 6,33c 15,66c 24,67b 0,0 Đặc điểm Cây to phát triển bình thường, rễ dài, to chồi A1 A2 0,5 3,174b 10,33b 35,67b 23,67b Cây phát triển tốt, to dài 1,0 7,415a 13,33a 44,67a 51a Cây phát triển xanh tốt, chồi nhiều, nhiều, nhiều rễ, chồi cao A3 1,5 1,528c 5,67cd 12,33c 13,67c Cây phát triển khơng đều, chồi rễ nhiều mà ngắn A4 2,0 1,807c 1,33e 15c 17,33bc Cây phát triển không đều, nhiều chồi, nhỏ, rễ ngắn A5 2,5 2,364bc 3,33de 3,33c 17,00bc Cây phát triển chậm, chồi, nhỏ ít, rễ dài, thấp Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… khơng có khác biệt mặt thống kê.các mẫu tự khác (a, b,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Khi kết hợp 0,5 mg/l NAA với nồng độ BA tăng dần từ ( 0; 0,5; 1,0 mg/l) tiêu với trọng lượng tươi (7,415a), số chồi (13,33a), số (44,67a), số rễ (51a) mẫu cấy tăng Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ BA cao 1,0 mg/l 2,5 mg/l tiêu tăng trưởng có xu hướng giảm dần, cho thấy việc bổ sung sung BA nồng độ (1,0 mg/l) kết hợp với NAA cố định (0,5 mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết tối ưu Kết phù hợp với kết thí nghiệm Đàm Sao Mai cộng (2009) cho nồng độ BA phù hợp cho hình thành chồi Thơng đỏ thí nghiệm 1,0 mg/l Tương tự với kết trên, trường hợp Populus tremila L Bueno cộng (2003) dùng BA 1,0 mg/l để tạo chồi tối ưu 508 3.2 Ảnh hưởng NAA kết hợp với nồng độ cố định BA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya mini cấy trực tiếp vào môi trường MS phản ứng chúng khác ni cấy mơi trường thạch MS có bổ sung 1,0 mg/l BA, 9,0 g/l agar, 1,0 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa nồng độ NAA tăng dần (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5) mg/l Chúng tiến hành thu thập số liệu Kết trình bày bảng Bảng 5: Ảnh hưởng NAA kết hợp với nồng độ cố định BA lên tạo chồi lan sau Cattleya mini 12 tuần nuôi cấy NT B0 NAA Khối Số chồi Số Số rễ (mg/l) lượng (chồi/mẫu (lá/cây) (rễ/mẫu) tươi (g) ) 8,034b 48,66 b 20,33b 0,00c Đặc điểm Cây phát triển bình thường, to chồi B1 B2 0,5 5,504d 36,33d 15,00c 0,00c Cây phát triển không tốt, 1,0 6,875 c 43,33c 19,00 b 0,00c Cây phát triển khơng đều, chồi B3 1,5 9,887a 60,00a 27,66a 43,00a Cây phát triển xanh tốt, chồi nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, to xanh B4 2,0 4,483e 29,00e 14,00c 33,00b Cây phát triển không đều, nhiều chồi, nhỏ, rễ ngắn B5 2,5 4,265e 28,66e 12,00c 0,00c Cây phát triển chậm, chồi, nhỏ Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… khơng có khác biệt mặt thống kê.các mẫu tự khác (a, b,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Khi kết hợp 1,0 mg/l BA với nồng độ NAA tăng dần từ ( 0; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l) tiêu với trọng lượng tươi (9,887a), số chồi (60,00a), số (27,66a), số rễ (43,00a) mẫu cấy tăng Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ BA cao 1,5 mg/l 2,5 mg/l tiêu tăng trưởng có xu hướng giảm dần, cho thấy việc bổ sung sung NAA nồng độ (1,5 mg/l) kết hợp với BA cố định (1,0 mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết tối ưu Kết tương ứng với kết thí nghiệm Đàm Sao Mai cộng sự, (2009) Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) cho bổ sung NAA nồng độ 1,5 mg/l vào mơi trường ni cấy cho hình thành rễ tốt nhất, hay kết thí nghiệm Nguyễn Văn Ây Lê Văn Hòa (2010) Tre rồng cho thấy bổ sung NAA nồng độ – mg/l thích hợp cho tạo rễ invitro 509 3.3 Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định BA, NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya mini cấy trực tiếp vào môi trường MS phản ứng chúng khác nuôi cấy môi trường thạch MS có bổ sung g/l agar, g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1,0 mg/l BA, 1,5 mg/l NAA nồng độ chitosan tăng dần (0; 5; 10; 15; 20; 25) mg/l Chúng tiến hành thu thập số liệu Kết trình bày bảng Bảng 6: Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định BA, NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy NT C0 Nồng Khối Số chồi Số Tỷ lệ độ lượng (chồi/mẫu (lá/cây) sống xót (mg/l) tươi (g) ) 7,643a 332,66a Đặc điểm (%) 152,33a 100 Cây phát triển xanh tốt, to xanh, nhiều chồi, nhiều C1 1,444d 47,66c 28,33cd 66 Cây phát triển không tốt, nhỏ C2 10 3,236b 133,00b 63,33b 95 Cây phát triển đều, nhiều chồi, mẫu sống tốt C3 15 1,919c 32,00d 33,66c 70 Cây phát triển không đều, chồi ít, C4 20 1,246d 25,00d 25,00d 68 Cây phát triển không đều, mẫu chết dần C5 25 1,338d 21,66d 22,00d 60 Cây phát triển chậm, chồi, mẫu chết nhiều Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b,… khơng có khác biệt mặt thống kê.các mẫu tự khác (a, b,…) sai khác thống kê với p < 0,05 Sau thí nghiệm 2, xác định nồng độ BA, NAA tối ưu cho tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm tìm nồng độ chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định cho tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White Mục đích: xác định nồng độ chitosan thích hợp cho hình thành chồi lan Cattleya Hyrid White 510 Khi kết hợp 1,0 mg/l BA, NAA 1,5 mg/l với nồng độ chitosan tăng dần từ (0; 5; 10; 15; 20; 25 mg/l) nghiệm thức C0 (0 mg/l chitosan) cho tiêu với trọng lượng tươi (7,643a), số chồi (332,66a), số (2152,33a), tỷ lệ sống sót (100) mẫu cấy tăng Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ chitosan cao mg/l 25 mg/l tiêu tăng trưởng có xu hướng giảm dần, cho thấy việc bổ sung sung chitosan nồng độ (0 mg/l) kết hợp với BA cố định (1,0 mg/l), NAA cố định (1,5 mg/l) vào môi trường ni cấy cho kết tối ưu Qua thí nghiệm việc bổ sung Chitosan nồng độ (5; 10;15; 20; 25) khơng phù hợp cho q trình tạo chồi lan Cattlaya mini Theo Uthairatanakij cộng (2007), mức độ khử acetyl nồng độ chitosan có hiệu khác lên sinh trưởng phát triển lan nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, nồng độ chitosan xử lý từ – 25 mg/l thí nghiệm cho hiệu lên sinh trưởng cụm chồi lan Cattleya khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (a) (b) (c) Hình 1: Vai trị BA, NAA chitosan tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần ni cấy Hình a: Ảnh hưởng BA kết hợp với nồng độ cố định NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy (nghiệm thức A2: 1,0 mg/l BA) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu Hình b: Ảnh hưởng NAA kết hợp với nồng độ cố định BA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy (nghiệm thức B3: 1,5 mg/l NAA) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu Hình c: Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định BA, NAA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy (nghiệm thức A0: mg/l chitosan) mẫu cấy tăng trưởng tối ưu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ nghiên cứu thu kết sau: bổ sung BA nồng độ (1mg/l) kết hợp với NAA cố định (0,5mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết tối ưu bên cạnh việc bổ sung NAA nồng độ (1,5mg/l) kết hợp với BA cố định (1mg/l) vào môi trường nuôi cấy giúp cho mẫu cấy tăng trưởng phát triển xanh tốt, chồi nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, to.Qua thí nghiệm sử dụng chitosan nồng độ (0mg/l) kết hợp với NAA cố định (0,5mg/l), BA cố định (1mg/l) vào môi trường nuôi cấy cho kết tối ưu 511 Thí nghiệm cho thấy việc bổ sung chitosan nồng độ nghiên cứu khơng phù hợp cho q trình tạo chồi nhân nhanh lan Cattlaya mini 4.2 Kiến nghị Vì thời gian tiến hành nghiên cứu hạn chế nên chưa thực nghiên cứu sâu cần tiếp tục nghiên cứu: − Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường có bổ sung dịch chiết khác chuối, táo, khoai tây, cà rốt, đến hình thành chồi lan Cattleya mini − Nghiên cứu điều kiện ánh sáng, giá thể khác để hồn thiện quy trình nhân giống lan Cattleya mini đưa vườn TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Văn Ây Lê Văn Hòa (2010) Nhân giống tre rồng (Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro) kỹ thuật nuôi cấy mô Kỷ yếu Hội nghị Khoa Học “Phát triển nơng nghiệp bền vững thích ứng với biến đổi khí hậu” NXB Nơng Nghiệp, trang 298-306 [2] Trần Văn Bảo (2001) Kỹ thuật nuôi trồng phong lan Nhà xuất Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Tiến Bân ,1990, Các hạt kín Việt Nam, tuyển tập cơng trình nghiên cứu sinh thái tài nguyên sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [4] Bueno, M.A., Gomez, A., Manzanera, J.A (2003) Propagation and DNA Markers Characterization of Populus Tremula L and Populus Alba L In: Jain, S.M., Ishii, K (eds) Micropropagation of Woody Trees and Fruits [5] Nguyễn Minh Chơn (2010) Giáo trình chất điều hịa sinh trưởng thực vật NXB Đại Học Cần Thơ [6] Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên (1998) Sa Pa nguồn lan rừng quý Tạp chí Rau hoa số 1/1998 [7] Đàm Sao Mai, Nguyễn Thành Sum, Trần Khánh Viễn (2009) Nhân giống in vitro thơng đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) lồi cổ thực vật có giá trị dược liệu cao Tuyển tập hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam 2009 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh, trang 259264 [8] Murashige T., Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Plant Physiol., 15, pp 473-74 [9] Lê Võ Thùy Ngân 2011 Hiệu BA, TDZ, NAA AgNO3 tạo chồi, nhân chồi sinh trưởng Đỗ quyên (Rhododendron sp.) in vitro Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Hoa viên - cảnh, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Đại Học Cần Thơ 512 [10] Uthairatanakij A., Jaime A Teixeira da Silva, and K Obsuwan (2007) Chitosan for Improving Orchid Production and Quality Orchid Science and Biotechnology, 1(1), pp 1-5 513 ... hợp Các chất bổ sung bao gồm: chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzylaminopurine); chitosan (là polysaccharide mạch thẳng cấu tạo từ D-glucosamine... Alba L In: Jain, S.M., Ishii, K (eds) Micropropagation of Woody Trees and Fruits [5] Nguyễn Minh Chơn (2010) Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật NXB Đại Học Cần Thơ [6] Nguyễn Xuân Linh,... mg/l để tạo chồi tối ưu 508 3.2 Ảnh hưởng NAA kết hợp với nồng độ cố định BA lên tạo chồi lan Cattleya mini sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya mini cấy trực tiếp vào môi trường MS phản ứng chúng