(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt

T Ổ NG QUAN

C ấ u t ạ o và ch ức năng củ a b ề m ặ t nhãn c ầ u và các y ế u t ố liên quan

Bề mặt nhãn cầu bao gồm lớp biểu mô được giới hạn bởi đường xám của mi trên và mi dưới, với các thành phần chính là biểu mô kết mạc, giác mạc và vùng rìa Sự ổn định của bề mặt nhãn cầu (BMNC) phụ thuộc vào tính toàn vẹn về giải phẫu và chức năng sinh lý của các yếu tố liên quan như mi mắt, phim nước mắt, và biểu mô của kết mạc, giác mạc.

Mi mắt đóng vai trò thiết yếu trong việc phân bố đều phim nước mắt, giúp bôi trơn bề mặt nhãn cầu và bảo vệ mắt thông qua hoạt động nhắm và chớp mắt Sụn mi chứa tuyến Meibomius, có chức năng tiết ra lipid cho phim nước mắt, trong khi kết mạc mi chứa các tế bào đài tiết chất nhày, tạo thành lớp mucin của phim nước mắt Bên cạnh đó, các tuyến lệ phụ trong kết mạc cung cấp nước, góp phần duy trì độ ẩm cho phim nước mắt.

1.1.2 Cấu tạo và chức năng của phim nước mắt

Nước mắt bao gồm hai loại chính: nước mắt cơ bản không do phản xạ, chiếm 99%, được tiết ra từ các tuyến lệ phụ, và nước mắt phản xạ, được cung cấp từ tuyến lệ chính khi có kích thích Trong trường hợp tổn thương thần kinh nhận cảm, như vô cảm tại chỗ hoặc toàn thân, hoặc khi dây thần kinh cảm giác của giác mạc bị cắt đứt sau phẫu thuật lasik, hoặc trong các bệnh nhiễm trùng ảnh hưởng đến thần kinh như herpes và zona, việc tiết nước mắt sẽ giảm rõ rệt Các sợi vận động của thần kinh mặt điều khiển cơ vòng mi và kích thích phản xạ chớp mắt, giúp phân bố nước mắt đều trên bề mặt nhãn cầu.

Nước mắt có tác dụng bảo vệ bề mặt nhãn cầu, ổn định khúc xạ bề mặt, đảm bảo chức năng thị giác Phim nước mắt bao gồm 3 lớp:

Lipid: tiết ra từ tuyến Meibomius, có khả năng dàn trải đều trên BMNC, góp phần ổn định khúc xạ và ngăn cản nước bốc hơi

Nước chứa các thành phần kháng khuẩn như peroxidase, lactoferin và IgA, giúp chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do, từ đó giảm thiểu tổn thương tế bào nhờ vào vitamin C và glutathion Ngoài ra, nước còn cung cấp các yếu tố phát triển, chất ức chế protease và neuropeptidase, hỗ trợ quá trình liền vết thương Bên cạnh đó, glucose và các điện giải như calcium, bicarbonat và phosphate cung cấp dinh dưỡng thẩm thấu cần thiết cho giác mạc.

Nồng độ điện giải của lớp này tương tự huyết thanh với áp suất thẩm thấu 300 mOsmol/l, giữ ổn định kích thước tế bào và cân bằng hoạt động enzym Tăng áp suất thẩm thấu gây sức ép cho tế bào biểu mô, dẫn đến tăng giải phóng các chất trung gian gây viêm như MMP-9 và kích thích đáp ứng miễn dịch ở kết mạc, từ đó gây ra phản ứng viêm tại khu vực này.

Mucin là glycoprotein quan trọng gắn kết với lớp vi nhung mao của biểu mô kết giác mạc, bao gồm hai loại chính: mucin được chế tiết và mucin gắn kết tế bào Mucin được chế tiết lại chia thành hai loại: loại hòa tan, nằm gần lớp lipid của nước mắt, và loại tạo keo, nằm tiếp giáp với biểu mô kết giác mạc.

Mucin tiết ra có vai trò quan trọng trong việc làm sạch dị nguyên, cặn bã tế bào và vi khuẩn Mucin gắn tế bào, hay còn gọi là màng gắn mucin, tạo thành glycocalyx, kết hợp với mucin loại keo để hình thành lớp bảo vệ tối ưu cho biểu mô, ngăn chặn quá trình khô.

1.1.3 Cấu trúc và chức năng của kết mạc

Kết mạc được cấu tạo từ biểu mô không sừng hóa gắn với màng đáy, bên dưới là mô đệm chắc, tạo thành lớp áo bảo vệ nhãn cầu Các khớp nối giữa các đỉnh tế bào và thể liên kết tạo nên tính thấm chọn lọc của biểu mô, giúp duy trì sự ổn định của phim nước mắt Tế bào đài, chiếm 5-10% trong lớp tế bào đáy của biểu mô kết mạc, chủ yếu tập trung ở kết mạc nhãn cầu phía mũi dưới và kết mạc sụn mi, có vai trò quan trọng trong việc tiết mucin, thành phần thiết yếu của phim nước mắt Lớp dưới biểu mô chứa các tuyến lệ phụ Krause và Wolfring, cung cấp nước cho phim nước mắt, trong khi chất đệm dưới biểu mô là mô liên kết thưa chứa lympho bào, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của kết mạc.

1.1.4 Biểu mô giác mạc và vùng rìa

Biểu mô vùng rìa là khu vực chuyển tiếp giữa biểu mô giác mạc và kết mạc, nằm cách bờ trong khoảng 1,5 đến 2 mm Vùng này được cấu tạo từ biểu mô lát tầng không sừng hóa, khác biệt với kết mạc do không có tế bào đài Lớp đáy của biểu mô vùng rìa chứa các tế bào gốc có khả năng tăng sinh mạnh mẽ, nhưng ít biệt hóa, chính là nguồn gốc của biểu mô giác mạc.

Tế bào gốc tập trung tại hốc vùng rìa, tạo thành cấu trúc giống như nhú, được gọi là hàng rào Vogt Hàng rào Vogt có hình dạng những nếp hình nan hoa, rộng khoảng 1mm, có thể quan sát được thông qua sinh hiển vi đèn khe và hiển vi đồng tiêu cự.

Là lớp biểu mụ lỏt tầng khụng sừng húa dầy khoảng 50àm, gồm 5-7 hàng tế bào

Tế bào biểu mụ bề mặt bao gồm 2-4 lớp tế bào đa giác dẹt, dày khoảng 50 micromet, với nhiều vi nhung mao giúp tăng diện tích bề mặt, từ đó cải thiện khả năng hấp thu oxy và chất dinh dưỡng từ phim nước mắt Liên kết chặt chẽ giữa các tế bào tạo ra hàng rào bảo vệ cho biểu mô Các tế bào này là các tế bào biệt hóa cao, không có khả năng phân chia Đặc trưng của tế bào biểu mô bề mặt là sự hiện diện của nhiều phân tử glycolipid và glycoprotein trên màng tế bào, tạo thành lớp glycocalyx kết nối với mucin (MUCs) của lớp phim nước mắt, giúp ổn định phim nước mắt Ba loại mucin chính là MUCs 1 với vai trò kết dính và ngăn chặn tác nhân bệnh lý, MUCs 4 duy trì sự ổn định của nước mắt, và MUCs 16 tạo hàng rào bảo vệ trước tác nhân gây hại.

Tế bào biểu mụ dạng cỏnh trước lớp đỏy bao gồm 2-3 lớp tế bào dày 15àm, được sắp xếp đan xen thành hình cánh Những tế bào này ở giai đoạn biệt hóa trung gian giữa tế bào bề mặt và tế bào đáy, và hiếm khi phân chia.

Tế bào biểu mụ đỏy là lớp tế bào trụ đơn cao 8-10 µm nằm trên màng đáy, có khả năng phân chia và chứa nhiều bào quan hơn các tế bào khác trong biểu mô giác mạc Chúng liên kết với nhau thông qua dải bịt, thể liên kết và liên kết khe, đồng thời chứa thể bán liên kết và các phức hợp gắn kết với màng đáy Các tế bào này không chỉ tổng hợp một phần màng đáy mà còn có các tấm neo chứa collagen type 1, đóng vai trò quan trọng trong sự dính kết của biểu mô vào màng đáy.

Màng đỏy: dày 0,11-0,55àm, cấu tạo bởi collagen type 4 và laminin

Màng đáy đóng vai trò quan trọng trong việc phân cực và di cư của các tế bào biểu mô tăng sinh, góp phần duy trì cấu trúc phân tầng của biểu mô một cách trật tự và liên tục.

Quá trình tự đổi mới của biểu mô giác mạc diễn ra trong khoảng 5-7 ngày, trong đó các tế bào đáy phân bào và tăng sinh, di chuyển hướng tâm về bề mặt giác mạc Khi đến bề mặt, chúng biệt hóa thành các tế bào trước lớp đáy, tế bào cánh, và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt, rồi chuyển thành tế bào vảy và tróc ra khỏi bề mặt Thoft và Friend đã đưa ra giả thiết về sự duy trì của biểu mô giác mạc, trong đó tổng số tế bào tăng sinh từ lớp đáy (X) và tế bào di cư hướng tâm vào giác mạc (Y) bằng với số tế bào bề mặt bị tróc (Z), thể hiện qua công thức X + Y = Z.

R ố i lo ạ n b ề m ặ t nhãn c ầ u

BMNC giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì độ trong suốt của giác mạc, cung cấp bề mặt khúc xạ phù hợp cho mắt và bảo vệ mắt khỏi các tác nhân bên ngoài.

Sự mất ổn định của BMNC do chấn thương và bệnh lý khác có thể gây ra rối loạn ở kết mạc và giác mạc, từ tróc nhẹ biểu mô đến suy giảm nặng tế bào gốc vùng rìa giác mạc, dẫn đến giảm thị lực nghiêm trọng và nguy cơ mù lòa.

Rối loạn bề mặt nhãn cầu là kết quả của tổn hại tế bào gốc biểu mô giác mạc ở vùng rìa Khi tổn hại chỉ xảy ra một phần, các vùng biểu mô kết mạc có thể che phủ vùng tổn thương giác mạc, giúp duy trì một phần chức năng thị giác Tuy nhiên, nếu tế bào gốc vùng rìa bị tổn thương nghiêm trọng, sẽ dẫn đến rối loạn nặng nề của bề mặt nhãn cầu.

1.2.1 Chẩn đoán lâm sàng: Bệnh nhân có thể xuất hiện một hoặc nhiều các dấu hiệu như sau

1.2.1.1 Tri ệ u ch ứng cơ năng : giảm thị lực, sợ ánh sáng, chảy nước mắt, co quắp mi, cảm giác bỏng rát hoặc đau nhức cùng với tiền sử viêm mạn tính

1.2.1.2 Tri ệ u ch ứ ng th ự c th ể

-Tình trạng mi, tuyến Meibomius có thể bị rối loạn, phát hiện bằng máy sinh hiển vi đèn khe

-Rối loạn lớp phim nước mắt thể hiện qua các test BUT, Schirmer, bộ câu hỏi cho bệnh nhân khô mắt

-Các tổn thương biểu mô kết giác mạc biểu hiện qua các test nhuộm bề mặt nhãn cầu bằng Fluorescein, hồng Bengal, xanh Lissamin

-Biểu mô giác mạc mỏng, gồ ghề, tróc biểu mô tái phát, khuyết biểu mô dai dẳng dẫn đến loét, nhuyễn hoại tử hoặc thủng giác mạc

Biểu mô kết mạc xâm lấn vào giác mạc, còn được gọi là "kết mạc hóa giác mạc", dẫn đến sự mất cấu trúc giải phẫu của hàng rào Vogt ở vùng rìa.

-Tân mạch nông và sâu xâm lấn vào trung tâm giác mạc, mang theo xơ và sẹo đục giác mạc, có thể xuất hiện vôi hóa

- Giai đoạn cuối trầm trọng dẫn tới sừng hóa của BMNC

1.2.2 Chẩn đoán về cận lâm sàng

Một số xét nghiệm hỗ trợ chẩn đoán và xác định mức độ nặng của bệnh

Test áp tế bào (Impression cytology) [12]: phát hiện sự xuất hiện của tế bào đài trên giác mạc hoặc bất thường biểu mô của BMNC

Sinh thiết biểu mô kết giác mạc là phương pháp giúp phát hiện các bệnh dị ứng, tăng sản và các bệnh miễn dịch thông qua các kỹ thuật như hiển vi điện tử, hóa mô miễn dịch và xét nghiệm sinh học phân tử.

Xét nghiệm chất nạo biểu mô BMNC cung cấp hình ảnh tế bào học của bề mặt mắt Đo liềm nước mắt và áp suất thẩm thấu của nước mắt giúp đánh giá tình trạng nước mắt Để xác định độ dày lớp nước mắt, máy giao thoa được sử dụng, cùng với chụp tuyến Meibomius để đánh giá mức độ khô mắt Cuối cùng, đo cảm giác giác mạc giúp phát hiện tình trạng giảm cảm giác tại vùng này.

Soi hiển vi đồng tiêu cự (Confocal microscopy)[17],[18]:Quan sát hình thái tế bào của BMNC trong bệnh lý khô mắt hoặc viêm, chẩn đoán rối loạn tuyến Meibomius

Test nhanh xác định dấu ấn phản ứng viêm cho thấy MMP-9 tăng trong nước mắt là yếu tố quan trọng trong việc xác định sự tồn tại của phản ứng viêm ở BMNC.

1.2.3 Các nguyên nhân gây rối loạn bề mặt nhãn cầu

Viêm bờ mi có thể do tụ cầu hoặc tăng tiết bã, gây ra rối loạn chức năng tuyến Meibomius Tình trạng này dẫn đến sự mất ổn định của phim nước mắt, ảnh hưởng đến sức khỏe của biểu mô và bề mặt mắt Các độc tố từ phản ứng viêm gây tổn thương màng tế bào và làm suy yếu bề mặt mắt Viêm bờ mi mạn tính có thể gây tổn thương vùng rìa giác mạc, làm giảm số lượng tế bào gốc và dẫn đến tân mạch giác mạc.

Khô mắt là một bệnh lý phức tạp liên quan đến nước mắt và bề mặt nhãn cầu, gây ra các triệu chứng khó chịu, rối loạn thị giác và mất ổn định của phim nước mắt Bệnh lý này có thể dẫn đến tổn thương bề mặt nhãn cầu, kèm theo sự gia tăng áp lực thẩm thấu của phim nước mắt và phản ứng viêm tại bề mặt nhãn cầu.

Phim nước mắt đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự toàn vẹn và ổn định của bề mặt mô mắt (BMNC) Khi gặp tình trạng khô mắt nặng, khả năng thanh thải của phim nước mắt giảm, dẫn đến sự tích tụ của cytokine IL-1 và enzym MMP-9 trên BMNC Điều này gây ra phản ứng viêm và giải phóng độc tố, làm biến đổi biểu mô BMNC, dẫn đến sự biệt hóa bất thường, giảm tiết mucin và rối loạn chức năng của BMNC.

Viêm k ế t m ạ c d ị ứ ng: 2 thể viêm dịứng nặng gây rối loạn BMNC

Viêm kết mạc dị ứng mạn tính (Atopic keratoconjunctivitis) là thể bệnh nghiêm trọng nhất của viêm kết mạc dị ứng, thường gặp ở những người có cơ địa quá mẫn Bệnh liên quan đến cơ chế đáp ứng miễn dịch và thường biểu hiện mạn tính ở người lớn tuổi, gây rối loạn bề mặt niêm mạc kết mạc và kèm theo tổn thương da vùng mí mắt.

Viêm kết mạc mùa xuân (Vernal keratoconjunctivitis) là tình trạng bệnh lý liên quan đến sự gia tăng mật độ các giác mạc bào hoạt hóa và tế bào viêm trên bề mặt niêm mạc mắt Bệnh nhân thường có biểu hiện tăng kích thước biểu mô, gia tăng cytokin và các tế bào miễn dịch Những yếu tố này kích thích phản ứng viêm, dẫn đến sự tăng sinh xơ Nếu tình trạng này kéo dài mạn tính, nó có thể gây ra biến đổi cấu trúc mô và sẹo hóa niêm mạc mắt.

Mộng là tổn thương thường gặp ở bệnh nhân mắc bệnh màng nước mắt, xảy ra do sự xâm lấn vào giác mạc từ phần kết mạc nhãn cầu bị biến đổi Hệ quả là sự suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc, dẫn đến xơ mạch xâm nhập vào giác mạc và kích thích phản ứng viêm, giải phóng cytokine và các men tiêu phức hợp ngoại bào, đặc biệt trong trường hợp mộng tái phát.

Tổn thương ở mắt có nhiều mức độ, từ loạn sản lành tính kết giác mạc đến tân sản tiền xâm lấn như tân sản nội biểu mô (CIN) với các mức độ nhẹ, vừa và nặng (CIS) Những tổn thương nặng có thể dẫn đến ung thư tế bào vảy Thường thì tổn thương lâm sàng xảy ra quanh rìa vùng khe mi (95%), gây phá hủy cấu trúc bình thường của BMNC và làm tổn hại tế bào gốc Sau điều trị, tùy vào mức độ tổn thương, bệnh nhân có thể gặp di chứng suy giảm tế bào gốc và rối loạn BMNC.

Điề u tr ị r ố i lo ạ n b ề m ặ t nhãn c ầ u

Trong điều trị rối loạn BMNC, bước đầu tiên và quan trọng là điều trị nội khoa, có thể kết hợp với phẫu thuật khi cần thiết Việc điều trị nội khoa tập trung vào kiểm soát tình trạng viêm và điều hòa phim nước mắt, nhằm thúc đẩy quá trình hàn gắn biểu mô BMNC Một phương pháp điều trị nội khoa hiệu quả không chỉ cải thiện tình trạng BMNC mà còn nâng cao hiệu quả của phẫu thuật hoặc giúp tránh phẫu thuật không cần thiết.

1.3.1.1 Các thu ố c tra m ắ t Thuốc chống viêm

Corticosteroid giúp kiểm soát tình trạng viêm của BMNC thông qua cơ chế ức chế phospholipase A2 và điều chỉnh sinh tổng hợp hóa chất trung gian trong phản ứng viêm Dexamethasone mạnh hơn prednisolone nhưng thẩm thấu vào nhãn cầu kém hơn Flumetholone và loteprednol có hiệu lực yếu hơn nhưng an toàn hơn, ít gây biến chứng tăng nhãn áp Cần thận trọng khi sử dụng corticosteroid trong thời gian dài do nguy cơ gặp phải các tác dụng phụ.

Cyclosporine A (CsA) là một chất ức chế cytokine gây viêm và hoạt hóa tế bào T, ngăn chặn quá trình sản xuất Interleukin-2 từ lympho T hỗ trợ CsA được sử dụng tại chỗ và đã chứng minh hiệu quả trong điều trị nhiều tình trạng như viêm giác mạc nhu mô do Herpes, bệnh mắt rosacea, bệnh thải loại mảnh ghép-vật chủ, viêm kết mạc mùa xuân, viêm kết mạc dị ứng atopy, và khô mắt nặng.

-Tacrolimus: ức chế miễn dịch phong tỏa sao chép IL-2, ức chế kháng nguyên trình diện tế bào Langerhans, giảm hoạt hóa lympho T [45]

-Azithromycin: có đặc tính chống viêm qua khả năng ức chế sản xuất các tiền tố viêm cytokin và phức hợp tiêu protein ngoại bào (MMP) [46]

Nước mắt nhân tạo giúp giữ ẩm và tăng độ nhớt, đồng thời hỗ trợ dính kết biểu mô và bổ sung lipid Sản phẩm này còn chứa ion bicarbonat, thúc đẩy quá trình hàn gắn biểu mô Để tránh gây độc cho biểu mô, ưu tiên lựa chọn các sản phẩm không chứa chất bảo quản.

-Vitamin A là yếu tố cần thiết duy trì biểu mô, hiệu quả trong điều trị khô mắt, sừng hóa kết giác mạc

Huyết thanh tự thân chứa nhiều yếu tố sinh học tương đồng với nước mắt tự nhiên, bao gồm pH, áp suất thẩm thấu, EGF, vitamin A, yếu tố tăng trưởng β, IgA, lysozym và fibronectin, giúp hàn gắn tổn thương biểu mô nhãn cầu hiệu quả Đối với các nhiễm khuẩn thứ phát trong trường hợp loét giác mạc, việc điều trị bằng kháng sinh phổ rộng tra mắt là cần thiết.

1.3.1.2 Các thu ố c dùng toàn thân

Corticosteroid và thuốc ức chế miễn dịch được sử dụng để chống viêm trong các bệnh lý toàn thân liên quan đến viêm và miễn dịch Phác đồ điều trị thường bắt đầu với liều tấn công, sau đó giảm dần liều và duy trì liệu trình dưới sự theo dõi chặt chẽ.

Cycline uống:Cycline liều thấpcó đặc tính kháng viêm, ức chế MMP, giảm sự hình thành tân mạch [50]

Chất dinh dưỡng bổ sung: Vitamin A, omega 3 liều thấp có tác dụng cải thiện tình trạng BMNC, tăng chế tiết nước mắt [51]

1.3.2 Kính tiếp xúc trong điều trị rối loạn bề mặt nhãn cầu

Kính tiếp xúc điều trị giúp bảo vệ giác mạc khỏi các tác nhân cơ học, giảm tình trạng khô mắt, giảm đau và kích thích từ bề mặt niêm mạc, đồng thời hỗ trợ quá trình liền biểu mô giác mạc hiệu quả.

Kính tiếp xúc được chỉ định trong một số bệnh lý liên quan đến bề mặt mắt như tróc biểu mô giác mạc tái diễn, tổn thương biểu mô dai dẳng, hội chứng Stevens-Johnson, bệnh pemphigoid, bệnh giác mạc do liệt thần kinh dinh dưỡng, và sau các phẫu thuật kiến tạo bề mặt mắt.

Kính được lựa chọn dựa trên chỉ số thấm khí cao, giúp tối ưu hóa khả năng vận chuyển oxy vào giác mạc Độ cong của kính tương xứng với giác mạc, đảm bảo không cản trở lưu thông của các chất dinh dưỡng và oxy Có nhiều loại kính với đường kính lớn từ 16-24mm, bao gồm kính củng mạc và PROSE, một thiết bị nhân tạo thay thế BMNC, được thiết kế đặc biệt với độ bám củng mạc tốt nhờ phần mềm tính toán chính xác cho độ cong nền.

Cần phát hiện và xử trí sớm các biến chứng do kính tiếp xúc gây ra: nhiễm khuẩn, tiêu nhuyễn giác mạc vô khuẩn, tân mạch giác mạc

1.3.3 Các phẫu thuật bảo vệ bề mặt nhãn cầu

Chích nhu mô nông hoặc nạo biểu mô giác mạc giúp tăng cường độ bám dính giữa nhu mô và biểu mô, hỗ trợ điều trị bệnh tróc biểu mô tái phát Đóng điểm lệ có tác dụng giữ nước mắt lưu lại trên bề mặt giác mạc, giảm tình trạng khô mắt, kích thích và viêm Đối với mức độ vừa, có thể thực hiện đóng tạm thời bằng nút collagen hoặc silicon, trong khi mức độ nặng cần phải can thiệp phẫu thuật để đóng vĩnh viễn.

G ọ t giác m ạ c l ớ p nông: trong một số tổn thương nông của giác mạc như thoái hóa Salzmann, tróc biểu mô tái phát, thoái hóa dải băng

Tạo hình mi hoặc khâu cò mi tạm thời giúp mắt nhắm kín hơn, giảm diện tiếp xúc của giác mạc và bề mặt niêm mạc mắt với môi trường, từ đó giảm sự bốc hơi của phim nước mắt, góp phần bảo tồn và hàn gắn tổn thương bề mặt niêm mạc mắt Ngoài ra, việc tiêm botox để gây sụp mi tạm thời cũng có thể thu hẹp diện tiếp xúc của nhãn cầu với môi trường.

Phủ kết mạc là phương pháp sử dụng kết mạc lân cận để che phủ vùng tổn thương khó hàn gắn của giác mạc Phương pháp này giúp giảm đau nhức do kích thích từ vết loét, giảm viêm và cung cấp xơ mạch từ kết mạc, hỗ trợ quá trình hàn gắn tổn thương giác mạc hiệu quả hơn.

Nhược điểm của phương pháp này bao gồm làm cạn cùng đồ, giảm thị lực, khó theo dõi nhãn áp và khó quan sát các lớp sâu Bên cạnh đó, việc kéo xơ mạch vào giác mạc có thể gây suy giảm tế bào gốc, làm khó khăn cho các bước kiến tạo BMNC trong tương lai.

1.3.4 Các phẫu thuật kiến tạo bề mặt nhãn cầu

Các y ế u t ố liên quan đế n m ức độ t ổn thương BMNC trướ c m ổ Các yếu tố thuộc nhãn cầu

Số lượng mắt bị tổn thương và mức độ thiệt hại của tế bào gốc ở vùng rìa là những yếu tố quan trọng cần xem xét Ngoài ra, mức độ tổn thương kết mạc, tình trạng phim nước mắt, và tổn thương nhu mô giác mạc cũng đóng vai trò quyết định Các rối loạn cơ học của mi mắt và các bệnh lý kèm theo như glaucoma hoặc bệnh dịch kính – võng mạc cũng cần được chú ý để có cái nhìn toàn diện về tình trạng sức khỏe mắt.

Các yếu tố ngoài nhãn cầu

Tuổi, tình trạng bệnh toàn thân (dung nạp thuốc ức chế miễn dịch), khả năng tuân thủ điều trị sau phẫu thuật

Bệnh nhân có suy giảm tế bào gốc một phần có thể không cần phẫu thuật Nếu giác mạc bị che phủ một phần bởi biểu mô kết mạc, việc cắt bỏ phần biểu mô này sẽ đủ để phục hồi tế bào biểu mô.

T ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng nuôi c ấ y và ứ ng d ụng trong điề u tr ị r ố i

1.4.1 Cấu trúc biểu mô niêm mạc miệng

Biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc có nguồn gốc phôi thai từ ngoại bì da, đều là biểu mô lát tầng không sừng hóa, dày và gồm nhiều hàng tế bào với hình thái lớp đáy tương tự Tế bào ở lớp đáy có hình trụ hoặc hình khối, chứa đầy đủ bào quan và có khả năng phân chia để duy trì quần thể tế bào ổn định Các tế bào phân chia tập trung thành cụm ở 2-3 lớp sát màng đáy, với nhân bắt màu đậm khi nhuộm p63, nhiều hơn ở vùng sâu nhất của lõm biểu mô, hay nhú chân bì Trong nuôi cấy in vitro, tế bào biểu mô hình thành nhiều cụm tế bào khác nhau Nghiệm pháp đánh dấu cho thấy sự hiện diện của tế bào gốc tại đỉnh nhú chân bì ở niêm mạc miệng thỏ Tuy nhiên, nghiên cứu về tế bào gốc hoặc tế bào tăng sinh chuyển tiếp ở niêm mạc miệng còn hạn chế Tế bào gốc biểu mô được cho là nằm ở lớp đáy, nhưng do vấn đề đạo đức, không thể thực hiện nghiệm pháp trên người in vivo, chỉ có thể chứng minh trong phòng thí nghiệm.

Hình 1.5 Niêm m ạ c vùng gi ữ a má

A Nhuộm HE; B Nhuộm hóa mô miễn dịch p63

1 Biểu mô 2 Mô đệm 3 Nhân tế bào biểu mô

1.4.2 Các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy

Nuôi cấy tế bào là quá trình phức tạp giúp phát triển tế bào trong môi trường nuôi cấy ngoài cơ thể, nhằm hồi phục, thay thế hoặc tái tạo tổn thương Bộ ba trong công nghệ mô bao gồm các tế bào, giá đỡ và yếu tố phát triển, đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe và điều trị bệnh.

1.4.2.1 Giá đỡ dùng trong nuôi c ấ y

Giá đỡ cung cấp khung chống đỡ cho sự kết dính tế bào và phát triển mô

Màng ối được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy tấm biểu mô nhờ vào cấu trúc tương tự như màng đáy của biểu mô kết giác mạc, chứa collagen typ IV, V, fibronectin, và laminin Những thành phần này hỗ trợ sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào biểu mô, giúp chúng bám dính, phát triển và di cư trên bề mặt màng ối Bên cạnh đó, màng ối có tác dụng chống viêm và kháng khuẩn nhờ cytokin IL-1α và IL-1β Không có hiện tượng thải loại miễn dịch sau khi ghép do màng ối không biểu lộ kháng nguyên HLA-A, B hoặc DR của β2 microglobulin Màng ối cũng chứa các yếu tố tăng trưởng như EGF, KGF và NGF, thúc đẩy sự phát triển và phân chia của tế bào biểu mô Ngoài ra, màng ối dễ thu nhận, xử lý và bảo quản ở -80ºC trong nhiều tháng, với tính chất dai, đàn hồi giúp thuận lợi cho các thao tác phẫu thuật và dễ dàng thu hoạch tấm biểu mô để cấy ghép.

Giá fibrin được hình thành từ sự kết hợp giữa fibrinogen và thrombin trong dung dịch muối 1,1%, được sử dụng làm giá đỡ cho tế bào trong nuôi cấy Ưu điểm của giá fibrin là tính trong suốt và khả năng tạo ra sự dính kết mạnh mẽ với mô đệm nhờ các phân tử integrin β1 Mặc dù giá đỡ fibrin dễ thu hoạch tấm biểu mô nuôi cấy, nhưng chi phí cao hơn so với màng ối và không tận dụng được các lợi ích như đặc tính chống viêm và khả năng tăng trưởng, phát triển.

Nền polymer nhạy cảm nhiệt là phương pháp nuôi cấy tế bào biểu mô mà không cần giá đỡ, cho phép các tế bào dễ dàng bám dính và tăng sinh ở nhiệt độ 37°C Tuy nhiên, khi nhiệt độ giảm xuống 32ºC, tấm biểu mô bắt đầu tách rời khỏi bề mặt màng polymer, giúp loại bỏ sự cần thiết của enzyme để giải phóng tấm biểu mô khỏi màng nuôi cấy.

1.4.2.2 Các lo ạ i t ế bào s ử d ụ ng trong nuôi c ấ y

Tế bào biểu mô được lấy từ niêm mạc má ở vị trí giữa, nơi có cấu trúc biểu mô dày và nhú chân bì rõ, cho thấy khả năng mọc cao hơn nhờ chứa nhiều tế bào gốc Kích thước mảnh mô khác nhau tùy thuộc vào tác giả và phương pháp nuôi cấy Nguyên bào sợi (3T3) hỗ trợ sự tăng sinh và biệt hóa tế bào biểu mô, lý tưởng nhất là sử dụng nguyên bào sợi tự thân từ vùng mô liên kết tương ứng Tuy nhiên, việc này khó thực hiện, do đó nguyên bào sợi chuột bất hoạt là một giải pháp khả thi Nguyên bào sợi chuột bất hoạt bằng Mitomycin C có khả năng sản xuất yếu tố tăng trưởng, loại bỏ độc tố trong môi trường nuôi cấy và hạn chế sự biệt hóa của tế bào biểu mô, giúp tế bào biểu mô phát triển phủ kín đáy giếng nuôi cấy, mặc dù vẫn còn lo ngại về nguồn gốc động vật của sản phẩm này.

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh hiệu quả nuôi cấy tế bào mà không cần sử dụng 3T3 Oie và cộng sự (2010) đã sử dụng nguyên bào sợi da hậu gián phân để nuôi cấy và thu được tấm biểu mô đẹp, với sự hiện diện của nhiều loại mucin.

Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô bắt đầu bằng việc sinh thiết và phẫu tích mảnh mô, loại bỏ mô liên kết dưới lớp biểu mô Sau đó, mảnh mô được xử lý enzym trong 10 phút và rửa sạch bằng dung dịch PBS có kháng sinh, kháng nấm Tiếp theo, mảnh mô được xử lý qua EDTA và đặt lên giá đỡ đã chuẩn bị Khi mảnh mô bám dính vào giá đỡ, môi trường nuôi cấy được bổ sung liên tục để kích thích tế bào tăng sinh và lan rộng, che phủ toàn bộ mặt giếng nuôi cấy cho đến khi thu hoạch Mặc dù phương pháp này đơn giản, nhưng nhược điểm là tấm biểu mô không phẳng và thường có sự hiện diện của nguyên bào sợi.

Phương pháp nuôi cấy bằng dịch treo sử dụng enzyme dispase để tách tế bào biểu mô khỏi mô đệm, sau đó dùng enzyme trypsin để phân giải các tế bào thành dạng dịch treo Dịch treo này được xác định mật độ và cấy lên bề mặt giá đỡ đã chuẩn bị, tiếp theo là bổ sung môi trường nuôi cấy cho đến khi thu hoạch Mặc dù phương pháp này tạo ra tấm biểu mô phẳng, nhưng quy trình thực hiện phức tạp và yêu cầu kích thước mảnh mô lớn, đồng thời cần sử dụng nguyên bào sợi dị loài.

Phương pháp nuôi mảnh biểu mô bao gồm các bước kỹ thuật nuôi cấy bằng dịch treo, bóc tách lớp biểu mô khỏi mô nền, và cắt mảnh mô thành kích thước 0,5 × 0,5 mm Sau đó, mảnh biểu mô được ủ với trypsin EDTA trong 1-2 phút và rửa sạch ba lần bằng môi trường nuôi cấy Quy trình này tiếp tục bằng cách nuôi trên màng ối trong môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 37ºC và 5% CO2, với lớp tế bào nuôi được tạo ra từ các nguyên bào sợi tự thân Phương pháp này đơn giản, giúp tạo ra tấm biểu mô phẳng và tránh việc sử dụng nguyên bào sợi dị loài.

Quá trình nuôi cấy tế bào kéo dài từ 14 đến 21 ngày Khi biểu mô đạt một hàng tế bào, cần thực hiện thao tác airlifting để nâng cao lớp tế bào lên khỏi bề mặt môi trường Việc này giúp oxy khuếch tán không bị hạn chế, tạo điều kiện thuận lợi cho việc kích thích biểu mô tạo tầng và biệt hóa.

1.4.2.4 Môi trườ ng nuôi c ấ y Đảm bảo nồng độ vitamin và amino acid cao, đáp ứng các đặc tính lý hóa như pH, áp suất thẩm thấu, nhiệt độ Môi trường nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng thông thường là sự kết hợp của Ham’s F12 và DMEM với tỷ lệ 1:1, nhiệt độ phù hợp nhất là 37ºC, áp suất thẩm thấu hợp lý là 290 mosmol/kg Ngoài ra cần các yếu tố bổ sung: Insulin kích thích thu nạp gluco và acid amin, kích thích phân chia tế bào, hormon tăng trưởng trong huyết thanh, đặc biệt huyết thanh bào thai với nồng độ 50ng/ml, hydrocortison có tác động lên sự liên kết và nhân lên của các tế bào, khi mật độ tế bào cao nó có thể gây biệt hóa tế bào, chất này cũng có trong huyết thanh, đặc biệt trong huyết thanh bào thai bò Để tránh sử dụng huyết thanh do vấn đềnguy cơ lây nhiễm và tránh yếu tố dị loài, cần có fibronectin hoặc polylysin thay thế để đảm bảo độ dính kết của tấm biểu mô nuôi cấy Ilmarinen và cộng sự (2013) đã sử dụng môi trường không huyết thanh để nuôi cấy thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng [97]

1.4.2.5 Các phương pháp đị nh danh t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng nuôi c ấ y Phương pháp hình thái học

-Quan sát hình thái tấm biểu mô sống: quan sát tấm biểu mô qua quá trình nuôi cấy bằng kính hiển vi soi nổi và soi ngược [98]

-Nhuộm Trypan blue: xác định tỷ lệ sống và chết của tế bào ở mảnh mô nuôi cấy

-Nhuộm Giemsa: quan sát hình thái bề mặt của tấm biểu mô nuôi cấy: hình dạng, kích thước tế bào và khoảng gian bào

Nhuộm Hematoxylin-Eosin là phương pháp quan trọng để đánh giá cấu trúc vi thể của tấm biểu mô theo chiều dọc, bao gồm độ phẳng của tấm biểu mô, số lượng lớp tế bào, hình dạng và kích thước các tế bào, cũng như khoảng gian bào.

Phương pháp hiển vi điện tử, bao gồm hiển vi điện tử quét (SEM) và hiển vi điện tử xuyên (TEM), được sử dụng để kiểm tra tấm biểu mô Qua đó, có thể quan sát cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô, sự liên kết giữa các tế bào biểu mô và giữa tế bào biểu mô với giá đỡ Đặc biệt, SEM cho phép xác định sự hiện diện của tế bào gốc, góp phần quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực sinh học và y học.

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch sử dụng các marker như K3, K12, connexin-43, p63, p75, và MCSP để nhận diện và đánh giá đặc tính cũng như độ biệt hóa của tế bào Trong đó, K3 là dấu ấn cho tế bào giác mạc đã biệt hóa, trong khi K12 là dấu ấn tốt cho tế bào biểu mô giác mạc do không hiện diện ở kết mạc Connexin-43 thể hiện tế bào biểu mô giác mạc đã biệt hóa cao, p63 là marker cho tế bào gốc, đặc biệt là đồng phân ΔN của p63, và p75 là marker cho tế bào gốc niêm mạc miệng Các protein như Occludin và Desmoplakin tham gia vào liên kết tế bào, trong khi K4 và K4/K13 đặc trưng cho keratin của tế bào biểu mô niêm mạc và tế bào biểu mô không sừng hóa Kỹ thuật này thường được áp dụng trong nhiều nghiên cứu để đánh giá đặc điểm của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1.1 Thi ế t k ế nghiên c ứ u: Nghiên cứu thực nghiệm, tiến hành tại Bộ môn

Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội từ tháng 1 đến tháng 9/2012, với mẫu nghiên cứu gồm 15 thỏ được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô có 3 thỏ Mỗi lô tương ứng với các thời điểm đánh giá đặc điểm lâm sàng và cấu trúc vi thể của GM thỏ sau ghép, cụ thể là sau 7 ngày, 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và 180 ngày.

2.2.1.2 Phương tiệ n nghiên c ứ u: Máy hiển vi phẫu thuật và bộ dụng cụ vi phẫu, các thiết bị và hóa chất cần thiết cho nuôi cấy tế bào

2.2.1.3 Các bướ c ti ế n hành nghiên c ứ u Gây bỏng thực nghiệm cho thỏ: Gây mê tĩnh mạch tai thỏ bằng Thiopental 10mg/kg, gây bỏng bằng phương pháp “in dấu” dung dịch NaOH 3% trên bề mặt giác mạc và vùng rìa trong 7 giây Rửa mắt bằng nước muối sinh lý sau khi gây bỏng 1 phút

Sinh thiết lấy mẫu biểu mô niêm mạc miệng:

-Thực hiện sau khi gây bỏng 2 tuần

Trong quá trình sinh thiết, thỏ được cố định trên giá và gây mê bằng Thiopental qua tĩnh mạch rìa tai Vùng miệng của thỏ được khử trùng bằng dung dịch Polydone-iodine 10% Một mảnh niêm mạc có đường kính 3 mm được sinh thiết từ mặt trong vùng giữa má thỏ Sau khi sinh thiết, vùng niêm mạc miệng thỏ được khâu lại bằng 1 mũi chỉ 6/0 Vicryl và tiếp tục được sát trùng bằng dung dịch Polydone-iodine 10%.

-Rửa mảnh mô bằng PBS pha kháng sinh,kháng nấm, ngâm trong môi trường SHEM rồi được chuyển ngay tới phòng nuôi cấy tế bào xử lý tiếp

Nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng sử dụng phương pháp mảnh biểu mô với giá đỡ là màng ối đã nạo bỏ biểu mô Quá trình này áp dụng lớp tế bào nuôi là nguyên bào sợi tự thân, theo quy trình nuôi cấy của labo nuôi cấy Mô thuộc Bộ môn Mô phôi, Đại học Y Hà Nội.

Sau khi nuôi cấy thành công 2 tấm biểu mô, một tấm được sử dụng để định danh và tấm còn lại được ghép tự thân cho thỏ Việc đánh giá chất lượng tấm biểu mô sau quá trình nuôi cấy là rất quan trọng để đảm bảo tính hiệu quả và an toàn trong ứng dụng.

- Tốt: Tấm biểu mô trong, dai, độ dày đồng nhất ở các vị trí, trượt dễ dàng khỏi đáy giếng nuôi cấy khi phẫu thuật

- Trung bình: Tấm biểu mô dày mỏng không đều, dính và khó tách khỏi đáy giếng nuôi cấy khi phẫu thuật nhưng còn nguyên vẹn sau khi tách

- Xấu: Tấm biểu mô khuyết ở một số vị trí hoặc dính và rách khi tách khỏi đáy giếng nuôi cấy khi phẫu thuật

+ Các tiêu chí đánh giá về cấu trúc vi thể và siêu vi:

-Vi thể: tấm biểu mô gồm 4-5 hàng tế bào, bám chặt vào màng ối, không có tế bào chế nhầy

-Siêu vi: có vi nhung mao bề mặt, thể liên kết giữa các tế bào và thể bán liên kết giữa lớp đáy và màng ối

-Hóa mô miễn dịch (+) với K3

Ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cho thỏ thực nghiệm:

-Sau bỏng 30 ngày, đánh giá tổn thương bề mặt nhãn cầu của thỏ và tiến hành phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy

- Gây mê qua đường tĩnh mạch tai thỏ bằng Thiopental Sát trùng mắt bằng betadine 5%

Mở kết mạc rìa 360º cho phép phẫu tích tổ chức màng xơ mạch trên giác mạc và củng mạc Việc chuẩn bị diện ghép bao gồm bề mặt giác mạc, vùng rìa và củng mạc xung quanh rìa, với khoảng cách từ rìa giác-củng mạc khoảng 5 mm.

-Trải tấm biểu mô nuôi cấy trên bề mặt nhãn cầu Dùng chỉ 10/0 khâu cố định tấm biểu mô trên bề mặt nhãn cầu bằng các mũi chỉ rời

-Kiểm tra độ nguyên vẹn của tấm biểu mô bằng test nhuộm Fluorescein

Sau phẫu thuật, bệnh nhân được nhỏ thuốc tại mắt hàng ngày với dung dịch kháng sinh ofloxacine 0.5% và thuốc chống viêm prednisolon acetat 1% mỗi ngày 4 lần Các thời điểm theo dõi sau ghép được thực hiện vào ngày thứ 7, 15, 30, 60 và 180 Tình trạng mắt thỏ sau ghép được đánh giá thông qua sinh hiển vi cầm tay và đèn pin khám mắt, chú trọng vào các biểu hiện như mắt đỏ, sưng nề, tiết tố dính ở bờ mi, và tổn thương biểu mô bằng test nhuộm màu Fluorescein Kết quả phẫu thuật sẽ được tổng hợp và đánh giá dựa trên những tiêu chí này.

- Kết quả tốt: Tấm biểu mô áp tốt, trong, không phù, bề mặt nhẵn bóng, không bắt màu Fluorescein, không có tân mạch.

Kết quả khá cho thấy tấm biểu mô có áp lực tốt, không bị phù nề, và bề mặt không bắt màu Fluorescein hoặc chỉ bắt màu nhẹ với dạng chấm Tân mạch có thể xuất hiện nhưng chỉ giới hạn ở vùng rìa.

Kết quả trung bình cho thấy tấm biểu mô mờ, không nhẵn bóng, với tổn thương biểu mô thành đám Ngoài ra, có hiện tượng tăng sinh xơ mạch qua rìa vào chu biên, nhưng chưa xâm lấn vào trung tâm giác mạc.

- Kết quả xấu: Tấm biểu mô phù đục, không nhẵn bóng, loét biểu mô khó hàn gắn, tăng sinh xơ mạch vào trung tâm giác mạc.

Tiến hành giết thỏ theo từng lô nhằm kiểm tra cấu trúc vi thể và siêu vi của giác mạc thỏ đã được ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy.

2.2.2 Nghiên cứu trên bệnh nhân

2.2.2.1 Thi ế t k ế nghiên c ứ u: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, tiến cứu, thực hiện trên 12 bệnh nhân rối loạn bề mặt nhãn cầu 2 mắt được điều trị tại khoa Kết giác mạc, Bệnh viện Mắt Trung Ương trong thời gian từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 6 năm 2014

2.2.2.2 Phương tiệ n nghiên c ứ u: Máy sinh hiển vi khám bệnh có gắn máy chụp ảnh, hiển vi phẫu thuật và bộ dụng cụ vi phẫu, các thiết bị và hóa chất

2.2.2.3 Các bướ c ti ế n hành nghiên c ứ u Đánh giá bệnh nhân trước phẫu thuật:

Khi đánh giá triệu chứng cơ năng liên quan đến mắt, cần khai thác tiền sử và bệnh sử của bệnh nhân Những triệu chứng quan trọng bao gồm mức độ nhìn mờ, cảm giác cộm chói mắt, đau nhức, đỏ và chảy nước mắt Để định lượng mức độ kích thích, có thể sử dụng bảng đánh giá dựa trên ba triệu chứng chính: sợ ánh sáng, cảm giác khô mắt và cảm giác đau (bảng 2.1).

B ả ng 2.1 M ức độ kích thích v ề tri ệ u ch ứ ng cơ năng

Mức độ Chói, sợ ánh sáng Cảm giác khô mắt Cảm giác đau

_ Không phàn nàn Không phàn nàn Không phàn nàn

+ Phải đeo kính râm Có cảm giác khô Thỉnh thoảng

++ Phải nheo mắt liên tục

Cảm giác rất khô Thường xuyên

Trước phẫu thuật, việc đánh giá tình trạng bề mặt nhãn cầu là rất quan trọng, bao gồm đo thị lực bằng bảng Snellen và quy đổi ra LogMAR, đo nhãn áp nếu có thể, cùng với việc thực hiện test Schirmer để đánh giá màng phim nước mắt Ngoài ra, cần áp dụng các phương pháp kiểm tra tế bào bề mặt giác mạc, đánh giá mức độ viêm của bề mặt nhãn cầu thông qua các triệu chứng như chảy nước mắt, co quắp mi và cương tụ kết mạc Cuối cùng, việc kiểm tra tổn thương biểu mô trên lâm sàng bằng test nhuộm Fluorescein cũng là một bước quan trọng trong quá trình đánh giá.

Khám và loại trừ bệnh nhân có sừng hóa bề mặt nhãn cầu là bước quan trọng trong quá trình điều trị Trước khi phẫu thuật, cần điều trị viêm bề mặt nhãn cầu bằng thuốc corticosteroid, cụ thể là prednisolon acetat 1% Liều lượng và thời gian sử dụng thuốc sẽ phụ thuộc vào mức độ viêm của từng bệnh nhân.

Mô hình nghiên c ứ u

4 tu ầ n Gây b ỏ ng cho th ỏ

Nuôi t ạ o t ấ m BM Ghép t ự thân cho th ỏ

Thu th ậ p và phân tích s ố li ệ u

Thu thập số liệu bằng mẫu bệnh án nghiên cứu, có ảnh chụp tổn thương giác mạc và bề mặt nhãn cầu

Lưu giữ hình ảnh lâm sàng và hình ảnh mô học, lưu giữ video phẫu thuật.

Đạo đứ c nghiên c ứ u

Đề tài nghiên cứu quy trình sử dụng tế bào gốc trong điều trị các bệnh về bề mặt nhãn cầu thuộc dự án độc lập cấp nhà nước, được thực hiện bởi Bộ môn Mô - phôi, Trường Đại học Y Hà Nội Dự án mang mã số ĐTĐL.2010T/15 và đã nhận được sự chấp thuận từ Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của trường, với chứng nhận số 77/HĐĐĐ – YHN ngày 16/07/2010.

Ghép t ự thân t ấ m BM cho BN Đánh giá mắ t BN sau ghép

K Ế T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

K ế t qu ả nghiên c ứ u trên th ự c nghi ệ m

Trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm, tất cả 15 thỏ tham gia đều sống sót từ khi gây bỏng, thực hiện sinh thiết niêm mạc miệng, ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy, cho đến khi hoàn thành theo dõi sau mổ.

3.1.2 Đặc điểm tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy

Sau khi nuôi cấy bằng phương pháp mảnh biểu mô với sự hỗ trợ của lớp tế bào nuôi là nguyên bào sợi tự thân, chúng tôi đã tạo ra 2 tấm biểu mô niêm mạc miệng từ mỗi thỏ thực nghiệm Sau 2 tuần, các tấm biểu mô đều phẳng và phủ kín đáy lồng nuôi cấy trên nền chất mang là màng ối Tấm biểu mô có màu trắng mờ, tính chất đàn hồi, và dễ dàng tách nguyên vẹn khỏi đáy giếng nuôi cấy trong quá trình phẫu thuật.

Quan sát bề mặt tấm biểu mô bằng phương pháp nhuộm Giemsa cho thấy các tế bào có hình đa diện, phủ kín đáy giếng nuôi cấy với khoảng gian bào hẹp và đều nhau Khi thực hiện cắt ngang tấm biểu mô và nhuộm HE, tấm biểu mô hiện lên phẳng với 5-7 hàng tế bào, các lớp tế bào trên có xu hướng dẹt dần, khoảng gian bào vẫn hẹp và không có sự xuất hiện của các tế bào thoi xen lẫn.

Hình 3.1 A Hình ả nh nhu ộ m Giemsa c ủ a t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y

B Hình ả nh nhu ộ m H.E lát c ắt đứ ng d ọ c c ủ a t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y

1 Màng ối; 2 Tấm biểu mô

Dưới kính hiển vi điện tử quét, bề mặt của tấm biểu mô xuất hiện nhiều vi nhung mao ngắn và chia nhánh Khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử xuyên, các tế bào trong tấm biểu mô được liên kết với nhau thông qua các cầu bào tương dài, tạo ra khoảng gian bào rộng.

Hình 3.2 B ề m ặ t t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y dướ i hi ển vi điệ n t ử quét

Hình 3.3 Liên k ế t gi ữ a các t ế bàoc ủ a t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y dướ i hi ển vi điệ n t ử xuyên

1 Tế bào biểu mô; 2 Khoảng gian bào

Các tế bào lớp đáy có nhân lớn và màng nhân với các lõm nông, cùng với hạt nhân lớn Bào tương của chúng chứa lưới nội bào có hạt và ti thể phong phú, cũng như nhiều đám hạt glycogen Những tế bào này gắn chặt với màng ối thông qua các thể bán liên kết.

Hình 3.4 T ế bào l ớp đáy củ a t ấ m bi ểu mô dướ i hi ển vi điệ n t ử xuyên

1 Nhân tế bào; 2 Màng ối; 3 Ti thể

Hình 3.5 Liên k ế t gi ữ a t ấ m bi ể u mô và màng ố i dướ i hi ển vi điệ n t ử xuyên

3 Định danh tấm biểu mô nuôi cấy bằng phương pháp hóa mô miễn dịch:

Trên các tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch, p63 cho thấy các tế bào biểu mô có nhân bắt màu nâu sẫm, đặc biệt là ở lớp đáy Nhuộm K3 và K12 cho thấy sự biểu hiện yếu ở các tế bào lớp trên đáy Nhuộm PAS phát hiện glycogen và chất nhầy cho thấy bào tương của các tế bào lớp dưới có ít glycogen và không có tế bào tiết nhầy trong tấm biểu mô nuôi cấy.

Hình 3.6 A Hình ả nh nhu ộ m hóa mô mi ễ n d ị ch p63 c ủ a t ấ m bi ể u mô

B Hình ả nh nhu ộ m hóa mô mi ễ n d ị ch K3c ủ a t ấ m bi ể u mô

1 Tấm biểu mô; 2 Màng ối

Hình 3.7 Hình ả nh nhu ộ m P.A.S t ấ mBM nuôi c ấ y

1 Biểu mô; 2 Màng ối; 3 Glycogen

3.1.3 Kết quả ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cho thỏ thực nghiệm Ở mức độ đại thể, tất cả các tấm biểu mô đều trong và áp tốt trên bề mặt nhãn cầu của thỏ qua các thời điểm theo dõi Trong 7 ngày đầu khi làm test nhuộm fluorescein, có 2 thỏ giác mạc còn bắt màu thuốc nhuộm ở trung tâm khoảng 4 mm và xuất hiện tân mạch ở chu biên Tuy nhiên sau 15 ngày, diện bắt màu đã thu gọn còn 2 mm, tân mạch chu biên rút bớt chỉ còn ở vùng rìa

Sau 30 ngày ghép, tất cả các thỏ đều có biểu mô hóa hoàn toàn, không còn bắt màu fluorescein, chỉ có một thỏ xuất hiện tân mạch quanh rìa Sau 60 ngày, một thỏ vẫn có tân mạch ở chu biên nhưng không vào trung tâm giác mạc, trong khi các thỏ còn lại đều có kết quả tốt với tấm biểu mô trong, áp tốt, nhẵn bóng và không có tân mạch giác mạc Ở mức độ vi thể, sau 7 ngày ghép, tấm biểu mô áp sát nhu mô nhưng chưa dán chặt, lớp nhu mô trương phù và các lá collagen tách xa nhau Từ 15 ngày sau ghép, tấm biểu mô dán chặt hơn vào lớp nhu mô, hiện tượng trương phù giảm rõ rệt và hết hẳn sau 30 ngày Ở các thời điểm sau đó, tấm biểu mô áp chặt vào nhu mô, giác mạc không còn phù, tế bào sắp xếp đều đặn, lớp tế bào trên cùng vẫn còn nhân mà không có hiện tượng sừng hóa Hình ảnh tân mạch ở lớp dưới biểu mô giác mạc cũng được ghi nhận ở mắt thỏ có kết quả trung bình.

Hình 3.8 A Hình ả nh nhu ộ m H.E giác m ạ c th ỏ sau ghép 7 ngày B.Hình ả nh nhu ộ m H.E giác m ạ c th ỏ sau ghép 15 ngày

1 Tấm biểu mô; 2 Nhu mô giác mạc

Hình 3.9 A M ắ t th ỏ sau ghép 30 ngày, k ế t qu ả t ố t

B Hình ả nh nhu ộ m H.E giác m ạ c th ỏ sau ghép

B Hình ả nh nhu ộ m H.E giác m ạ c th ỏ

Hình 3.12 A M ắ t th ỏ sau ghép 60 ngày, k ế t qu ả khá

B Hình ả nh nhu ộ m H.E giác m ạ c th ỏ

K ế t qu ả nghiên c ứ u trên b ệ nh nhân

Tuổi trung bình của bệnh nhân phẫu thuật là 26,2 tuổi, với độ tuổi nhỏ nhất là 12 và lớn nhất là 57 Sau khi nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng, chúng tôi đã thực hiện ghép tự thân cho 17 mắt của 12 bệnh nhân được chẩn đoán rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu ở cả hai mắt, tổng số ca phẫu thuật là 20.

-3 bệnh nhân loạn dưỡng giác mạc bẩm sinh di truyền dạng giọt gelatin được phẫu thuật ghép cả 2 mắt (được tính là 6 trường hợp)

-9 bệnh nhân di chứng sau bỏng 2 mắt do hóa chất, trong đó:

5 bệnh nhân được phẫu thuật ghép 1 lần ở 1 bên mắt (được tính là 5 trường hợp)

1 bệnh nhân được phẫu thuật ghép 2 bên mắt, nhưng có 1 bên mắt được ghép 2 lần (được tính là 3 trường hợp)

Mỗi lần sinh thiết niêm mạc miệng và ghép tự thân cho bệnh nhân được coi là một trường hợp độc lập Do đó, việc thực hiện phương pháp này trên hai mắt của một bệnh nhân hoặc nhiều lần trên cùng một mắt đều được tính là các trường hợp riêng biệt.

Thời gian theo dõi trung bình là 18,95 tháng, ngắn nhất là 12 tháng, dài

Trước phẫu thuật, tất cả bệnh nhân đều có thị lực rất thấp, với chỉ một trường hợp có thị lực dưới đếm ngón tay ở khoảng cách 3 mét (tương đương LogMAR trên +1,30), trong khi các trường hợp còn lại đều dưới đếm ngón tay ở khoảng cách 1 mét (tương đương LogMAR trên +1,70) Ngoài ra, tất cả các bệnh nhân đều không còn khả năng nhìn gần.

Tất cả bệnh nhân trước khi thực hiện phẫu thuật ghép tấm biểu mô đều có tổn thương tân mạch và xơ xâm nhập toàn bộ giác mạc, bao gồm cả chu vi và khu vực trung tâm của giác mạc.

Không có trường hợp nào bịtăng nhãn áptrước khi phẫu thuật

Trong 6 trường hợp loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin, chỉ có 1 mắt chưa từng được phẫu thuật, còn lại 5 trường hợp đều đã được mổ gọt giác mạc, ghép màng ối trước đó.

Tất cả 14 trường hợp di chứng bỏng hóa chất đều đã trải qua nhiều đợt điều trị và phẫu thuật khác nhau, bao gồm ghép màng ối, tách dính, và tạo hình mi Trong số đó, có một ca đã thực hiện ghép giác mạc xoay, trong khi hai ca khác đã phẫu thuật lấy thể thủy tinh và đặt thủy tinh thể nhân tạo.

Các tổn thương phối hợp sâu hơn so với tổn thương rối loạn nặng của bề mặt nhãn cầu thường gặp trong trường hợp di chứng bỏng Có ba trường hợp cụ thể: một ca giác mạc bị thủng kèm theo đục thể thủy tinh trương phồng do bỏng, một ca giác mạc mỏng dọa thủng do loét khó hàn gắn và đã từng phẫu thuật thay thể thủy tinh, và một ca khác do chất gây bỏng ngấm vào tiền phòng dẫn đến đục thể thủy tinh, đã được phẫu thuật thay bằng thể thủy tinh nhân tạo.

3.2.2 Kết quảđịnh danh tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy tế bào biểu mô kéo dài từ 16-28 ngày, cho thấy sự phát triển đồng nhất của các tế bào đa diện khi quan sát dưới kính hiển vi (hình 3.13) Trên tiêu bản nhuộm H.E., tấm biểu mô nuôi cấy có khoảng 4-5 hàng tế bào, với hàng trên cùng dẹt, tạo thành một bề mặt khá phẳng và gắn chặt vào nền màng ối (hình 3.14).

Hình 3.13 Hình ả nh hi ển vi soi ngượ c t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng

Hình 3.14 Hình ả nh nhu ộ m H.E t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng

Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, bề mặt của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cho thấy sự hiện diện của nhiều vi nhung mao tương tự như biểu mô giác mạc Tuy nhiên, số lượng vi nhung mao ở niêm mạc miệng có vẻ ít hơn, trong khi kích thước của chúng lại lớn hơn.

Hình3.15 Hình ả nh hi ển vi điệ n t ử quét t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng

Khi sử dụng hiển vi điện tử xuyên, bề mặt của các tế bào lớp trên cùng cho thấy rõ sự hiện diện của các vi nhung mao ngắn, bào tương chứa nhiều ty thể dài, mào rõ nét, chất nền có màu sẫm, và lưới nội bào hạt phát triển.

Hình 3.16 Hình ả nh hi ển vi điệ n t ử xuyên c ấ u trúc t ế bào b ề m ặ t c ủ a t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y

1 Vi nhung mao; 2 Lưới nội bào; 3 Ty thể

Trong lớp biểu mô, các tế bào ở bề mặt có thể thấy rõ các thể liên kết và cầu bào tương dài hơn so với tấm biểu mô ở thỏ thực nghiệm Bên trong bào tương của lớp đáy, các bào quan phát triển mạnh mẽ, bao gồm lưới nội bào có hạt, ty thể, và bộ Golgi, tất cả đều nằm gần nhân cùng với túi dẹt và không bào.

Hình 3.17 Hình ả nh hi ển vi điệ n t ử xuyên kho ả ng gian bào ở l ớ p trên c ủ a t ấ m bi ể u mô

1 Cầu bào tương; 2 Thể liên kết

Hình 3.18 Hình ả nh hi ển vi điệ n t ử xuyên t ế bào l ớp đáy c ủ a t ấ m bi ể u mô

1 Nhân tế bào; 2 Bộ Golgi; 3 Không bào; 4 Lưới nội bào

Khi thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch để phát hiện p63, chúng tôi nhận thấy rằng nhân của các tế bào biểu mô có màu nâu sẫm, đặc biệt là ở các tế bào lớp đáy Trong khi đó, trên các tiêu bản nhuộm K3, K3 thể hiện yếu ở các tế bào lớp trên đáy.

Hình 3.19 Hình ả nh nhu ộ m hóa mô mi ễ n d ị ch p63 t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng

Hình 3.20 Hình ả nh nhu ộ m hóa mô mi ễ n d ị ch K3 t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng

3.2.3 Kết quả ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên bệnh nhân

Chúng tôi đã thực hiện sinh thiết niêm mạc miệng trên 20 trường hợp, trong đó mỗi lần sinh thiết đều tạo ra 2 tấm biểu mô phẳng và phủ kín đáy giếng nuôi cấy Tuy nhiên, trong quá trình phẫu thuật, có 4 trường hợp tấm biểu mô dính chặt, gây khó khăn trong việc tách ra khỏi đáy giếng nuôi cấy và dẫn đến rách trong quá trình phẫu tích.

Phẫu thuật thành công ở 14/20 trường hợp, đạt tỷ lệ 70%, trong đó 6 trường hợp (30%) có kết quả tốt với giác mạc trong, biểu mô nhẵn và không còn tân mạch giác mạc 4 trường hợp (20%) có kết quả khá với tân mạch chỉ ở vùng rìa giác mạc, và 4 trường hợp (20%) có kết quả trung bình khi tân mạch dừng ở chu biên mà chưa vào trung tâm giác mạc Tấm biểu mô đã giúp ổn định và cải thiện tình trạng bề mặt nhãn cầu, giảm tân mạch giác mạc tới 70% số ca Tất cả các trường hợp này đều được theo dõi trong thời gian từ 12 đến 62 tháng, với kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.1.

B ả ng 3.1 K ế t qu ả ph ẫ u thu ậ t và tình tr ạ ng tân m ạ ch giác m ạ c ở th ời điể m theo dõi cu ố i cùng

BN s ố Nguyên nhân Tân m ạ ch giác m ạ c K ế t qu ả ph ẫ u thu ậ t

2 B ỏ ng Chu biên Trung bình

4 Lo ạn dưỡ ng Không có T ố t

16 Lo ạ n dưỡ ng Không có T ố t

Theo nguyên nhân gây bệnh, nhóm bệnh lý loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin sau mổ có tỷ lệ thành công 100%, trong khi nhóm di chứng bỏng chỉ đạt 28,57% kết quả khá, 28,57% kết quả trung bình và 42,86% kết quả xấu Tất cả các trường hợp thành công đều thuộc nhóm loạn dưỡng giác mạc gelatin, trong khi các ca thất bại đều nằm ở nhóm di chứng bỏng Điều này cho thấy nhóm loạn dưỡng giác mạc gelatin có tỷ lệ thành công cao hơn so với nhóm di chứng bỏng.

Hình 3.21 Hình ả nh k ế t qu ả t ố t sau ph ẫ u thu ật 3 năm

Hình 3.22 Hình ả nh k ế t qu ả trung bình sau m ổ 1năm

3.2.3.2 K ế t qu ả v ề tri ệ u ch ứ ng cơ năng

BÀN LU Ậ N

Ghép t ấ m bi ể u mô trên th ỏ th ự c nghi ệ m

Nghiên cứu thực nghiệm đóng vai trò quan trọng trong khoa học, giúp các nhà khoa học giải quyết những vấn đề không thể thực hiện trên con người Mặc dù việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên toàn thế giới, điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam có thể khác biệt, do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với nghiên cứu ứng dụng trên bệnh nhân Nghiên cứu thực nghiệm cho phép xác định vị trí và kích thước thích hợp cho sinh thiết mô để nuôi cấy, đồng thời giúp rút ra quy trình hoàn chỉnh cho việc nuôi tấm biểu mô niêm mạc miệng Qua quá trình này, kỹ năng phẫu thuật được hoàn thiện, giảm thiểu các yếu tố ảnh hưởng đến thành công của phẫu thuật Cuối cùng, nghiên cứu thực nghiệm cho phép quan sát vi cấu trúc giác mạc sau khi ghép tấm biểu mô, từ đó theo dõi sự tồn tại và tình trạng của tấm biểu mô theo thời gian.

4.1.1 Đặc tính của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy trên thỏ

Trên các tiêu bản nhuộm Giemsa và H.E của tấm biểu mô niêm mạc miệng, các tế bào đa diện đều nhau và đồng nhất được quan sát, với hình thái chuyển dần từ lớp đáy hình trụ lên trên các lớp dẹt dần, đặc biệt là lớp trên cùng Hình ảnh mô học này cho thấy tấm biểu mô có hình thái tương đồng với biểu mô của giác mạc.

Cấu trúc siêu vi cho thấy các tế bào liên kết chặt chẽ thông qua các thể liên kết và cầu bào tương dài, tạo thành hàng rào bảo vệ cho biểu mô Sự liên kết này là yếu tố quan trọng đảm bảo chức năng của biểu mô Hình ảnh thể hiện sự hiện diện của thể bán liên kết cho thấy sự gắn kết chặt chẽ giữa lớp đáy và nền giá đỡ màng ối Hoạt động của hàng rào chức năng và sự gắn kết của lớp đáy với giá đỡ là các yếu tố thiết yếu cho thành công của phẫu thuật ghép tấm biểu mô.

Qua hiển vi điện tử xuyên, cấu trúc tế bào ở lớp đáy cho thấy nhân lớn và khả năng tăng sinh mạnh, cùng với sự phát triển của các bào quan Lớp trên cùng của biểu mô chứa nhiều vi nhung mao, giúp tăng diện tích tiếp xúc với chất dinh dưỡng và cải thiện khả năng giữ ổn định lớp phim nước mắt trên bề mặt nhãn cầu.

Khi sử dụng hóa mô miễn dịch để định danh tấm biểu mô nuôi cấy, chúng tôi phát hiện sự hiện diện rõ rệt của p63 ở nhân tế bào lớp đáy, cho thấy đặc tính tế bào gốc trong lớp này, đảm bảo khả năng tái sinh của tế bào biểu mô sau ghép Kết quả cũng cho thấy có sự hiện diện của K3 ở các lớp trên đáy, đồng thời nhuộm PAS cho thấy sự vắng mặt của tế bào đài, một dấu hiệu đặc trưng của biểu mô kết mạc Những kết quả này chứng minh rằng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy có đặc tính tương tự như biểu mô giác mạc.

Nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng được thực hiện bởi Nakamura vào năm 2003, với thành công trong việc nuôi cấy tấm biểu mô từ thỏ bị bỏng trên nền giá đỡ màng ối Quan sát bằng kính hiển vi điện tử cho thấy tế bào niêm mạc miệng nuôi cấy có hình dạng, kích thước và cấu trúc siêu vi tương tự như tế bào biểu mô giác mạc bình thường Nghiên cứu hóa mô miễn dịch chỉ ra rằng K3 có mặt ở tất cả các lớp của tấm biểu mô nuôi cấy, mở ra hướng nghiên cứu mới cho Hayashida và cộng sự.

Năm 2005, nghiên cứu đã tiến hành nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng trên thỏ thực nghiệm, sử dụng màng polymer nhạy cảm nhiệt làm giá đỡ Tấm biểu mô này bao gồm 3-5 hàng tế bào lát tầng biệt hóa cao, có hình thái tương tự như biểu mô giác mạc bình thường Tuy nhiên, lớp đáy của tấm biểu mô có hình khối vuông và độ dày lớn hơn, không đều so với biểu mô giác mạc, cho thấy nguồn gốc từ niêm mạc miệng Tấm biểu mô nuôi cấy được xác định có sự hiện diện của dấu ấn p63, β1-integrin ở nhân tế bào lớp đáy, và connexin 43 ở khớp nối giữa các tế bào lớp đáy, cùng với kết quả test tạo cụm dương tính, thể hiện đặc tính tế bào gốc của tấm biểu mô.

Tấm biểu mô niêm mạc miệng có hình thái, cấu trúc và đặc tính tương tự như biểu mô giác mạc, vì vậy nó có thể được sử dụng làm nguyên liệu thay thế trong điều trị kiến tạo bề mặt nhãn cầu.

4.1.2 Kết quả ghép tự thân tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy cho thỏ thực nghiệm

Trong nghiên cứu lâm sàng, tất cả thỏ thực nghiệm đều có tấm biểu mô áp tốt và bề mặt nhãn cầu nhẵn Sinh thiết giác mạc cho thấy tấm biểu mô giữ hình thái tương đồng với biểu mô giác mạc, có khả năng bám dính và tồn tại bền vững Sau 2 tháng phẫu thuật, một vùng ở chu biên giác mạc không bám dính tốt do mũi khâu chưa được cố định, dẫn đến hiện tượng xâm nhập của tân mạch và mờ đục giác mạc Tuy nhiên, từ 30 ngày theo dõi trở đi, tấm biểu mô bám chặt vào nhu mô, giác mạc hết phù, tế bào sắp xếp đều đặn và không có hiện tượng sừng hóa Sự tồn tại bền vững của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy được giải thích nhờ đặc tính tế bào gốc, được khẳng định qua sự hiện diện của dấu ấn p63 trong tế bào đáy.

Nghiên cứu của Nakamura năm 2003 cho thấy sau 10 ngày ghép tự thân tấm biểu mô nuôi cấy trên thỏ, tấm biểu mô vẫn nguyên vẹn và gắn chặt với mô nền giác mạc, giúp duy trì độ trong suốt và hạn chế tân mạch Nghiên cứu tiếp theo của Hayashida và cộng sự cho thấy sau khi ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng, bề mặt nhãn cầu ổn định và giác mạc trở nên trong suốt như bình thường sau 4 tuần Kết quả mô học cho thấy tấm biểu mô vẫn tồn tại và không có sự xâm nhập của tân mạch Đặc biệt, dấu ấn K13 xuất hiện ở các lớp trên của biểu mô niêm mạc miệng nhưng không có trong biểu mô giác mạc sau ghép, chứng tỏ tấm biểu mô nuôi cấy có khả năng biến đổi kiểu hình để thích nghi với mô nền giác mạc Điều này khẳng định tính khả thi của việc sử dụng biểu mô niêm mạc miệng để thay thế biểu mô giác mạc trong kiến tạo bề mặt nhãn cầu.

4.1.3 Một số kinh nghiệm thu hoạch từ nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm trên thỏ đã cho thấy rằng việc gây bỏng với mức độ vừa phải có thể tạo ra rối loạn bề mặt nhãn cầu mà không gây tổn thương sâu, từ đó không dẫn đến phản ứng viêm dai dẳng và giảm thiểu nhu cầu sử dụng thuốc chống viêm sau phẫu thuật Tuy nhiên, ở bệnh nhân, cơ chế bệnh lý phức tạp hơn, do đó cần có phác đồ điều trị chống viêm phù hợp Đặc biệt, lớp kết mạc của thỏ vẫn nguyên vẹn sau khi gây bỏng, không ảnh hưởng đến việc tiết nước mắt, giúp tấm biểu mô nuôi cấy bám dính tốt trên bề mặt nhãn cầu Ngược lại, bệnh nhân thường gặp tình trạng thiếu hụt nước mắt, gây cản trở cho việc hàn gắn và duy trì sự bền vững của biểu mô, vì vậy cần chú ý đến việc phối hợp thuốc tăng cường dinh dưỡng giác mạc.

Mắt thỏ có nếp mí phụ giúp che phủ và nuôi dưỡng bề mặt nhãn cầu, do đó cần sử dụng kính tiếp xúc kéo dài sau mổ để bảo vệ biểu mô khỏi tác động môi trường Việc gây mê cho thỏ cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nghiên cứu, vì thỏ nhạy cảm với thuốc mê và dễ chết do quá liều Cần điều chỉnh liều thuốc mê một cách cẩn thận; nếu gây mê quá ngắn, thỏ có thể tỉnh dậy sớm, ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu Sử dụng bơm tiêm nhỏ để điều chỉnh liều thuốc mê và liên tục theo dõi nhịp tim cùng mức độ giãn đồng tử trong suốt quá trình phẫu thuật.

Nghiên cứu thực nghiệm của chúng tôi cho thấy kết quả tương đồng với các công bố quốc tế Việc thành công trong nghiên cứu trên thỏ thực nghiệm chứng minh tính khả thi của phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy, mở ra cơ hội ứng dụng phương pháp này cho bệnh nhân.

Ghép t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng nuôi c ấ y trên b ệ nh nhân

4.2.1.1 V ị trí m ảnh mô đượ c sinh thi ế t

Biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc đều có nguồn gốc từ ngoại bì da, là lớp biểu mô lát tầng không sừng hóa, dày và có nhiều hàng tế bào Biểu mô niêm mạc miệng có nhiều ưu điểm cho việc điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu, nhờ vào việc biệt hóa ở giai đoạn thấp hơn và chu kỳ tế bào ngắn, cho phép nuôi cấy nhanh chóng và duy trì lâu dài mà không bị sừng hóa Vùng niêm mạc miệng cũng thuận lợi cho sinh thiết do để lại sẹo kín đáo Các đặc điểm này cho thấy tiềm năng của biểu mô niêm mạc miệng như một nguồn nguyên liệu thay thế cho biểu mô giác mạc Tại niêm mạc miệng, tế bào có khả năng phân chia tập trung ở lớp đáy, với nhân bắt màu đậm khi nhuộm p63, đặc biệt nhiều ở nhú chân bì Nghiên cứu của Đỗ Thùy Hương chỉ ra rằng niêm mạc má có cấu trúc biểu mô dày với các hàng tế bào sát đáy nhỏ và nhân lớn, cho thấy khả năng thu được tế bào gốc cao hơn ở vùng này.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn vùng trung tâm niêm mạc má làm vị trí sinh thiết Kết quả cho thấy mẫu mô sinh thiết bao gồm lớp biểu mô không sừng hóa với 10-15 hàng tế bào, lớp đáy dày gồm 3-4 lớp tế bào nhỏ có bào tương bắt màu base đậm, và lớp Malpighi với 7-10 hàng tế bào hình đa diện có nhân hình cầu và ranh giới rõ ràng giữa các tế bào.

Trên cùng của mô niêm mạc miệng, có 2-3 hàng tế bào dẹt với nhân dẹt, trong đó lớp đáy thể hiện màu sắc đậm khi nhuộm p63 Các nhú chân bì có kích thước lớn và chia nhánh rõ ràng, trong khi mô đệm lỏng lẻo với ít tế bào Cấu trúc này tương đồng ở cả nam và nữ.

Hình 4.1 Hình ả nh nhu ộ m hóa mô mi ễ n d ị ch p63 niêm m ạ c vùng gi ữ a má

4.2.1.2 K ích thướ c m ả nh mô sinh thi ế t

Phương pháp nuôi cấy tế bào biểu mô bằng dịch treo yêu cầu mẫu mô lớn với đường kính 8 mm, trong khi phương pháp nuôi bằng mảnh mô chỉ cần kích thước 3 mm Chúng tôi đã áp dụng phương pháp nuôi cấy bằng mảnh biểu mô với kích thước 3 mm, giúp giảm đau đớn cho bệnh nhân và nhanh lành vết thương sau sinh thiết Việc sử dụng mảnh mô nhỏ cũng cho phép thực hiện sinh thiết nhiều lần mà không ảnh hưởng đến niêm mạc miệng của người bệnh.

4.2.1.3 Ch ất lượ ng c ủ a t ấ m bi ể u mô nuôi c ấ y

Trong nghiên cứu trên thỏ thực nghiệm, chúng tôi đã thành công trong việc nuôi tạo tấm biểu mô từ biểu mô niêm mạc miệng, có hình thái tương tự như biểu mô giác mạc với 4-5 hàng tế bào Hàng tế bào trên cùng dẹt dần và vẫn còn nhân, cho thấy đặc điểm không sừng hóa của biểu mô.

Hình ảnh hiển vi điện tử cho thấy sự liên kết chặt chẽ giữa các tế bào, tạo thành hàng rào chức năng cho biểu mô Tế bào lớp đáy có khả năng phát triển và phân chia cao với hệ thống bào quan phong phú, được gắn vào lớp màng ối bằng thể bán liên kết, giúp biểu mô nuôi cấy bám dính ổn định Định danh hóa mô miễn dịch cho thấy p63 tập trung ở tế bào lớp đáy, thể hiện đặc tính tế bào gốc, trong khi K3 xuất hiện yếu ở các tế bào lớp trên, phản ánh đặc tính của biểu mô giác mạc biệt hóa Do đó, tấm biểu mô nuôi cấy chứa cả tế bào gốc và tế bào trưởng thành, đảm bảo chức năng ổn định bề mặt nhãn cầu và khả năng tái sinh bền vững theo thời gian.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với nghiên cứu của Madhira và cộng sự năm 2008, trong đó các tác giả đã thu được tấm biểu mô niêm mạc miệng sau 3-4 tuần nuôi cấy, sử dụng màng ối làm giá đỡ, với hình thái và kiểu hình tương tự biểu mô vùng rìa nuôi cấy Tấm biểu mô này có 2-3 hàng tế bào không sừng hóa, không có tế bào đài, và có thể quan sát thấy các thể liên kết và bán liên kết Để nhận diện dấu ấn của tế bào gốc và tế bào biệt hóa, các tác giả đã sử dụng phương pháp sinh học phân tử như RT-PCR và hóa mô miễn dịch, xác nhận sự hiện diện của p63 trong lớp đáy và K3 ở các lớp trên.

Năm 2011, các tác giả đã chỉ ra rằng tấm biểu mô nuôi cấy từ niêm mạc miệng có khả năng cải thiện tình trạng khô mắt do thiếu hụt mucin, thường gặp trong bệnh lý rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng Qua phương pháp nuôi cấy mô với màng ối, họ đã tạo ra các thể liên kết giữa các tế bào biểu mô và thể bán liên kết với màng ối, trong đó có sự hiện diện của các hạt mucin Đặc biệt, lớp đáy chứa nhiều nhân đang phân chia, cho thấy tính tăng sinh của biểu mô Kết quả định danh hóa mô miễn dịch và sinh học phân tử cho thấy sự hiện diện của p63, β1-integrin, p75 (các dấu ấn tế bào gốc), K3, connexin 43 (dấu ấn tế bào biệt hóa) và các mucin gắn màng như MUC1, 13, 15, 16, cùng với mucin tạo keo MUC 5B và 6 Những phát hiện này cho thấy tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy có cấu trúc và chức năng tương tự như biểu mô giác mạc, có khả năng thay thế biểu mô giác mạc để tái thiết bề mặt nhãn cầu và cải thiện tình trạng khô mắt.

Khi áp dụng liệu pháp tế bào, việc đảm bảo quy trình nuôi cấy tế bào với số lượng và chất lượng cao là rất quan trọng để đáp ứng nhu cầu điều trị và duy trì sự sống của tế bào Một mục tiêu quan trọng khác là kiểm soát điều kiện nuôi cấy để tránh gây ra đột biến gen, giảm nguy cơ ung thư và đảm bảo tính an toàn cho liệu pháp điều trị Các nhà khoa học đang tìm kiếm giải pháp để loại bỏ nguyên liệu dị loài trong quá trình nuôi cấy Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng lớp tế bào nuôi là nguyên bào sợi tự thân từ mẫu mô sinh thiết, tạo ra điều kiện nuôi cấy gần giống với điều kiện sinh lý, giúp tế bào biểu mô nhận được tín hiệu từ mô đệm ban đầu và tránh việc sử dụng nguyên bào sợi 3T3 từ chuột, từ đó giảm thiểu nguy cơ tích hợp protein từ chuột vào tế bào nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy này đảm bảo an toàn, không có yếu tố dị loài, giúp tránh biến chứng về bệnh truyền nhiễm, phản ứng miễn dịch thải ghép và nguy cơ tích hợp protein động vật Tương tự, Oie và cộng sự (2010) cũng đã cải biên phương pháp nuôi cấy bằng cách sử dụng nguyên bào sợi hậu gián phân từ da người, cho kết quả khả quan.

Nghiên cứu của tác giả Klingbeil và cộng sự đã chứng minh rằng quá trình nuôi cấy biểu mô niêm mạc miệng là an toàn và không gây ra tế bào đột biến Bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch và sinh học phân tử (Western-Blot), các tác giả đã xác định sự hiện diện của các protein gây ung thư (p53 và MDM2) và các protein chống ung thư (pAkt và PTEN) trong tấm biểu mô nuôi cấy Kết quả cho thấy pAkt và PTEN có mặt, trong khi p53 và MDM2 không được phát hiện, khẳng định tính an toàn của tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy.

4.2.2 Kết quảthu đƣợc khi ghép trên bệnh nhân

4.2.2.1 Đặc điể m b ệ nh nhân Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi là 26,2 tuổi, thị lực trước mổ của các bệnh nhân đều rất thấp, hầu hết là dưới đếm ngón tay 1m Như vậy với đối tượng bệnh nhân còn trẻ tuổi, có nhu cầu học tập và lao động cao, lại có cả 2 mắt cùng bị bệnh và thị lực rất thấp, gần như mù lòa thì việc tìm giải pháp điều trịđể nâng cao thị lực cho bệnh nhân là rất cần thiết

Nguyên nhân chính gây bệnh trong nhóm nghiên cứu của chúng tôi là bệnh lý loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin và bỏng kết giác mạc do hóa chất Bệnh lý loạn dưỡng giác mạc dạng giọt gelatin thường xuất hiện sớm, từ tuổi thiếu niên, với các dấu hiệu kích thích cơ năng và giảm thị lực Bệnh tiến triển dưới biểu mô ở trung tâm giác mạc, dẫn đến tân mạch xâm nhập từ kết mạc vào giác mạc, nếu không được điều trị sẽ gây xơ đục ở các lớp nhu mô giác mạc phía dưới Trong nghiên cứu, chúng tôi có 3 bệnh nhân mắc bệnh này và đều được điều trị cả 2 mắt, cho thấy đặc điểm bệnh lý phù hợp với tuổi và tình trạng thị lực trước mổ của họ.

Nguyên nhân bỏng ở người trẻ thường do tai nạn lao động hoặc sinh hoạt, và đối với những trường hợp bị tổn thương nặng, tình trạng suy giảm tế bào gốc ở cả hai mắt dẫn đến bệnh cảnh nghiêm trọng và thị lực giảm sút đáng kể.

Để phẫu thuật kiến tạo bề mặt nhãn cầu thành công trong trường hợp rối loạn nặng, việc chuẩn bị nền ghép và môi trường xung quanh là rất quan trọng Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tích cực điều trị cho bệnh nhân bỏng ngay từ giai đoạn cấp, nhằm loại bỏ các tác nhân gây bỏng và ngăn chặn sự xâm nhập sâu vào tổ chức nhãn cầu, đồng thời thực hiện các biện pháp chống viêm Tất cả bệnh nhân đều được phẫu thuật cắt lọc tổ chức hoại tử, tách dính mi cầu và ghép màng ối Chúng tôi cũng đã sửa chữa các bất thường mi mắt để đảm bảo mắt luôn được nhắm kín, cung cấp liên tục chất dinh dưỡng cho bề mặt nhãn cầu, tạo điều kiện tốt cho sự sống của vật liệu ghép Tuy nhiên, vẫn còn 3 trường hợp nặng do tác nhân gây bỏng đã ngấm sâu vào nội nhãn, dẫn đến tổn thương rối loạn bề mặt nhãn cầu, xơ và tân mạch che phủ toàn bộ giác mạc.

Bài viết đề cập đến ba ca bệnh liên quan đến tổn thương mắt nghiêm trọng Một bệnh nhân bị thủng giác mạc kèm theo đục thể thủy tinh, trong khi hai bệnh nhân còn lại gặp phải tình trạng đục thể thủy tinh do ngấm chất gây bỏng và đã phải phẫu thuật thay thể thủy tinh Các ca bệnh này đều có tổn thương sâu phối hợp, dẫn đến việc cần điều trị chống viêm với liều cao và kéo dài Tiên lượng sau phẫu thuật cho những trường hợp này cũng gặp nhiều khó khăn.

4.2.2.2 Hi ệ u qu ả c ủ a ph ẫ u thu ậ t ghép t ự thân t ấ m bi ể u mô niêm m ạ c mi ệ ng nuôi c ấ y

Tiêu đề	Nghiên cứu phẫu thuật ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy điều trị rối loạn nặng bề mặt nhãn cầu hai mắt
Tác giả	Chỳng Tụi
Chuyên ngành	Y Học
Thể loại	Luận án tiến sĩ

Định dạng
Số trang	119
Dung lượng	2,66 MB