MÔ HỌC CỦA DA
Thƣợng bì
Các tế bào tạo sừng (keratinocyte) là thành phần chính của thượng bì da, được phân chia thành 4 lớp dựa trên quá trình biến đổi từ sâu ra nông, bao gồm lớp tế bào đáy, lớp tế bào gai, lớp tế bào hạt và lớp tế bào sừng.
Trung bì
Trung bì nằm dưới thượng bì, được phân cách bởi màng đáy:
- Lớp nhú: Mặt ngoài của trung bì tiếp xúc với thƣợng bì có những chỗ lồi lõm, chỗ lõm về phía thƣợng bì tạo thành các nhú trung bì
Lớp dưới của trung bì là phần chính nằm ở phía dưới, được cấu tạo từ mô liên kết đặc hơn Các sợi tạo keo trong lớp này được sắp xếp thành các bó, có hướng song song với bề mặt da.
Mặt cắt dọc t hân tóc
Trung bì Thƣợng bì Đầu tận thần kinh
Hạ bì
Hạ bì là lớp mô nằm giữa trung bì và cân cơ hoặc màng xương, đóng vai trò là tổ chức đệm Nó chứa các đám mô mỡ và được cấu tạo thành nhiều ô, được ngăn cách bởi các vách xơ mỏng Độ dày của hạ bì thay đổi tùy thuộc vào chủng tộc và giới tính của từng người.
Phần phụ của da
Tại Úc, ung thư da chiếm tỷ lệ cao gấp ba lần tổng số các loại ung thư khác, với khoảng 1% dân số mắc bệnh Ở Châu Âu, tỷ lệ mắc cũng đáng lo ngại, như ở Thụy Sỹ với hơn 15.000 ca mới mỗi năm Tại Anh, tỷ lệ mắc mới đã tăng 33% trong giai đoạn 2001-2010 Ngược lại, ở Châu Á, với loại da IV-V theo phân loại Fitz-Patrick, tỷ lệ mắc ung thư da thấp hơn so với người da trắng Một nghiên cứu năm 2006 cho thấy tỷ lệ ung thư da ở Singapore là 7,4/100.000 dân, trong khi tỷ lệ này ở Trung Quốc là 18,9/100.000 dân và ở Ấn Độ là 4,1/100.000 dân.
1.2.1 Ung thƣ tế bào đáy
Ung thư tế bào đáy là loại ung thư da phổ biến nhất, với tỷ lệ mắc tại Úc là 2.145/100.000 dân đối với nam giới và 1.259/100.000 dân đối với nữ giới So với Châu Âu, tỷ lệ này thấp hơn đáng kể, chẳng hạn như ở Thụy Sĩ, tỷ lệ mắc ở nam giới chỉ là 75/100.000 dân và ở nữ giới là 67/100.000 dân.
Tại Bắc Ailen, tỷ lệ ung thư da ở nam giới là 94/100.000 dân và ở nữ giới là 72/100.000 dân Nghiên cứu năm 2006 về ung thư da ở người châu Á tại Singapore cho thấy tỷ lệ ung thư da ở người Trung Quốc là 18,9/100.000 dân, người Malaysia là 6,0/100.000 dân và người Ấn Độ là 4,1/100.000 dân.
Theo nghiên cứu của Bùi Xuân Trường và cộng sự tại Bệnh viện Ung bướu TP.HCM từ năm 1994 đến 1997, 67% trong số 481 trường hợp ung thư da vùng đầu cổ là u tế bào đáy.
DỊCH TỄ HỌC UNG THƢ DA
Ung thƣ tế bào đáy
Ung thư tế bào đáy là loại ung thư da phổ biến nhất, với tỷ lệ mắc tại Úc là 2.145/100.000 dân đối với nam giới và 1.259/100.000 dân đối với nữ giới Trong khi đó, tỷ lệ mắc ung thư tế bào đáy ở Châu Âu thấp hơn nhiều, cụ thể tại Thụy Sĩ, tỷ lệ này là 75/100.000 dân cho nam giới và 67/100.000 dân cho nữ giới.
Tại Bắc Ailen, tỷ lệ ung thư da ở nam giới là 94/100.000 dân và ở nữ giới là 72/100.000 dân Nghiên cứu năm 2006 về ung thư da ở người châu Á tại Singapore cho thấy tỷ lệ ung thư da ở người Trung Quốc là 18,9/100.000 dân, trong khi đó tỷ lệ này ở người Ma-lai-xi-a là 6,0/100.000 dân và ở người Ấn Độ là 4,1/100.000 dân.
Nghiên cứu của Bùi Xuân Trường và cộng sự tại Bệnh viện Ung bướu TP.HCM từ năm 1994 đến 1997 cho thấy 67% trong số 481 trường hợp ung thư da vùng đầu cổ là ung thư biểu mô tế bào đáy.
Theo nghiên cứu của Thị Hương Giang (2005) tại Bệnh viện Ung bướu Hà Nội, ung thư da không hắc tố chiếm 91,67% tổng số ca ung thư da, trong đó 50% là ung thư tế bào đáy Một nghiên cứu gần đây của Vũ Thái Hà và cộng sự tại Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cho thấy tỷ lệ ung thư tế bào đáy vào năm 2010 đã tăng gần gấp ba lần so với năm 2007, chiếm 58,8% tổng số bệnh nhân ung thư da.
Ung thƣ tế bào vảy
UTTB vảy là bệnh thường gặp ở những người hoạt động ngoài trời, với tỷ lệ mới mắc ở Mỹ khoảng 100 trường hợp trên 100.000 dân, trong khi ở Pháp là 30/100.000 dân Nghiên cứu tại Australia cho thấy tỷ lệ mắc bệnh này đã tăng từ 166/100.000 người lên 250/100.000 người trong vòng 5 năm, cho thấy sự gia tăng đáng kể của bệnh.
Tỷ lệ ung thư da vảy (UTTB vảy) hiện đang gia tăng trên toàn cầu, với người da trắng có nguy cơ cao nhất do yếu tố chủng tộc và cường độ ánh sáng mặt trời Thói quen phơi nắng và xu hướng du lịch đến các quốc gia nhiệt đới vào mùa hè của người da trắng là những yếu tố chính góp phần vào sự gia tăng này Tại Việt Nam, UTTB vảy chiếm hơn 20% tổng số ca ung thư da, với nghiên cứu của Bùi Xuân Trường chỉ ra tỷ lệ này đạt 27%.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hương Giang là 27,78% [17] và của Đỗ Thu Hằng là 9,9% trong giai đoạn 1999-2004 [20].
SINH BỆNH HỌC UTTB ĐÁY VÀ UTTB VẢY
Ung thƣ tế bào đáy
Bác sĩ nhãn khoa Arthur Jacob (1827) là người đầu tiên nghiên cứu u tế bào đáy (UTTB đáy) Vào năm 1899, Braun và Spiegler xem UTTB đáy như một u nội mô, trong khi Krompecher (1900) mô tả hình ảnh giải phẫu bệnh và gọi tình trạng này là "UTTB đáy" Ông cho rằng khối u bắt nguồn từ các tế bào đáy của biểu bì và đặt ra câu hỏi về khả năng khối u có thể xuất phát từ các nang và tuyến hay không Một số tác giả phân loại nó là khối u lành tính, thuộc nhóm nốt bớt Lever (1954) cho rằng những tổn thương này phát triển tại vị trí đã tia xạ, dẫn đến sự tăng sinh các tế bào phôi thai và hoạt động như một phản ứng đối với những kích thích đó.
Melczer và CS xác định UTTB đáy là một UT biểu mô thực sự do sự hiện diện của cấu trúc biểu bì thô sơ Bệnh không có khả năng di căn nhưng gây ra sự phá hủy trong quá trình phát triển của tổn thương Feyrter (1938) và Pinkus (1928) phân loại UTTB đáy vào nhóm tế bào trong mô biểu bì, có khả năng phát triển ở tuổi già Mô bệnh học của UTTB đáy cho thấy cấu trúc trung gian, với mức độ loạn sản ít hơn so với UTTB vảy, và rất hiếm khi được tạo ra trong thí nghiệm Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây lại không chứng minh được điều này.
Bệnh UTTB đáy thường xuất hiện trên da đã tổn thương hoặc trên vùng da có vẻ nguyên vẹn mà không có thay đổi rõ ràng Những thay đổi này có thể bao gồm sẹo bỏng, viêm nhiễm mãn tính, và các mụn cóc Theo Pinkus (1953), UTTB đáy có thể xảy ra trong trường hợp UT biểu mô sợi, được gọi là "UT sợi tiền ác tính" Winer và Lewin (1961) đã ghi nhận hai trường hợp UTTB đáy nhiễm sắc tố từ mụn cóc Một dạng ít gặp của UTTB đáy là dạng nội biểu bì, thường xảy ra ở người từ 50 tuổi trở lên, mặc dù cũng có thể gặp ở người trẻ hơn Các tổn thương chủ yếu phát triển ở vùng đầu cổ, ít thấy hơn ở thân và chi, và có thể có nhiều ổ UT cùng tồn tại.
94 tổn thương cũng trên thân mình) 22
Ung thư tế bào đáy là loại tổn thương tiến triển chậm và hiếm khi di căn Theo tài liệu y khoa, chỉ có khoảng 300 trường hợp ung thư tế bào đáy di căn xa và tỷ lệ di căn hạch chỉ đạt 0,03% Nghiên cứu của Lo (1991) cho thấy tỷ lệ di căn dao động từ 0,0028% đến 0,5%, trong đó 85% trường hợp di căn hạch xảy ra ở vùng đầu và cổ.
Ung thƣ tế bào vảy
Ung thư tế bào vảy, còn gọi là UT tế bào gai hoặc UT tế bào dẹt sừng hoá, là một loại ung thư phổ biến với nhiều thuật ngữ khác nhau Trong đó, UTTB vảy và UTTB gai là hai tên gọi thường được sử dụng nhất để chỉ loại ung thư này.
UTTB vảy của da có đặc điểm tương đồng với các bộ phận khác, với mô học đa dạng và nhiều phần trong khối u có thể phân biệt qua mức độ biệt hóa và cách nhân lên Broders (1932) đã phân loại mức độ ác tính dựa trên mức độ biệt hóa, từ cao đến không biệt hóa UTTB vảy sừng hoá thường xuất hiện trên các tổn thương tiền UT, tương tự như UTTB đáy ở những vùng da tiếp xúc với ánh sáng như mặt, cổ, và tay Thống kê của Herendi (1951) cung cấp thêm thông tin về tình hình này.
UTTB vảy thường là dạng đơn ổ, trong khi UTTB đáy phần thân cơ thể thường có nhiều ổ Theo nghiên cứu của Trendelenburg (1933), UTTB vảy thường gặp nhiều hơn ở nam giới so với nữ giới, thường xuất hiện trước tuổi 40, gia tăng ở tuổi 50 và đạt đỉnh từ 60 đến 70 tuổi.
Việc phân biệt giữa UTTB vảy và UTTB đáy ở giai đoạn sớm là rất khó khăn, nhưng UTTB vảy thường phát triển nhanh hơn Khối u này được hình thành từ các tế bào không biệt hóa và đa hình, với sự hiện diện của nhiều tế bào khổng lồ đa nhân và phân bào không điển hình trên vi thể Khi vượt qua ranh giới giữa lớp biểu mô và mô liên kết, khối u bắt đầu thâm nhiễm sâu và phá hủy các mô lân cận, một đặc trưng nổi bật của loại khối u này Một dạng khác là quá trình sừng hóa chưa hoàn thành, được gọi là á sừng, trong đó UTTB vảy không sừng hóa có sự thiếu hụt hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn của sự keratin hóa Một số khối u lại có các tế bào với bào tương như lớp bọt, khiến cho hình thái mô bệnh học của chúng giống như sarcom không biệt hóa hoặc sarcom lưới.
Các khối u này không biệt hóa hoàn toàn và đã đƣợc Gotton (1960) gọi là sarcom giả (pseudosarcoma).
ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG UNG THƢ DA
Triệu chứng lâm sàng
Khối u thường xuất hiện sau tổn thương dày sừng ở người lớn tuổi, chủ yếu ở vùng mặt do tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, và cũng có thể gặp ở trẻ em Theo Gunter Burg (2000), khoảng 85,3% trường hợp u thường gặp ở mặt, hiếm khi ở lòng bàn tay, bàn chân và niêm mạc Biểu hiện của khối u là một khối nhỏ trên da hở, thâm nhiễm cứng, có thể có màu sắc bình thường hoặc tăng sắc tố, dễ chảy máu và có thể loét Theo thời gian, tổn thương lan rộng, thâm nhiễm và xuất hiện vết trợt loét ở đáy, cùng với các cục nhỏ gọi là hạt ngọc trai UT Các biểu hiện lâm sàng có thể khác nhau tùy thuộc vào biến thể của UTTB đáy.
Các hình thái lâm sàng thường gặp [26],[27]:
* Hình thái nốt hoặc nốt loét:
Tổn thương cơ bản thường bắt đầu bằng sẩn và sau đó phát triển thành nốt đỏ hoặc hồng với bề mặt bóng và lõm ở trung tâm Các nốt này có mật độ chắc và xuất hiện giãn mạch Bên ngoài nốt có thể thấy các sẩn ngọc màu sáp hoặc trong mờ giống như hạt ngọc trai Tổn thương có khả năng lan rộng, với trung tâm có thể hoại tử và loét, do đó trước đây được gọi là “loét ở động vật gặm nhấm.”
UTTB đáy thể nốt thường tiến triển chậm, nhưng có khả năng xâm lấn vào các tổ chức xung quanh, gây biến dạng và rối loạn chức năng cho một số cơ quan như mũi, miệng và mắt.
Hình thái nông là hình thái thường gặp thứ hai sau hình thái nốt và chiếm 9-17,5% các trường hợp UTTB đáy [14]
Tổn thương cơ bản là một vùng da phẳng hoặc hơi gồ lên, có bờ giống sợi chỉ nhỏ, rõ ràng và màu đỏ hoặc hồng Trung tâm tổn thương có thể xuất hiện teo, đóng vảy hoặc loét, và trên bề mặt có thể có các đốm sắc tố Về lâm sàng, thể nông của tổn thương này dễ nhầm lẫn với chàm đồng tiền, vảy nến hoặc bệnh Bowen.
- Tiến triển: Hình thái nông thường phát triển theo chiều ngang và xâm lấn sâu vào tổ chức xung quanh nếu không đƣợc điều trị.
Hình thái xơ là dạng u ít gặp nhất, chỉ chiếm khoảng 2-3% trong tổng số các u tế bào đáy Đây là loại u có khả năng xâm lấn mạnh, dẫn đến nguy cơ tái phát cao sau điều trị Sự xâm lấn mạnh mẽ trong ung thư da thường liên quan đến sự biểu hiện của gen TP53.
Tổn thương cơ bản là mảng hoặc sẩn xơ có màu sắc tương tự như màu da bình thường, màu hồng hoặc trắng Bề mặt da có thể xuất hiện sẹo lõm và thâm nhiễm, trong khi phần dưới khối u thường lan rộng hơn so với bờ tổn thương, dẫn đến nguy cơ chẩn đoán nhầm với sẹo lõm và xơ cứng bì Gần đây, phương pháp soi da đã hỗ trợ chẩn đoán hiệu quả hơn nhờ vào việc quan sát sự tăng sinh và giãn mạch trên bề mặt thương tổn.
Hình thái xơ của UTTB đáy có khả năng xâm lấn mạnh mẽ hơn so với các thể khác, dẫn đến nguy cơ tái phát cao sau điều trị Tỷ lệ tái phát của thể này có thể lên đến 60%, do sự lan rộng của khối u thường vượt quá bờ tổn thương.
Thường có 2 hoặc nhiều hơn các thể trên trong một khối u
*Hình thái tăng sắc tố:
Tổn thương cơ bản có thể xuất hiện dưới dạng nốt hoặc thể nông, thường đi kèm với hiện tượng tăng sắc tố Đặc biệt, ở thể nốt, có thể thấy dấu hiệu "lốm đốm" sắc tố màu nâu đen tại bên trong hoặc bờ tổn thương, đây là một dấu hiệu lâm sàng quan trọng Biểu hiện lâm sàng của tổn thương sẽ khác nhau tùy thuộc vào số lượng và vị trí của melanin, với các màu sắc có thể là đen, nâu hoặc xám xanh.
Ung thư tế bào vảy thường xuất hiện dưới dạng các sẩn hoặc mảng nổi cao, chắc, màu hồng đến đỏ, có thể loét hoặc đóng vẩy, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư như dày sừng ánh sáng (actinic keratosis) Tổn thương này thường có ranh giới không rõ, phát triển chậm và thường gặp ở những người có làn da sáng, có tiền sử tiếp xúc nhiều với ánh nắng Các đặc điểm đi kèm bao gồm da khô, giãn mạch, và dày sừng, với khoảng 20-25% trường hợp tiến triển thành ung thư tế bào vảy Tổn thương thường có kích thước dưới 1 cm, màu nâu đậm hoặc đỏ, và có thể phát triển thành sừng da (cutaneous horn).
Khối u sùi thường có bề mặt mủn nát, dễ chảy máu và lớn, biểu hiện như một khối loét sùi kiểu súp lơ với mùi hôi khó chịu Khi bị bội nhiễm, khối u có thể sưng đỏ xung quanh, gây đau và tiến triển nhanh chóng, loét sùi nông và xâm lấn xuống lớp sâu Đặc biệt, khối u ở vùng da đầu có thể làm lộ xương sọ, dẫn đến biến dạng và bội nhiễm nghiêm trọng Theo Robbins, u tế bào vảy ban đầu là một loét nông với vảy sừng bao quanh bờ cao không đều, tiến triển sâu xuống nền cứng, có khả năng phá hủy tổ chức trung bì và gây tổn thương mạch máu, dẫn đến hiện tượng xuất huyết tại khối u.
Một số UTTB vảy có thể xuất hiện nhanh chóng trong vài tuần, thường liên quan đến tiền sử chấn thương và tiếp xúc với ánh nắng, và có khả năng tự khỏi sau vài tháng Thể bệnh này thường đi kèm với các bệnh lý da khác như hội chứng Ferguson Smith, Gryzbowski và Muir-Torre Bên cạnh đó, UTTB vảy cũng có thể phát triển trên những tổn thương da đã có từ trước, đặc biệt trong nhóm bệnh da tiền.
Bệnh thường biểu hiện rất đa dạng với các thể lâm sàng:
UTTB vảy xâm nhập bao gồm các thể loại như thể sùi, với thương tổn giống súp lơ, thường hiếm gặp và có độ ác tính thấp Thể hậu môn sinh dục thường xuất hiện trên các thương tổn loạn sản trước đó, trong khi thể quanh miệng thường gặp ở môi dưới Thể quanh móng dễ bị nhầm lẫn với hạt cơm và có liên quan đến HPV16 Ngoài ra, thể viêm kẽ và thể Marjolin thường gặp ở những thương tổn sẹo hoặc loét mạn tính.
- UTTB vảy tại chỗ: bệnh Bowen, hồng sản Queyrat, sẩn dạng Bowen
Các thể này có thể chuyển thành thể xâm nhập nếu không điềutrị sớm.
UTTB vảy da ở vùng đầu, mặt và cổ thường có xu hướng lan rộng, xâm nhập vào hệ thống bạch huyết và tổ chức lân cận Tình trạng này có thể dẫn đến loét, phá hủy mô và chèn ép các sợi thần kinh, gây ra đau đớn, nhiễm trùng và hoại tử.
Hạch viêm thường khó phân biệt với hạch di căn, đặc biệt khi phát hiện muộn Tỷ lệ di căn hạch của ung thư tế bào vảy (UTTB vảy) có thể khác nhau ở các vị trí, với hơn 50% xảy ra ở vùng cổ và tai Theo nghiên cứu của Venker (1964), tỷ lệ di căn hạch là 0,5-16%, trong khi Greithe (1957) báo cáo tỷ lệ này là 15-20% T.Q Diện cho biết tỷ lệ di căn là 13,8%, thường xảy ra sớm hơn ở tổn thương rộng trên niêm mạc và các vùng bán niêm mạc như môi và một số vùng da khác như vành tai, da đầu UTTB vảy có độ ác tính cao và ít biệt hóa thường di căn sớm qua đường bạch huyết vào hạch và qua đường máu vào phổi, xương Kích thước u cũng liên quan mật thiết đến mức độ di căn hạch, với các tác giả cho rằng khối u có đường kính trên 2 cm sẽ tăng gấp 3 lần nguy cơ di căn hạch, đồng thời mức độ xâm lấn của khối u cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ di căn hạch của UTTB vảy.
Phân loại giai đoạn theo TNM
Theo NCCN (2014), UTTB đáy và UTTB vảy của da đầu mặt cổ đƣợc phân loại nhƣ sau [41]:
Tx: Khối u nguyên phát không thể đánh giá đƣợc.
Tis: Ung thƣbiểu mô tại chỗ.
T1: U có kích thước lớn nhất không quá 2cm, với ít hơn 2 yếu tố nguy cơ.
T2: U có kích thước lớn hơn 2 cm hoặc u kích thước bất kỳ với hơn 2 yếu tố nguy cơ.
T3: U xâm lấn vào các tổ chức xương hàm trên, xương hàm dưới, ổ mắt hoặc xương thái dương.
T4: U xâm lấn sâu vào xương, hoặc thần kinh
Hạch bạch huyết vùng không thể đánh giá được (NX) Không có biểu hiện hạch vùng bị xâm lấn (N0) Một hạch duy nhất cùng bên với đường kính ≤ 3 cm được coi là hạch vùng xâm lấn (N1).
Hạch vùng đối bên di động nhưng có dấu hiệu xâm lấn lớn hơn 3cm, với một hạch duy nhất cùng bên có đường kính tối đa 6 cm, hoặc nhiều hạch cùng bên có đường kính nhỏ hơn 6 cm, cũng như hạch hai bên hoặc đối bên có đường kính nhỏ hơn 6 cm.
N2a: 3cm < Một hạch duy nhất cùng bên đường kính ≤ 6 cm N2b: Nhiều hạch cùng bên đường kính < 6 cm
N2c: Hạch hai bên hoặc đối bên đường kính < 6 cm.
N3: Hạch vùng cố định và đã bị xâm lấn, đường kính ≥ 6 cm.
M0: Không có biểu hiện di căn xa
M1: Có biểu hiện di căn xa
Theo cách phân loại mới này các tác giả đã chú ý đến chiều sâu và sự xâm lấn của khối u cũng nhƣ tiên lƣợng khối u tốt hơn.
MÔ BỆNH HỌC UNG THƢ DA
Phân loại mô bệnh học UTTB đ áy
Tế bào đáy trong thượng bì có vai trò quan trọng trong sự phát triển của các khối u, thường bắt đầu từ thượng bì và xâm lấn vào hạ bì dưới dạng rắn hoặc u nang Các tế bào ung thư (UT) có đặc điểm nhân thẫm màu, hình trụ, và tỷ lệ nhân/bào tương tăng cao, đồng thời mất đi các cầu nối gian bào Những tế bào này thường nhỏ, hình tròn hoặc hơi bầu dục, và xung quanh chúng là tổ chức liên kết thưa và xơ nhầy Các đám tế bào ở ngoại vi khối u thường sắp xếp theo kiểu hàng dậu, và một đặc điểm thường thấy ở các khối u lớn là hiện tượng hoại tử ở trung tâm.
UTTB đáy có nguồn gốc từ các tế bào đáy của biểu bì hoặc từ lớp ngoài của nang lông Một phân loại mô bệnh học lý tưởng cho UTTB đáy nên phân chia thành các týp liên quan đến độ ác tính, tiến triển và tiên lượng lâm sàng Hiện nay, có hai hướng chính để phân loại UTTB đáy: dựa trên đặc điểm phát triển mô học và dựa vào đặc điểm biệt hóa mô học Tuy nhiên, vẫn chưa có một phân loại thống nhất cho UTTB đáy, và các phân loại dựa trên đặc điểm phát triển được coi là có ý nghĩa lâm sàng hơn.
Phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2006 dựa vào đặc điểm phát triển và sự biệt hóa để chia UTTB đáy thành các typ sau [43]:
* Týp bề mặt (ICD-O code 8091/3):
Tổn thương lâm sàng xuất hiện dưới dạng đám màu hồng nhạt, thường có tình trạng loét, chảy máu và đóng vảy trên bề mặt Các tổn thương này có rìa tương đối rõ ràng, kích thước thay đổi từ vài milimet đến vài centimet Vùng thoái triển có thể biểu hiện như một mảng xám hoặc xơ hóa.
U MBH có đặc điểm là các đám tế bào dạng đáy liên tục, nằm trong biểu bì hoặc nang lông, lồi vào trong trung bì và được bao quanh bởi mô nhày lỏng lẻo Trong một số trường hợp, các đám tế bào u có thể tách biệt, biểu hiện của týp đa ổ thực sự Ngoài ra, u MBH có thể phối hợp với các týp khác như týp nốt, týp vi nốt và týp xâm nhập.
Các nốt hạt trai nổi gồ lên, có mật độ chắc và giãn mạch trên bề mặt là những đặc điểm lâm sàng chính Những tổn thương này có thể bị loét và hình thành nang, đồng thời dễ chảy máu, dẫn đến nhầm lẫn với u mạch máu hoặc u hắc tố.
MBH có đặc điểm nổi bật với nhiều đám tế bào dạng đáy kích thước lớn, trong đó nhân tế bào được sắp xếp theo kiểu hàng dậu xung quanh U có thể trải qua quá trình thoái hóa nhày, hình thành các nang hoặc có dạng cấu trúc “sàng”.
* Týp vi nốt (ICD-O code 8090/3):
- Đặc điểm lâm sàng: Biểu hiện các tổn thương phẳng hoặc hơi gờ nhẹ.
Đặc điểm của MBH là sự xuất hiện của các nốt nhỏ có kích thước tương đương với nang lông, phân bố lan tỏa và xâm nhập sâu vào trung bì, điều này khiến chúng rất dễ bị bỏ sót khi đánh giá rìa diện cắt u.
* Týp xâm nhập (ICD-O code 8092/3):
- Đặc điểm lâm sàng: u gồm các mảng cứng, màu xám, ranh giới không rõ, khi phẫu thuật phải chú ý vì rất dễ bỏ sót u.
- Đặc điểm MBH: u gồm các dải tế bào dạng đáy với bào tương hẹp, xâm nhập xen kẽ giữa mô đệm u nên thường không thấy hình ảnh hàng dậu
Trong biến thể này, hình thái xâm nhập quanh bó sợi thần kinh cần được chẩn đoán phân biệt với một số loại u khác như ung thư ống tuyến mồ hôi xơ cứng, u tế bào vảy xơ hóa và u mầm lông xơ hóa.
* Týp xơ - biểu mô (ICD-O code 8093/3):
Các khối u thường xuất hiện dưới dạng nốt ban đỏ, nốt nổi gồ lên, hoặc có thể là những tổn thương dày sừng tiết chất bã hoặc mụn cơm có cuống.
Mũ bảo hiểm (MBH) có đặc điểm nổi bật với mạng lưới các nhánh và dải tế bào dạng đáy bao quanh mô xơ mạch, lan rộng từ biểu bì và tạo thành hình ảnh đặc trưng.
* Týp biệt hóa phần phụ da (ICD-O code 8098/3):
- Đặc điểm lâm sàng: Týp này không có điểm riêng biệt về lâm sàng.
Mũ bảo hiểm (MBH) này có đặc điểm nổi bật với các thành phần tương tự như cấu trúc phần phụ của da, bao gồm các ống tuyến, nang lông và tuyến bã.
Cần phải phân biệt với UTtuyến mồ hôi vì loại u này có nguy cơ di căn xa.
* Týp đáy - vảy (ICD-O code 8094/3):
- Đặc điểm lâm sàng: Týp này không có đặc điểm riêng trên lâm sàng
Đặc điểm của MBH là các tế bào u có bào tương rộng hơn và hiện tượng sừng hóa diễn ra nhiều hơn so với các trường hợp UTTB đáy điển hình Ngoài ra, có một số khu vực không xuất hiện hình ảnh “hàng dậu” xung quanh đám tế bào u.
* Týp sừng hóa (ICD-O code 8090/3):
- Đặc điểm lâm sàng: Týp này có hình ảnh đặc trƣng nhƣ những hạt ngọc trai lóng lánh, trên đó có khảm các nang sừng nhỏ.
MBH có cấu trúc tương tự như týp nốt, nhưng có nhiều vùng bị sừng hóa Sự sừng hóa này có thể mỏng manh, hình phễu hoặc có dạng cấu trúc nang lông.
Các biến thể khác chiếm ít hơn 10% các trường hợp UTTB đáy và thường không phân biệt được trên lâm sàng.
- Biến thể nang: gồm một hoặc nhiều nang với các kích thước khác nhau tập trung gần vùng trung tâm
- Biến thể dạng tuyến: cấu trúc gồm có nhiều dải mỏng mảnh các tế bào dạng đáy sắp xếp tạo thành các mạng lưới tế bào
Biến thể xơ hóa/xơ cứng là tình trạng mà các dải và “ổ” tế bào u bám chặt vào mô đệm xơ cứng, thể hiện qua các mảng màu xám với ranh giới hơi gờ và không rõ ràng.
- Các loại khác: UTTB đáy tế bào sáng, UTTB đáy tế bào hạt, UTTB đáy tế bào khổng lồ
Mô bệnh học và độ mô học UTTB vảy
Ung thư tế bào vảy là loại ung thư phát triển từ tế bào biểu bì, có thể xuất hiện dưới dạng ổ, đám, dải hoặc dây tế bào Tổ chức u thường phát triển sâu vào trung bì với các mức độ khác nhau Tế bào trong khối u có bào tương lớn, ưa toan, với cầu nối tế bào rõ rệt và nhân tế bào lớn, có thể có nhân quái và nhân chia Để đánh giá mức độ biệt hóa của khối u, người ta phân loại thành ba mức: biệt hóa rõ với tế bào đa diện và hóa sừng rõ rệt; biệt hóa vừa với tế bào lớn, bào tương rõ và nhiều nhân chia; và biệt hóa kém với tế bào nhỏ, đôi khi giống tế bào đáy.
Mô bệnh học các biến thể UTTB vảy
Theo phân loại của WHO 2006 gồm các thể chính sau [43]:
UTTB vảy thể tiêu gai (Acantholytic squamous cell carcinoma) là một biến thể của ung thư tế bào vảy, trong đó các tế bào thường liên kết lỏng lẻo do sự tiêu biến của các gai nối giữa các tế bào vảy.
UTTB vảy - tế bào thoi (Spindle-squamous cell carcinoma) là một dạng ít gặp của ung thư tế bào vảy, trong đó tế bào hình thoi chiếm ưu thế trong khối u Loại khối u này thường xuất hiện ở những vùng da đã bị chiếu xạ hoặc tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
UTTB vảy mụn cơm (Verrucous squamous cell carcinoma) là một dạng UTTB vảy biệt hóa cao với khả năng ác tính thấp, chiếm từ 2-12% các khối u ở miệng Bệnh thường gặp ở nam giới nhiều hơn nữ giới và thường xuất hiện ở độ tuổi 50 Khối u này đôi khi kết hợp với tổn thương loét lâu liền, kéo dài.
UTTB tuyến vảy (Adeno squamous cell carcinoma) là một loại ung thư hiếm gặp, xuất phát từ các tế bào đa năng (pluripotential) và có khả năng hình thành tuyến nhày.
Phân độ biệt hóa theo 3 độ theo Hermanek (1997) : là cách phân độ hiện nay đƣợc dùng đánh giá trong thực hành hợp lý hơn [45]:
- Độ I: Biệt hoá cao (well differentiated)
- Độ II: Biệt hoá vừa (moderatly differentiated)
Grade III tumors are characterized by poor differentiation or undifferentiated cells, indicating a lack of specialization In contrast to well-differentiated and moderately differentiated tumors, Grade III tumors exhibit unclear or indistinct boundaries, which can complicate diagnosis and treatment Understanding these distinctions is crucial for effective cancer management.
Không rõ và có xâm lấn nhiều.
Kích thước ổ tế bào trong u
Hay thay đổi Hay thay đổi Thường nhỏ, có thể một vài tế bào tách rời nhau.
Sự sừng hoá của các tế bào và cầu nối
Thường rõ Có hoặc không rõ Ít hoặc không có
Cầu sừng Thường có Ít Hiếm hoặc không có
Nhân chia Ít Có nhiều Thường có và không điển hình
Xâm lấn mạch Hiếm Có thể thấy Thường gặp
Năm 1920, Broders đã phát triển một phương pháp dễ nhớ để phân loại độ ác tính của ung thư thành 4 cấp độ, nhằm đánh giá khả năng phát triển của tế bào ung thư.
- Độ 1: Có trên 75% các tế bào biệt hoá;
- Độ 2: Có từ 50%-75% các tế bào biệt hoá;
- Độ 3: Có từ 25-50% các tế bào biệt hoá;
- Độ 4: Có dưới 25% các tế bào biệt hoá.
Hình 1.2 : Hình ảnh minh họa phân làm 4 độ (grading) biệt hoá Theo phân loại mới của NCCN (2014) xu hướng phân làm 2 độ [41]:
- Độ biệt hóa cao (Well or moderately differentiated)
- Kém biệt hóa (Poorly differentiated).
ĐIỀU TRỊ UNG THƢ DA
Phẫu thuật
Theo UICC, khoảng 80% ung thư da được điều trị bằng phẫu thuật Nguyên tắc phẫu thuật triệt căn cho u nguyên phát là lấy u đủ rộng, đảm bảo diện cắt xung quanh không còn tế bào ung thư Cần cân nhắc kỹ lưỡng các yếu tố như vị trí, kích thước và mức độ thâm nhiễm, trong khi vấn đề thẩm mỹ chỉ đứng ở vị trí thứ yếu.
Việc cắt bỏ khối u da cần diện cắt đủ rộng để ngăn ngừa tái phát, với tỷ lệ tái phát tại chỗ dao động từ 3,3% đến 16,7% tùy theo nghiên cứu Lựa chọn đường cắt tối ưu không hề đơn giản và phụ thuộc vào kinh nghiệm của phẫu thuật viên cũng như đặc điểm lâm sàng của từng trường hợp Hiện nay, có rất ít nghiên cứu về mức độ xâm lấn trong u da, trong khi nhiều tài liệu tập trung vào diện cắt u.
1.6.1.1 Ph ẫ u thu ậ t c ắ t b ỏ UTTB đáy và UTTB vả y
Theo Wolf và Ziteli, các tổn thương UTTB đáy chỉ lan rộng vi thể khoảng 1-6 mm, cho phép phẫu thuật cắt bỏ khối u có đường kính 2 cm với khoảng cách 4 mm từ bờ u, đạt tỷ lệ khỏi 90% Đối với u lớn hơn 2 cm, cần cắt rộng hơn Các tổn thương thể xơ bì thường có độ ác tính cao và được khuyên nên phẫu thuật cắt rộng hơn, tối thiểu 1-2 cm từ bờ u Trong trường hợp UTTB đáy, phẫu thuật chủ yếu tập trung vào chiều sâu của thương tổn; Graham Colver cho rằng phần lớn bệnh không lan xuống hạ bì, do đó phẫu thuật cắt tới lớp mỡ là đủ, với độ sâu từ 1-4 mm ở mặt và 5-8 mm ở lưng Đối với các thương tổn tái phát, cần rạch da cách bờ tổn thương 5 mm.
Để đạt được tỷ lệ khỏi bệnh cao hơn, kích thước u cần được xem xét kỹ lưỡng Đối với các loại u, diện cắt phù hợp là rất quan trọng Cụ thể, đối với u có kích thước nhỏ hơn 2 cm, cần cắt sâu đến lớp mỡ dưới da để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn.
4 cm cần cắt hết lớp mỡ, u > 4 cm cần cắt một phần hoặc cả bề dày cơ, u xâm lấn rộng cắt đến màng xương hoặc đục một phần xương [35]
Để điều trị triệt căn u tuyến vảy, cần cắt bỏ hoàn toàn khối u và có thể thực hiện vét hạch khu vực Đối với khối u có kích thước nhỏ hơn 2 cm, đường rạch cần cách rìa khối u ít nhất 20 mm và phải cắt sâu đến lớp mỡ dưới da Sau phẫu thuật, cần kiểm tra vi thể để đảm bảo diện cắt và vùng đáy khối u không còn tế bào bệnh.
UT có kích thước lớn hơn 4 cm cần được cắt cách rìa u 20 mm và cắt sâu đến một phần lớp cơ Việc kiểm tra vi thể diện cắt và đáy u là rất quan trọng Phẫu thuật sạch sẽ được chỉ định cho mọi trường hợp này.
T, N có M1, chủ yếu chống chảy máu, giảm triệu chứng, điều trị phối hợp xạ trị hoặc hóa trị [35]
Phẫu thuật Mohs là phương pháp hiệu quả để loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư, bằng cách cắt tổ chức ung thư theo hình lòng chảo Sau đó, bác sĩ sẽ kiểm tra 100% diện cắt ở bề mặt đáy dưới kính hiển vi để xác định vị trí còn tế bào ung thư Nếu phát hiện vùng còn tế bào ung thư, quy trình sẽ được tái thực hiện cho đến khi đạt được bề mặt không còn tế bào ung thư.
Hình 1.3 : Quy trình phẫu thuật Mohs và các lớp cắt Mohs
Phẫu thuật Mohs là lựa chọn tối ưu cho những trường hợp tái phát, với ưu điểm nổi bật là xác định rõ rìa cắt, giúp vết thương lành nhanh hơn và mang lại kết quả thẩm mỹ tốt hơn so với các phương pháp khác Mặc dù nhược điểm của phương pháp này không đáng kể, nhưng thời gian thực hiện và chi phí có thể cao hơn so với các kỹ thuật như nạo, đốt điện hay phẫu thuật đông lạnh.
Phẫu thuật viên cũng cần nhiều kỹ năng và có kiến thức căn bản về phẫu thuật tạo hình hơn
1.6.1.2 Ph ẫ u thu ậ t t ạ o hình ổ khuy ế t sau c ắ t u
Trong mọi phẫu thuật tạo hình, việc lập kế hoạch phẫu thuật bắt đầu bằng việc đánh giá tổn thương và từng lớp của ổ khuyết, bao gồm cả da che phủ và niêm mạc Các nguyên tắc quan trọng cần được thực hiện trong quá trình này để đảm bảo hiệu quả và an toàn cho ca phẫu thuật.
- Nguyên tắc phẫu thuật triệt căn.
- Nguyên tắc phẫu thuật phục hồi chức năng.
Tạo hình trong phẫu thuật đòi hỏi sự suy tính kỹ lưỡng, vì việc cắt xa thương tổn sẽ tạo ra lỗ hổng lớn hơn, gây khó khăn cho quá trình tạo hình Cụ thể, với một thương tổn có đường kính 10 mm, nếu cắt cách bờ 4 mm, sẽ hình thành khuyết tổ chức có đường kính lên đến 18 mm.
Phẫu thuật ung thư da yêu cầu phẫu thuật viên có kỹ năng chuyên môn cao để đánh giá chính xác giới hạn của khối u Phương pháp phẫu thuật này đạt hiệu quả cao với tỷ lệ điều trị khỏi lên tới 90% Trước khi tiến hành gây tê tại chỗ, việc đánh dấu bờ u và diện cắt là rất quan trọng, vì thuốc gây tê có thể làm biến dạng khối u, gây khó khăn trong việc xác định rìa Hơn nữa, giới hạn vi thể của khối u thường rộng hơn so với giới hạn quan sát được trên lâm sàng, đặc biệt đối với các tổn thương u tế bào đáy, nơi rìa diện cắt thường dao động từ 2 cm trở lên.
Kích thước u tối thiểu là 10 mm, đặc biệt đối với các u lớn, đa ổ, tái phát hoặc có mô học diễn biến mạnh Rìa diện cắt cần đạt 1 cm ở vùng mặt và 2 cm ở thân mình Đối với trường hợp u tế bào vảy, rìa diện cắt được khuyến cáo là từ 4-15 mm tính từ quầng đỏ.
Nạo vét hạch vùng đƣợc thực hiện sau khi xác định có hạch di căn [53].
Xạ trị
Khi điều trị UTTB đáy, cần chú ý đến vị trí gần mắt, niêm mạc mũi và miệng, vì những vùng này dễ bị bỏng do tia phát ra Đối với UTTB vảy, việc tổ chức u lan rộng yêu cầu điều trị bằng tia xạ nhằm giảm kích thước u và hạn chế sự xâm lấn, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho phẫu thuật.
Hóa trị liệu
Ung thư tế bào đáy thường không được điều trị bằng hóa chất, trong khi ung thư tế bào vảy ít nhạy cảm với hóa chất nên thường không được sử dụng Do đó, các tài liệu nội khoa về ung thư ít đề cập đến hóa chất điều trị ung thư da Tuy nhiên, hóa chất có thể được áp dụng như phương pháp bổ trợ trước và sau phẫu thuật Đặc biệt, trong một số trường hợp, điều trị hóa chất trước phẫu thuật được chỉ định cho ung thư da có độ ác tính mô học cao Đối với ung thư tế bào vảy kém hoặc không biệt hóa, phát triển nhanh và di căn sớm, không nên tiến hành phẫu thuật ngay lập tức.
Hóa chất có tác dụng làm thu nhỏ khối u và hạch, giúp phẫu thuật trở nên dễ dàng hơn và giảm nguy cơ lan rộng của tế bào ung thư Trong trường hợp ung thư đã lan rộng, việc điều trị nên tập trung vào hóa chất đơn thuần hoặc kết hợp với xạ trị để giảm triệu chứng và duy trì chất lượng sống cho bệnh nhân.
NGHIÊN CỨU VỀ G EN TP53 TRONG UNG THƢ DA
Cấu trúc gen TP53
Gen TP53, nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 17 (17p13), là một gen ức chế u quan trọng, mã hóa cho protein p53 có trọng lượng phân tử 53 kD Phiên bản RNA thông tin của gen này dài khoảng 3 KB và bao gồm 1179 khung đọc mở.
TP53 gồm 11 exon (từ E1 đến E11, trong đó E1 không mã hóa) và 10 intron
[57] Nó thường được tìm thấy với nồng độ cao trong các tế bào UT [58],[59]
Theo Bourdon và CS, gen TP53 có 2 vùng bắt đầu phiên mã ở exon 1, vùng cắt intron khác có thể xuất hiện ở intron 2 và giữa exon 9 và exon 10 [60]
Trong đó, vùng chức năng chính nằm ở exon 5 đến exon 8 và đây là vùng thường bị đột biến nhất trong các UT ở người [61]
Gen TP53 có chức năng khác biệt so với các gen ung thư và gen ức chế ung thư khác, tập trung vào việc kiểm tra và bảo toàn tính toàn vẹn của bộ gen thay vì chỉ điều hòa chu kỳ tế bào Khi phát hiện hư hại di truyền, gen TP53 ngăn cản tế bào phân chia trong các pha G1, S hoặc G2 của chu kỳ tế bào cho đến khi các DNA hư hại được sửa chữa Ngoài ra, TP53 còn có khả năng kích thích quá trình chết tế bào theo chương trình sau khi phát hiện tổn thương.
Hình 1.4: Cấu trúc của gen TP53 [ 62]
Gen TP53 đƣợc chọn là phân tử của năm 1993, là chìa khoá di truyền của sự phát triển UT, chia thành 3 phần chính gồmchức năng khác nhau [62]:
- Vùng hoạt hóa N tận (NH2-terminal acidic transactivation domain TA):
+ Vùng amino tận (1-42): vùng này cần thiết cho hoạt động sao chép và tương tác với MDM2 (murine double minute 2).
Vùng giàu prolin (61-94) có liên quan đến chức năng pro-apoptosis và điều hòa hoạt động của gen TP53 Việc xóa bỏ vùng này dẫn đến mất hoàn toàn chức năng pro-apoptosis của gen TP53.
- Vùng gắn kết DNA (DNA-binding domain DB) gồm acid amin từ 102-
292, gắn kết DNA có trình tựđặc biệt, là vùng trung tâm gen TP53 gắn kết DNA
- Vùng C tận (COOH-terminal oligomerization domain OD) bao gồm:
+ Vùng oligomerization (324-355) tạo cấu trúc bậc 4 của gen TP53
Vùng điều hòa nhóm carboxyl tận (363-393) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự gắn kết DNA với vùng trung tâm và liên quan đến quá trình apoptosis Nếu sự tương tác giữa vùng C tận và vùng gắn DNA bị gián đoạn, vùng gắn DNA bị tổn thương sẽ được kích hoạt, dẫn đến sự gia tăng quá trình phiên mã.
Ngoài 3 vùng chức năng điển hình, gen TP53 còn có một số vùng đặc trƣng cần thiết cho hoạt động của nó nhƣ NLS (Nuclear Localization Signals) vùng tín hiệu định vị nhân, NES (Nuclear Export Signal) vùng nhân giàu leucin [62].
Chức năng gen TP53
Gen TP53 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis Sự bất thường của gen này dẫn đến rối loạn tăng sinh tế bào, góp phần hình thành ung thư Khi cơ thể chịu tác động từ các yếu tố kích thích như tổn thương DNA, sốc điện, thiếu oxy, hoặc sự biểu hiện quá mức của gen ung thư, gen TP53 sẽ được kích hoạt Điều này gây ra sự dừng lại của chu kỳ phân bào cho đến khi DNA được sửa chữa, hoặc kích thích quá trình apoptosis nếu tổn thương DNA không thể khắc phục.
Hình 1.5: Vai trò của gen TP53 trong phân bào [63]
Gen TP53 có vai trò quan trọng trong việc dừng chu kỳ tế bào ở pha G1/S và G2/M thông qua việc điều chỉnh các gen kiểm soát phân chia tế bào như GADD 45, p21 và protein 14-3-3 Sự dừng chu kỳ này cho phép tế bào có đủ thời gian để sửa chữa tổn thương DNA trước khi tiến vào giai đoạn tổng hợp DNA và nguyên phân.
The cell cycle progresses through the S phase with the enzyme cdk2 and the M phase with cdc2 Both cdk2 and cdc2 can be inhibited by the protein p21, as well as by GADD45 and 14-3-3δ for cdc2 In response to DNA damage, the TP53 gene activates the transcription of p21, which has two binding regions with p53: p21-WAF1 (wild type of p53 activate fragment 1) and p21-CIP1 (cyclin-dependent kinase interacting protein 1).
Protein p21 - CIP và p21 - WAF 1 đóng vai trò quan trọng trong việc bất hoạt các phức hợp cyclinE-CDK2 và cyclinD1-CDK4 Khi các phức hợp CDK này bị bất hoạt, chúng không còn khả năng phốt pho hóa protein pRB (retinoblastoma), dẫn đến việc pRB không bị phốt pho hóa và ở trạng thái kích hoạt, gắn vào E2F E2F, một yếu tố phiên mã kích thích gen cyclin E, sẽ kích hoạt các gen như myc và mybB, tham gia vào quá trình nhân đôi DNA trong pha S Sự hình thành phức hợp pRB-E2F ngăn cản chu trình tế bào chuyển từ pha G1 sang pha S, do đó, chu trình phân bào bị dừng lại ở pha G1 cho đến khi DNA được sửa chữa.
Hình 1.6 : Cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào của gen TP53 qua trung gian p21 [66]
Cơ chế bệnh sinh ung thƣ da
Nghiên cứu cho thấy bức xạ tia cực tím là nguyên nhân chính gây ra ung thư da, qua việc gây đột biến DNA của gen TP53 Dưới tác động của tia cực tím, DNA trong một số tế bào bị thay đổi, nhưng thường thì sự thay đổi này được sửa chữa nhờ gen TP53, giúp ngăn chặn sự hình thành ung thư da Gen TP53 đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và sửa chữa sai sót trong quá trình nhân đôi DNA, ngăn chặn tế bào phân chia không kiểm soát và kích thích quá trình apoptosis Tuy nhiên, khi tiếp xúc với tia cực tím kéo dài, gen TP53 có thể bị đột biến, dẫn đến mất chức năng sửa chữa và không kích hoạt apoptosis ở các tế bào bị tổn thương Ở những bệnh nhân có gen TP53 không hoạt động, tỷ lệ mắc ung thư da là 50% ở tuổi 30 và 90% ở tuổi 70.
Hình 1.7: Cơ chế tác động của tia UV làm biến đổi DNA [59]
Gen TP53 có vai trò quan trọng trong việc hạn chế đột biến tế bào thông qua tác động lên chu kỳ tế bào Khi nhận tín hiệu từ các receptor trên bề mặt tế bào, gen này giúp điều chỉnh thời gian dừng chu kỳ tế bào để sửa chữa tổn thương DNA do các yếu tố vật lý và hóa học Việc dừng ở giai đoạn G1 ngăn chặn tái sao chép DNA bị tổn thương, trong khi dừng ở G2 bảo vệ tế bào khỏi việc duy trì các nhiễm sắc thể hư hại Gen TP53 cũng tham gia vào quá trình sửa chữa bằng cách tăng cường sao mã các protein sửa chữa DNA Nếu tổn thương DNA được khắc phục, tế bào sẽ tiếp tục chu trình của mình Tuy nhiên, nếu cơ chế sửa chữa bị sai lệch, gen TP53 sẽ ngăn chặn phân chia tế bào đột biến và kích hoạt quá trình chết theo chương trình.
Khi gen TP53 bị thiếu hoặc biến đổi, hiện tượng chết theo chương trình ở tế bào giảm, dẫn đến việc tế bào có đột biến không chết và tiếp tục phân bào Điều này duy trì sự tồn tại của các tế bào có đột biến, và khi tích lũy đủ đột biến, chúng sẽ hình thành các tế bào ung thư Đặc biệt, nếu cả hai alen của gen TP53 từ bố và mẹ đều bị tổn thương, sự ức chế tế bào chết theo chương trình diễn ra dễ dàng hơn, khiến tế bào không chết mà tiếp tục gia tăng phân bào.
Hình 1.8: Chu kỳ tế bào: M: các giai đoạn phân bào; G1, S, G2 là các pha của giai đoạn gian kỳ (interphage) [ 59]
Các đột biến trong gen TP53 dẫn đến việc sản phẩm protein mất chức năng nhưng lại trở nên bền vững hơn, gây tích tụ với nồng độ cao trong nhân tế bào Trong ung thư da, các đột biến chủ yếu là đột biến điểm xảy ra trong các exon 5 đến 8, đặc biệt tại các vị trí codon 175 và 177.
Các loại thương tổn, đột biến hay mất chức năng của gen TP53:
Hoạt tính gen TP53 biểu lộ bằng sự có mặt phân tử của gen TP53 trong dịch sinh học Các thương tổn gen TP53 có thể gặp:
+ Đột biến điểm: do chuyển đổi vị trí pyrimidin này bằng pyrimidin khác, hoặc cặp pyrimidin này bằng cặp pyrimidin khác.
Đột biến mất đoạn xảy ra khi các vùng trên nhiễm sắc thể bị mất, dẫn đến việc bất hoạt gen TP53 Một ví dụ điển hình là hiện tượng mất tính dị hợp tử (LOH) do mất đoạn nhiễm sắc thể chứa gen TP53 ở một trong hai nhiễm sắc thể, gây ra mất một trong hai alen của tế bào Tuy nhiên, tần suất mất tính dị hợp tử trong ung thư tế bào đáy (UTTB) thấp hơn so với các loại ung thư khác.
Vai trò của gen TP53 trong cơ chế bệnh sinh UTTB da:
Quá trình apoptosis là một hiện tượng quan trọng trong sự sống của cơ thể đa bào, đóng vai trò thiết yếu trong phát triển phôi và duy trì hằng định nội môi ở cơ thể trưởng thành Nó giúp cân bằng giữa tái sinh, tăng sinh và chết, đặc biệt ở các tổ chức thường xuyên đổi mới như hệ thống miễn dịch Apoptosis được điều khiển và kiểm soát bởi nhiều gen khác nhau, cho thấy sự phức tạp của quá trình này.
Các kích thích từ bên ngoài như hormon, thuốc điều trị và tia cực tím kích hoạt chemokine, dẫn đến việc kích hoạt receptor APO-1 và Fas (CD95) Tín hiệu này tương tác với một loại protein tại domain gây chết (death domain - DD hoặc dead effector domain - DED), kích hoạt chuỗi protease phân rã cystein gọi là caspase Các caspase này phân hủy nhiều protein cấu trúc tế bào, protein kiểm soát chu kỳ tế bào (pRb), enzym sửa chữa DNA, và protein RNA thông tin trưởng thành, dẫn đến sự chết tế bào.
Protein p53 là yếu tố kích thích nội sinh quan trọng, xuất hiện khi có tổn thương DNA như gãy đơn (SSB) hoặc gãy kép (DSB), cũng như khi tái sao gen sai lệch P53 kích hoạt chương trình apoptosis một cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các sản phẩm của gen bcl-2 và bax Bên cạnh đó, SSB và DSB còn giải phóng các loại topoisomerase I và II, đóng vai trò như "trạm gác khu vực" của bộ gen trong cả tế bào bình thường và ác tính.
Các topoisomerase đóng vai trò quan trọng trong việc tách đôi sợi xoắn kép của DNA để phục vụ cho quá trình sao chép và sửa chữa tổn thương DNA Topoisomerase týp I làm gãy một sợi DNA, trong khi týp II làm gãy hai sợi, điều này rất cần thiết cho sự phân bào Khi thiếu hụt topoisomerase, đặc biệt là týp II, các nhiễm sắc thể không thể phân ly, dẫn đến tế bào không thể phân bào và dễ bị chết, đặc biệt khi có sự tác động của kháng sinh và thuốc gây độc tế bào.
Sự hằng định nội môi được duy trì nhờ sự cân bằng giữa số lượng tế bào mới tái sinh và số tế bào già chết Tế bào chết có thể do sự suy giảm telomere, làm giảm khả năng bảo vệ tính toàn vẹn của DNA trong quá trình tái sao Ngoài ra, tế bào cũng có thể chết do thiếu oxy, nhiệt độ không phù hợp, oxy hóa, hoặc do tác động của tia cực tím gây ra tổn thương DNA nghiêm trọng vượt quá khả năng sửa chữa của tế bào.
Phương pháp phát hiện đột biến gen TP53
1.7.4.1 Hóa mô mi ễ n d ị ch p53 v ới ung thư da
Hiện nay, kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD) với các kháng thể đơn dòng để phát hiện các protein bất thường trong nhân tế bào
Protein p53, được phát hiện lần đầu vào năm 1979 bởi Lionel Crawford và nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Princeton, Dundee, Vương quốc Anh, là một protein quan trọng trong cơ thể người Protein này bao gồm 393 acid amin và có khối lượng phân tử 53 kD p53 có nhiều biến đổi sau dịch mã như phosphoryl hóa, acetyl hóa và neddy hóa, đóng vai trò thiết yếu trong các quá trình sinh học.
Đột biến gen TP53 dẫn đến sự hình thành các protein bất thường với thời gian bán huỷ gia tăng, do thay đổi trong cấu trúc ba chiều của protein Điều này cho thấy protein p53 đóng vai trò quan trọng trong việc xác định yếu tố nguy cơ và tiên lượng trong ung thư da.
Các phương pháp phát hiện protein đột biến bao gồm nhuộm HMMD và giải trình tự gen Protein p53 đột biến tích lũy trong nhân tế bào và có thể được phát hiện qua kỹ thuật HMMD Xét nghiệm bộc lộ protein p53 bằng HMMD là phương pháp đơn giản và chính xác để xác định sự tích lũy bất thường của protein này Trong tế bào bất thường, protein p53 thường tập trung trong nhân tế bào, dẫn đến việc nhuộm HMMD cho thấy sự bắt màu đặc trưng, trái ngược với tế bào bình thường có biểu hiện protein p53 thấp Các đặc điểm của sự bộc lộ protein p53 bao gồm: (1) biểu hiện vượt mức; (2) tích lũy trong nhân tế bào; (3) không có đột biến hoặc biến đổi cấu trúc tại vị trí epitop Với 80% các đột biến nhầm nghĩa tạo ra protein p53 đột biến tích lũy trong nhân, phương pháp này được coi là đáng tin cậy Tuy nhiên, các đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung không tạo ra protein tích lũy trong nhân, khiến các kháng thể không thể gắn vào epitop của các protein đột biến.
1.7.4.2 K ỹ thu ậ t sinh h ọ c phân t ử PCR và realtime PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp tổng hợp gen đặc hiệu trong ống nghiệm, được phát minh bởi nhà hóa sinh Karry Mullis vào năm 1985 Kỹ thuật này sử dụng 2 mồi oligonucleotide để gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích, kết hợp với sự tham gia của enzyme DNA polymerase, cho phép tổng hợp một đoạn DNA đặc thù.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn, cho phép khuếch đại một trình tự đích DNA ban đầu thành hàng triệu bản sao nhờ enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu Các primer, là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với mạch của đoạn DNA khuôn, giúp kéo dài và hình thành mạch mới Đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại đến mức có thể quan sát được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide, từ đó có thể thu nhận và sử dụng cho các mục đích nghiên cứu gen khác nhau.
Realtime PCR là phương pháp khuếch đại gen, bao gồm hai quá trình chính: nhân bản DNA qua phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tương ứng với lượng DNA tạo ra Phương pháp này mang lại nhiều ưu điểm như cho kết quả nhanh chóng, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và xác định lượng DNA tại từng thời điểm mà không cần điện di Điều này giúp xử lý nhiều mẫu cùng lúc, giảm thiểu tạp nhiễm và nâng cao độ nhạy Realtime PCR được phát triển dựa trên Taq DNA polymerase, được công bố bởi Holand và cộng sự vào năm 1991.
So với PCR truyền thống, Realtime PCR có ƣu điểm:
- Kiểm soát lƣợng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết đƣợc sản phẩm PCR tại từng thời điểm của quá trình khuếch đại.
Độ đặc hiệu của Realtime PCR vượt trội hơn so với PCR truyền thống nhờ vào việc sử dụng các mẫu dò đặc hiệu, giúp phát hiện chính xác các sản phẩm khuếch đại.
1.7.4.3 G iải trình t gen (DNA sequencing)
Giải trình tự gen là kỹ thuật xác định thứ tự các nucleotide trong DNA Đoạn DNA được giải trình tự sẽ được sử dụng làm mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR), bắt đầu từ vị trí gắn mồi.
Hỗn hợp deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ thích hợp, giúp các dideoxynucleotid gắn vào các vị trí mà deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang tổng hợp Sự gắn kết này sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài DNA, tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau.
Nucleotide tận cùng trên mỗi sợi DNA có thể được xác định thông qua bốn phản ứng riêng biệt, mỗi phản ứng sử dụng một loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Ngoài ra, cũng có thể sử dụng một phản ứng hỗn hợp với các dideoxynucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau.
Kết quả thu được là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn, được phân tách bằng điện di trên thạch acrylamide có độ phân giải cao Phương pháp này cho phép phân biệt các sợi đơn DNA có sự khác biệt chỉ 1 nucleotide Trình tự các nucleotide được xác định tương ứng với vị trí của các vạch trên gel, liên quan đến từng loại dideoxynucleotide.
Máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn sử dụng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu bốn loại ddNTP, trong khi hệ thống điện di thường áp dụng phương pháp điện di mao quản.
Khi một vạch điện di xuất hiện, phân tử ddNTP ở đầu 3’ của đoạn DNA phát ra màu huỳnh quang đặc trưng Máy sẽ ghi nhận màu sắc này và truyền dữ liệu về máy tính để phân tích Dựa vào màu huỳnh quang, máy có thể xác định từng loại nucleotide và trình tự của DNA mục tiêu.
Trình tự gen đƣợc đối chiếu và so sánh với trình tự gen trên GeneBank (National Center for Biotechnology Information - NCBI)
Kỹ thuật giải trình tự DNA đích đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu để xác định các loại đột biến như mất nucleotide, thay thế nucleotide và thêm nucleotide trên gene Đặc biệt, vì phần lớn các đột biến ở gene TP53 là đột biến điểm, phương pháp giải trình tự gene TP53 vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đột biến liên quan đến bệnh.
Hình 1.10 : Hình ảnh giải trình t gen trên máy giải trình t gen t động (Nguồn Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội)
NGHIÊN CỨ U V Ề KI- 67 TRONG UNG THƢ DA
V ai trò và chức năng trong cơ chế bệnh sinh liên quan đến Ki -67
Ki-67 có mối liên hệ chặt chẽ với sự tăng sinh tế bào, đặc biệt là chỉ số phân bào và mức độ biệt hóa của khối u Bệnh nhân ung thư có thời gian sống thêm ngắn thường có tỷ lệ bộc lộ Ki-67 cao Biểu hiện Ki-67 dương tính mạnh là yếu tố nguy cơ cho khả năng tái phát cao và tiên lượng xấu Tuy nhiên, việc định lượng sự tăng sinh tế bào qua đếm số lượng nhân chia là một thách thức và thường cho kết quả khác nhau giữa các nhà giải phẫu bệnh.
Khối u với mức bộc lộ Ki-67 cao có xu hướng tiến triển nhanh và làm tăng nguy cơ tái phát ở bệnh nhân ung thư da, cho thấy tầm quan trọng của nó trong việc đánh giá tiên lượng của nhiều loại u Mặc dù một số nghiên cứu đã chỉ ra giá trị tiên lượng của sự bộc lộ Ki-67 trong ung thư tế bào đáy, nhưng kết quả vẫn còn khác nhau.
1.8.2 Phương pháp phát hiện và một số nghiên cứu liên quan đến Ki-67
Sự biến mất ở pha nghỉ G0 của Ki-67 cho phép ước lượng đoạn tăng sinh sau khi đếm một số lượng nhỏ tế bào qua pha S và G2 Các phương pháp đo lường như thymidine đánh dấu bằng hydro phóng xạ và deoxyuridine cần thiết nhưng phức tạp, bao gồm cả đếm tế bào dòng chảy Phương pháp HMMD là kỹ thuật phổ biến nhất để phát hiện Ki-67, dựa vào việc phát hiện protein nhân liên quan đến sao chép DNA HMMD thuận lợi hơn so với đếm dòng chảy vì nó cho phép đánh giá tỷ lệ tế bào tăng sinh cùng lúc với hình thái mô u.
Ph ƣơng pháp phát hiện và một số nghiên cứu liên quan đến Ki -67
Lu S và các cộng sự đã xác định mối quan hệ chặt chẽ giữa các chỉ số tăng sinh tế bào và HMMD Ki-67 Trong điều kiện bình thường, protein Ki-67 chủ yếu nằm trong hạch nhân, nhưng trong quá trình nguyên phân, nó gắn liền với mặt của chất nhiễm sắc và các nhiễm sắc thể Sau khi phân bào, Ki-67 nằm trong nguyên sinh chất trước khi quay trở lại hạch nhân Mức bộc lộ Ki-67 qua HMMD được coi là chỉ số quan trọng trong báo cáo mô bệnh học Chỉ số tăng sinh Ki-67 được thể hiện qua tỷ lệ bắt màu của các tế bào khối u, và tỷ lệ này có sự khác biệt giữa các thể u cũng như giữa các cá thể trong từng thể u Biểu hiện Ki-67 được sử dụng như một công cụ chẩn đoán và tiên lượng bệnh trong một số loại ung thư.
UT Healy và các CS đã nghiên cứu mối tương quan giữa chỉ số tăng sinh Ki-
Nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ tái phát của ung thư tế bào đáy (UTTB) có liên quan đến chỉ số tăng sinh Ki-67, với các khối u có chỉ số Ki-67 cao có nguy cơ tái phát cao hơn so với các khối u có chỉ số Ki-67 thấp Tuy nhiên, không có mối tương quan nào được phát hiện giữa hình thái lâm sàng của UTTB với biểu hiện Ki-67 Chuprov (2008) đã xác định mối quan hệ có ý nghĩa thống kê giữa chỉ số tăng sinh Ki-67 và thể xâm nhập của UTTB.
Các nghiên cứu gần đây về Ki-67 tập trung vào việc xác định mối liên quan giữa mức độ tăng sinh của Ki-67 ở ung thư tế bào đáy và ung thư tế bào vảy trên da với các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học, kích thước khối u và vị trí giải phẫu Mục tiêu của những nghiên cứu này là cung cấp thông tin hữu ích cho việc chẩn đoán và tiên lượng, từ đó nâng cao hiệu quả trong quá trình điều trị.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu gồm 71 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán xác định là UTTB đáy và UTTB vảy tại Bệnh viện K từ tháng 3/2012 đến tháng 3/2014.
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
Bệnh nhân mắc bệnh ung thư da vùng đầu mặt cổ với tổn thương tiên phát chưa được phẫu thuật, đã được chẩn đoán xác định là ung thư tế bào đáy hoặc ung thư tế bào vảy từ các bệnh phẩm sau khi điều trị phẫu thuật tại Bệnh viện K.
-Khối nến còn được lưu trữ và đủ bệnh phẩm để cắt lại tiêu bản, nhuộm HMMD và giải trình tự gen.
- Bệnh nhân không thỏa mãn bất kỳ tiêu chuẩn lựa chọn trên.
- Bệnh nhân có 2 loại UT, đã được điều trị trước đó.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Cỡ mẫu: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu ngẫu nhiên:
Hệ số tin cậy ở mức xác suất 95% được xác định bởi giá trị 1,96 Tỷ lệ dương tính p53 khi nhuộm HMMD ở ung thư da không hắc tố được chọn là p=0,76, dựa trên kết quả nghiên cứu năm 2015 của Rasoul Sai số tuyệt đối chấp nhận trong nghiên cứu là d=0,1.
Chúng tôi đã tuyển chọn 71 bệnh nhân, bao gồm 51 bệnh nhân được chẩn đoán mắc ung thư tế bào đáy và 20 bệnh nhân mắc ung thư tế bào vảy, tất cả đều đáp ứng các tiêu chuẩn nghiên cứu.
Nghiên cứu đã thu thập tất cả các mẫu để thực hiện xét nghiệm HMMD, sau đó lựa chọn 51 bệnh nhân để tiến hành xét nghiệm giải trình tự gen TP53 nhằm đánh giá tình trạng đột biến Địa điểm nghiên cứu được xác định rõ ràng.
- Khoa Ngoại Đầu cổ - Bệnh viện K để thu thập thông tin về đặc điểm lâm sàng và mô bệnh học của UT da
- Khoa Giải phẫu bệnh- Tế bào, Phòng Sinh học phân tử Bệnh viện K là nơi xét nghiệm Giải phẫu bệnh, HMMD và giải trình tự gen TP53
2.2.3 Kỹ thuật thu thập số liệu
- Phỏng vấn bệnh nhân nhằm thu nhập các thông tin cá nhân, tiền sử, khám lâm sàng, đánh giá giai đoạn bệnh.
Đánh giá mức độ xâm lấn của khối u tế bào da được thực hiện trên 71 bệnh nhân, qua việc phẫu tích trực tiếp bệnh phẩm Thống kê được tiến hành theo mẫu thống nhất nhằm ghi nhận đầy đủ các thông tin cần thiết cho nghiên cứu.
- Hóa mô miễn dịch: xác định kháng nguyên p53, Ki-67
- Tình trạng đột biến gen TP53: lựa chọn 51 bệnh nhân làm xét nghiệm giải trình tự gen TP53 (PCR), xác định tỷ lệ đột biến.
Nghiên cứu sử dụng tƣ liệu trong hồ sơ bệnh án, thu nhập thông tin theo mẫu in sẵn, trình tự theo các bước sau:
- Bộ câu hỏi phỏng vấn: bao gồm phần thông tin hành chính, đặc trƣng cá nhân và các yếu tố liên quan của UTTB đáy và UTTB vảy
- Bệnh án, phiếu xét nghiệm mô bệnh học và các xét nghiệm khác.
Bài viết này đề cập đến 71 mẫu mô của hai loại ung thư da (UTTB đáy và UTTB vảy) được cố định bằng formal và vùi trong paraffin (mẫu mô FFPE) Các mẫu mô này được lưu trữ và bảo quản cẩn thận, sau đó tiến hành phân tích đột biến gen tại phòng Sinh học phân tử thuộc Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K.
- Tuổi và giới tính, nghề nghiệp.
- Tiền sử bệnh, thời gian phát hiện bệnh.
- Triệu chứng lâm sàng, điều trị trước khi đến bệnh viện, số lần phẫu thuật, kết quả mô bệnh học.
- Vị trí và tính chất u: vị trí u, kích thước u tính theo cm đường kính lớn nhất, chia thành các nhóm có kích thước < 1 cm; 1-2 cm; 2-4 cm và > 4 cm
- Hình thái lâm sàng: thu nhập các thông tin về mật độ, màu sắc u, bề mặt u, ranh giới, sự thâm nhiễm u, tính chất u sùi loét, thâm nhiễm…
- Tiền sử bệnh nhân: đã đƣợc chẩn đoán hay không có tiền sử UTTB đáy và UTTB vảy.
- Mức độ xâm lấn các cơ quan hoặc các tổ chức khác.
- Di căn hạch: có hay không di căn, các vị trí hạch di căn.
- Phân loại TNM, xếp giai đoạn bệnh theo NCCN
- Ghi nhận các phương pháp đã được áp dụng cho bệnh nhân tại bệnh viện K: thông tin về chẩn đoán, phương pháp điều trị.
- Các rìa diện cắt đƣợc xác định và đánh giá xâm lấn qua xét nghiệm MBH
+ Hướng: - Dựa vào mặt phẳng giải phẫu: 12h phía trên, 6h phía dưới.
- Dựa vào vị trí giải phẫu: Đánh dấu vị trí giải phẫu nhƣ cách mũi, bờ môi, bờ mi mắt, vùng trước tai.
- Cách đánh dấu có thể bằng chỉ buộc sau khi cắt bệnh phẩm: đánh dấu chỉ buộc (vị trí 6h: chỉ < 2 cm; 12h chỉ > 3 cm)
Đánh dấu bệnh phẩm là bước quan trọng trước phẫu thuật, sử dụng bút màu để đánh dấu đường cắt dự kiến cho khối u Các màu sắc như xanh, đen và đỏ được sử dụng để dễ dàng xác định vị trí giải phẫu của khối u.
+ Phòng xét nghiệm pha bệnh phẩm:
Xử lý bệnh phẩm bao gồm việc cắt ngang khối u để xác định mô lành và mô ung thư, chia thành hai phần: phần cắt lấy u đến rìa u và phần đại diện viền cắt u tại bốn rìa da và đáy u Các hướng cắt bao gồm trên, dưới, phải, trái và đáy u, tổng cộng có năm khu lấy mẫu bệnh phẩm đại diện cho diện cắt quanh u Sử dụng thước đo để tính khoảng cách theo milimet, cắt từng rìa da được đánh dấu theo các hướng thành từng mảnh kích thước 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm và > 5 mm Các vị trí cắt được đánh số: 12h là số 1, bên phải là số 2, 6h là số 3, bên trái là số 4, và đáy u là số 5 (ghi mẫu bệnh phẩm theo số: 1x1mm; 1x2mm…) Thực hiện các diện cắt theo quy chuẩn MBH.
Kiểm tra mẫu diện cắt rìa da trên kính hiển vi là bước quan trọng trong việc đọc kết quả giải phẫu bệnh Các bác sĩ tại khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K sẽ phân tích từng lát cắt từ diện cắt u ở các mẫu thử đại diện để xác định mức độ xâm lấn vi thể.
Nghiên cứu sẽ đánh giá diện cắt có tế bào UT xa rìa u nhất đƣợc coi là diện cắt dương tính xa nhất.
Bệnh nhân K, nam 83 tuổi- Mẫu bệnh phẩm UT da má sau phẫu tích
Hình 2.1 : Mô tả phẫu tích bệnh phẩm UT da nghiên cứu mức xâm lấ n
12h (mã số 1 trên tiêu bản)
6 h (mã số 3 trên tiêu bản)
Cắt ngang bệnh phẩm xác định rìa u Đánh dấu bệnh phẩm: theo các vị trí
Các bệnh phẩm sau khi phẫu tích đƣợc cố định trong dung dịch formol 10% đệm trung tính từ 6 giờ đến 48 giờ;
Thể tích formol gấp 10 - 15 lần thể tích mô;
Thời gian cố định: 6 - 48 giờ;
Với bệnh phẩm có kích thước < 3 mm, thời gian cố định 4-8 giờ.
Chuyển bệnh phẩm là quá trình tạo ra những mẫu bệnh phẩm dễ dàng cắt và bảo quản lâu dài, đảm bảo rằng màu sắc không ảnh hưởng đến hình thái và cấu trúc của tế bào cũng như mô.
Phương tiện, hóa chất: Tủ paraffin: 56-58 độ C, Paraffin tinh khiết, Cồn
- Paraffin (III): 10 giờ + Bệnh phẩm sau đó đƣợc đúc trong paraffin.
- Dùng khuôn kim loại đặt trên mặt phẳng rót paraffin nóng chảy vào khuôn.
- Đặt bệnh phẩm vào khuôn theo mặt phẳng đúng yêu cầu (đặt sát mặt đáy, đúng chiều).
- Gắn casset nhựa lên trên
- Để nguội bệnh phẩm và giỡ khuôn, đặt vào bàn lạnh.
+ Cắt, nhuộm hematoxylin-eosin, đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang học, chẩn đoán phân loại mô học do các bác sĩ giải phẫu bệnh.
- Hình thái nốt hoặc nốt loét.
Phân độ biệt hoá theo 4 độ: Năm 1920 Broders tìm ra một phương pháp dễ nhớ để đánh giá khả năng phát triển của UT theo 4 độ ác tính [55]:
- Độ 1: > 75% các tế bào biệt hoá;
- Độ 2: 50%-75% các tế bào biệt hoá;
- Độ 3: 25-50% các tế bào biệt hoá;
- Độ 4: < 25% các tế bào biệt hoá.
2.2.4.4 Đánh giá s bi ể u hi ệ n c ủ a protein p53 và Ki-67
* Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE):
- Sau khi cắt, bệnh phẩm đƣợc cố định ngay vào dung dịchBouin 24 giờ.
- Bệnh phẩm đƣợc chuyển, đúc trong Paraffin.
- Các khối nến đƣợc cắt có độ dày từ 3-5 mm
- Tẩy nến tiêu bản 2 lần trong toluen, 10 phút/lần.
- Chuyển tiêu bản vào cồn 100°, cồn 95°, cồn 80° trong 2 phút mỗi bể.
- Nhuộm nhân trong dung dịch hematoxylin từ 2-5 phút
Để đảm bảo chất lượng nhuộm, hãy rửa mẫu dưới nước chảy ít nhất 5 phút Kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định mức độ nhuộm của nhân; nếu màu sắc nhạt, tiến hành nhuộm thêm Ngược lại, nếu màu quá sẫm, hãy biệt hóa bằng cồn axit và tiếp tục rửa dưới nước chảy trong 5 phút.
- Làm xanh bằng dung dịch natri bicarbonat bão hòa trong 1 phút.
- Nhuộm bào tương trong eosin từ 1-3 phút
- Loại phẩm thừa trong cồn 90° trong vài giây.
- Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, làm “trong” bằng toluen, gắn baume. Đánh giá kết quả:
Các tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi quang học với nhiều độ phóng đại khác nhau Việc phân loại dựa trên tiêu chí phân loại UTTB đáy và UTTB vảy theo hướng dẫn của WHO.
* Xét nghiệm hóa mô miễn dịch:
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng kháng thể đơn dòng gắn Biotin để nhận diện các phân tử kháng nguyên Sau đó, phức hợp kháng nguyên-kháng thể được phát hiện thông qua kỹ thuật stropa, kết hợp với việc sử dụng PO kháng Biotin Cuối cùng, sự phát hiện được thể hiện bằng màu DAB.
Hình 2.2: Máy BENCH MARK XT hiệu VENTANA
Phương pháp nhuộm: Nhuộm HMMD theo phương pháp phức hợp Avidin Biotin tiêu chuẩn (Standard Avidin Biotin Complex Method).
Bảng 2.1 Các dấu ẩn miễn dịch dùng trong nhuộm HMMD Dấu ấn miễn dịch Dòng (clone) Công ty sản xuất Độ pha loãng p53 DO-7 Dako 1/100
Kỹ thuật HMMD đƣợc thực hiện trên mô đúc khối nến.
Quy trình nhuộm HMMD bằng máy nhuộm tự động nhƣ sau:
+ Chuẩn bị tiờu bản: cắt mỏng mẫu mụ 3-5 àm rồi đặt vào khay đựng tiêu bản mang điện tích dương.
+ Khởi động máy vi tính, máy nhuộm HMMD tự động;
+ Chạy chương trình cho máy chung đã cài đặt sẵn trong máy;
+ Cài đặt chương trình xử lý và quy trình nhuộm HMMD cho máy;
+ Chọn kháng thể thứ nhất để nhuộm;
+ Khử paraffin bằng dung dịch Ezpred (hóa chất chuyên dụng cho máy);
+ Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC1 ở 95 0 C, thời gian 30 phút;
+ Phủ kháng thể trên mô với từng loại và tỷ lệ kháng thể thích hợp;
+ Hiển thị màu bằng bộ kít DAB;
+ Sau khi kết thúc quy trình nhuộm, lấy tiêu bản ra và rửa bằng dung dịch xà phòng để loại bỏ lớp dầu LCS phủ trên tiêu bản;
+ Nhuộm nhân bằng hematoxyclin, dán la men;
+ Đọc và phân tích kết quả trên kính hiển vi quang học:
Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm:
- Kiểm chứng dương: Sử dụng tiêu bản đã chắc chắn là dương tính p53, Ki-67 làm chứng dương.
Kiểm chứng âm là bước quan trọng trong quy trình nhuộm tiêu bản, yêu cầu không phủ kháng thể thứ nhất vào tiêu bản cho tất cả các trường hợp Để đọc kết quả, cần đánh giá mức độ biểu hiện của protein p53 và Ki-67 theo tiêu chuẩn của Izumi và CS (2008), trong đó mức độ âm tính được xác định khi có dưới 10% tế bào u bắt màu.
Dương tính (1+): Từ 10% - 50% tế bào u bắt màu;
Dương tính (2+): Từ 51% - 80% tế bào u bắt màu;
Dương tính (3+): > 80% tế bào u bắt màu
2.2.4.5 Đánh giá độ t bi ế n gen TP53
* Xét nghiệm giải trình tự gen TP53 :
Mẫu nghiên cứu được thu thập từ bệnh phẩm đúc paraffin (FFPE) và được bảo quản ở nhiệt độ phòng, kèm theo mã số bệnh nhân theo quy định của khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào.
Quy trình giải trình tự gen từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin:
- Các mẫu mô parafin (FFPE) đƣợc thu thập và bảo quản ở nhiệt độ phòng
- Các mẫu mô tươi của UT da, sau khi được sinh thiết được bảo quản trong dung dịch TE, để nhiệt độ -80°C
- Mỗi mẫu sẽ đƣợc đánh mã số nghiên cứu.
Các exon có tần suất đột biến cao, đặc biệt là exon 5-8 trong vùng trung tâm hoạt động của gen TP53, đã được khuếch đại thông qua phản ứng PCR Những biến đổi trên phân tử DNA được xác định bằng phương pháp giải trình tự Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự gen TP53 đã được công bố trên ngân hàng gen (Genbank U94788.1) bằng phần mềm thiết kế mồi Primer Trình tự các cặp mồi này nhằm khuếch đại đoạn gen cụ thể.
TP53 từ exon 5 đến exon 8 đƣợc trình bày trong bảng:
Bảng 2.2: Trình tự mồi Mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước sản phẩm Exon 5 F: GCCGTGTTCCAGTTGCTTTA
Cách thức tiến hành: a Chuẩn bị tiêu bản
-Cắt 10 tiờu bản bệnh phẩm dày 10 àm, 1 tiờu bản nhuộm HE
-Khoanh vùng tế bào u ở tiêu bản HE, chọn vùng chứa > 70% tế bào u
- Đánh dấu vùng tế bào u trên các tiêu bản còn lại b Tách chiết DNA sử dụng bộ kit Kappa Express Extract
+ Chu ẩ n b ị dung d ị ch tách chi ế t:
-Kappa express extract buffer: 10 àl
-Kappa express extract enzyme: 2 àl
-Sử dụng lƣỡi dao mỗ cạo lấy phần đã đƣợc đánh dấu trên tiêu bản với diện tích khoảng 2 mm 2
-Chuyển bệnh phẩm vào ống eppendorf chứa buffer đã chuẩn bị sẵn
- Votex đều và ly tâm
- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 75 0 C trong 15 phút, 95 0 C trong 5 phút
-Votex nhẹ trong 2-3 giây, ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút
-Dùng pipet hút phần dịch chứa DNA ở phía trên và chuyển ống mới
- Đo nồng độ DNA bằng máy đo Bio Drop:
Cân bằng (blank) máy đo bằng 2 ml TE hoặc H 2 O
Lau khô về mặt cảm ứng bằng giấy không bụi
Đo nồng độ 2 àl DNA: kết quả hiển thị trờn mỏy với 2 thụng số là nồng độ DNA và chỉ số tinh sạch 260/280 nm
-Bảo quản dung dịch chứa DNA ở -20 độ C, dung dịch chứa DNA đƣợc sử dụng cho phản ứng khuếch đại gen quan tâm
+ Phản ứng PCR với bộ kít KAPA2G Robust HotStart ReadyMix và kiểm tra kết quả
Hình 2.3 : Máy tách mẫu LabGard Class II, Biological Safet y Cabinets
-Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen TP53 đƣợc trình bày ở bảng:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (ul)
-Chu trình nhiệt: Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên hệ thống Veriti®
96-Well Fast Thermal Cycler Chu trình nhiệt của phản ứng PCR qua bảng:
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước N hiệt độ (độ C) Thời gian Số chu kỳ
Kéo dài cuối cùng 72 1-10 phút 1
-Kiểm tra kết quả PCR
XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Các bệnh nhân đều đƣợc đăng ký thông tin vào các cơ sở dữ liệu mã hóa tại bệnh án nghiên cứu.
- Xử lý các dữ liệu bằng phần mềm Epidata 3.1 và SPSS 16.0
- Các biến số nghiên cứu đƣợc tính toán và trình bày bằng các bảng hoặc biểu đồ.
- Số liệu được trình bày dưới dạng số lượng và tỷ lệ.
- Mối liên quan giữa các biến số đƣợc tính toán bằng thuật toán kiểm định giả thuyết 2
- Các test thống kê đƣợc kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi MBH
UTTB đáy UTTB vảy Tổng số p n % n % n %
Nhóm tuổi trên 70 chiếm tỷ lệ cao nhất với 43,7%, theo sau là nhóm 60-69 với 25,4%, trong khi nhóm dưới 40 chỉ chiếm 1,4% Tuổi trung bình của các đối tượng là 66,4 Không có sự khác biệt thống kê về độ tuổi giữa UTTB đáy và UTTB vảy (p>0,05), và tuổi trung bình giữa hai nhóm cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa (p>0,05).
Biểu đồ 3.1: Phân bố bệnh nhân theo giới
Nhận xét: Bảng trên cho thấy, nữ chiếm tỷ lệ 54,9%; nam chiếm tỷ lệ 45,1%
3.1.2 Tỷ lệ của UTTB đáy và UTTB vảy
Bảng 3.2:Tỷ lệ UTTB đáy và UTTB vảy
Mô bệnh học n Tỷ lệ %
Nhận xét: Vùng da đầu cổ, tỷ lệ UTTB đáy là 71,8%, cao hơn UTTB vảy là 28,2%.
Bảng 3.3: Phân bố theo vị trítổn thương
UTTB đáy UTTB vảy p n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %
UTTB đáy thường xuất hiện tại vùng quanh mắt, chiếm tỷ lệ 27,5%, trong khi UTTB vảy phổ biến ở mũi với tỷ lệ 25% Kết quả kiểm định Khi bình phương cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa vị trí của UTTB đáy và UTTB vảy (χ² = 6,06; p = 0,034).
Bảng 3.4: Phân bố kích thước u
Kích thước u UTTB đáy UTTB vảy n % n % p
U kích thước nhỏ hơn 1 cm có tỷ lệ ở UTTB đáy (11,8%) cao hơn UTTB vảy (10%) Đối với U có kích thước lớn hơn 4 cm, chỉ ghi nhận 2 trường hợp ở UTTB đáy và không có trường hợp nào ở UTTB vảy Kích thước trung bình của UTTB đáy là 2,21 cm, lớn hơn so với UTTB vảy (2,09 cm), tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 3.5: Phân bố theo tính chất u
Tính chất u UTTB đáy UTTB vảy n % n %
Biểu hiện lâm sàng của u tế bào đáy chủ yếu là sùi loét với tỷ lệ 80,4%, ranh giới rõ 70,61%, thâm nhiễm 33,3% và chảy dịch, máu 13,7% Đối với u tế bào vảy, các tỷ lệ tương ứng là 75% cho sùi loét, 50% cho ranh giới rõ, 30% cho thâm nhiễm và 15% cho chảy dịch, máu.
ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC
Biểu đồ 3.2: Hình thái học của UTTB đáy
Nhận xét: UTTB đáy gặp nhiều nhất ở thể nốt/loét: 39 BN chiếm 76,5%
Thể nông chỉ có1 trường hợp chiếm 2%.
3.2.2 Phân độ mô học UTTB vảy
Biểu đồ 3.3: Độ mô học của UTTB vảy
Nhận xét: UTTB vảy gặp nhiều ở độ I và II với tỷ lệ 80% Độ III ít gặp hơn, có 4 bệnh nhân chiếm 20%, không có bệnh nhân nào ở độ IV.
BN Nguyễn Văn T - UTTB đáy
BN Triệu Văn H - UTTB đáy
BN Ngô Thị T - UTTB vảy
BN Lê Thị B - UTTB vảy
Hình 3.1: Tiêu bản n huộm H.E x 400 lần ở UTTB đáy và UTTB vảy
ĐÁNH GIÁ MỨC XÂM LẤN CỦA UT DA
Bảng 3.6: Khoảng cách tới rìa u
UTTB đáy UTTB vảy p n Tỷ lệ % n Tỷ lệ %
Mức xâm lấn cách rìa u 4-5 mm ở hai loại ung thư tế bào biểu mô (UTTB) chiếm tỷ lệ cao nhất, với 68,6% ở UTTB đáy và 50% ở UTTB vảy Sự so sánh mức xâm lấn giữa hai loại UTTB cho thấy chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi mức cách mép u lớn hơn 10 mm (p