B� GIÁO D�C VÀ �ÀO T�O VI�N HÀN LÂM KHOA H�C VÀ CÔNG NGH� VI�T NAM H�C VI�N KHOA H�C VÀ CÔNG NGH� H� MINH NH�T NGHIÊN C�U T�NG H�P H� NANO DENDRIMER POLY(AMIDOAMINE) MANG THU�C CH�NG UNG TH� (CARBOPLA[.]
B GIÁO D C VÀ ÀO T O VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM H C VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH - H MINH NH T NGHIÊN C U T NG H P H NANO DENDRIMER POLY(AMIDOAMINE) MANG THU C CH NG UNG TH (CARBOPLATIN VÀ OXALIPLATIN) LU N ÁN TI N S KHOA H C V T LI U THÀNH PH H CHÍ MINH – 2021 B GIÁO D C VÀ ÀO T O VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM H C VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH - H MINH NH T NGHIÊN C U T NG H P H NANO DENDRIMER POLY(AMIDOAMINE) MANG THU C CH NG UNG TH (CARBOPLATIN VÀ OXALIPLATIN) Chuyên ngành: V t li u cao phân t t h p Mã s : 9440125 LU N ÁN TI N S KHOA H C V T LI U NG IH NG D N KHOA H C: GS TS NGUY N C U KHOA PGS TS NGUY N NG C VINH Thành ph H Chí Minh – 2021 i L I CAM OAN Cơng trình c th c hi n t i Vi n Khoa h c V t li u ng d ng − Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam Tơi xin cam oan ây cơng trình nghiên c u c a cs h ng d n khoa h c c a GS TS Nguy n C u Khoa PGS.TS Nguy n Ng c Vinh Các n i dung nghiên c u, k t qu tài trung th c, c hoàn thành d a k t qu nghiên c u c a k t qu c a nghiên c u ch a c dùng cho b t c lu n v n c p khác Tác gi lu n án H Minh Nh t ii L IC M L i N u tiên, xin bày t lòng bi t n sâu s c t i GS.TS Nguy n C u Khoa PGS.TS Nguy n Ng c Vinh, nh ng ng t n tình nh ng nh h i Th y ã dành cho s ng viên giúp ng khoa h c hi u qu su t trình th c hi n lu n án Tôi xin g i l i c m n n H c Vi n Khoa h c Công ngh Khoa ã t o i u ki n cho su t trình h c t p, nghiên c u hồn thành lu n án Tôi xin c m n s giúp khích l c a Anh Ch , B n Vi n Khoa h c V t li u ng d ng – Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam Sau cùng, xin c m n th c s không th quên th y cô, b n bè, anh em xa g n s c s giúp t n tình c a ng viên, t o i u ki n c a nh ng ng i thân gia ình su t trình tơi hồn thành lu n án Thành ph H Chí Minh, tháng 10 n m 2020 Tác gi H Minh Nh t iii M CL C Trang Trang ph bìa L i cam oan i L ic m n ii M cl c iii Danh m c ký hi u ch vi t t t viii Danh m c b ng xi Danh m c hình v th xii M U 1 tv n M c tiêu Ý ngh a khoa h c c a lu n án óng góp m i c a lu n án CH NG T NG QUAN 1.1 T ng quan v b nh ung th ph ng pháp tr li u b ng hóa tr 1.2 Thu c ch ng ung th d ng ph c platin 1.2.1 Carboplatin 1.2.2 Oxaliplatin 1.3 H ch t mang nano - dendrimer PAMAM 1.3.1 Gi i thi u h phân ph i thu c h ng ích th ng 1.3.2 C ch t ng tính th m hi u qu l u tr EPR 10 1.3.3 Dendrimer PAMAM 10 1.3.4 M t s y u t 1.3.5 Các ph nh h ng n tính ch t c a dendrimer 12 ng pháp t ng h p dendrimer 14 1.3.6 Bi n tính dendrimer PAMAM v i PEG 16 1.4 Tình hình nghiên c u 17 1.4.1 Tình hình nghiên c u th gi i 17 1.4.1.1 H dendrimer PAMAM bi n tính v i PEG 17 iv 1.4.1.2 Các h mang thu c khác (hydrogel, micelle, liposom, nanogel, ng nano cacbon) 21 1.4.2 Tình hình nghiên c u n 22 CH NG PH 2.1 Ph c NG PHÁP NGHIÊN C U VÀ TH C NGHI M ng pháp nghiên c u 2.1.1 Ph 26 26 ng pháp t ng h p dendrimer PAMAM 26 2.1.1.1 Ph n ng alkyl hóa (ph n ng Michael) 26 2.1.1.2 Ph n ng amid hóa 27 2.1.2 Ph 28 ng pháp bi n tính dendrimer PAMAM b ng PEG 2.1.2.1 Ph ng pháp bi n tính PAMAM th h ch n b ng mPEG-NPC 28 2.1.2.2 Ph ng pháp bi n tính PAMAM th h l b ng mPEG-NH2 29 2.1.3 Ph ng pháp nang hóa 30 2.1.4 Ph ng pháp phóng thích thu c 31 2.1.5 Ph ng pháp kh o sát t ng h p sinh h c dòng t bào L929 c dòng t bào ung th (ung th vú MCF-7, ung th ph i A549 ung th t cung Hela) 2.1.6 Ph 31 ng pháp xác 2.1.6.1 Ph c ng h 2.1.6.2 Ph kh i l nh c u trúc s n ph m ng t h t nhân (1H-NMR) ng (MS) 31 31 32 2.1.6.3 Ph t ngo i – kh ki n (UV-Vis) 32 2.1.6.4 Ph h ng ngo i (FT-IR) 32 2.1.6.5 Kính hi n vi i n t truy n qua (TEM) 32 2.1.6.6 Tán x ánh sáng ng (DLS) th zeta 33 2.1.7 Ph ng pháp xác nh gi m kh i l 33 2.1.8 Ph ng pháp xác nh hàm l 2.1.9 D c ng làm khô ng metanol t n d ng h c q trình gi i phóng thu c 33 34 2.2 Hóa ch t thi t b , d ng c nghiên c u 35 2.2.1 Hóa ch t 35 2.2.2 Thi t b , d ng c nghiên c u 36 2.3 T ng h p dendrimer PAMAM 36 2.3.1 T ng h p PAMAM G-0.5 t lõi etylene diamin 37 v 2.3.2 T ng h p PAMAM G0.0 37 2.3.3 T ng h p PAMAM G0.5 38 2.3.4 T ng h p PAMAM G1.0 38 2.3.5 T ng h p PAMAM G1.5 38 2.3.6 T ng h p PAMAM G2.0 39 2.3.7 T ng h p PAMAM G2.5 40 2.3.8 T ng h p PAMAM G3.0 40 2.3.9 T ng h p PAMAM G3.5 41 2.3.10 T ng h p PAMAM G4.0 41 2.4 Bi n tính dendrimer PAMAM v i PEG 42 2.4.1 T ng h p mPEG-NPC 42 2.4.2 T ng h p G3.0-PEG 42 2.4.2.1 L u tr dendrimer chu n b dung d ch PAMAM G3.0 42 2.4.2.2 T ng h p G3.0-PEG 43 2.4.3 T ng h p mPEG-NH2 44 2.4.4 T ng h p G3.5-PEG 45 2.4.4.1 L u tr Dendrimer PAMAM G3.5 d ng r n chu n b dung d ch 45 2.4.4.2 T ng h p G3.5-PEG 45 2.4.5 T ng h p G4.0-PEG 46 2.5 Nang hóa thu c oxaliplatin cacboplatin b ng PAMAM-PEG 48 2.6 Phóng thích thu c ch m 48 2.7 Kh o sát t ng h p sinh h c c t bào c a h ch t mang thu c 2.7.1 Pha thu c 2.7.1.1 Kh o sát 48 t ng h p sinh h c dòng t bào L929 2.7.1.2 Kh o sát c dòng t bào ung th 2.7.2 Nuôi c y t bào 2.7.3 Th nghi m 48 48 49 49 c 50 2.7.4 Nhu m màu t bào s ng/ch t (live/dead stain) 50 2.8 50 ng chu n nh l ng cacboplatin oxaliplatin b ng HPLC vi CH NG K T QU VÀ TH O LU N 51 3.1 T ng h p PAMAM dendrimer n th h G4.0 51 3.1.1 T ng h p PAMAM dendrimer n th h G2.5 51 3.1.1.1 Ph c ng h 3.1.1.2 Ph kh i l ng t h t nhân (1H-NMR) ng (MS) 51 52 3.1.2 T ng h p PAMAM dendrimer th h G3.0, G3.5 G4.0 54 3.1.2.1 Ph t ngo i – kh ki n (UV-Vis), ph h ng ngo i (FT-IR) ph c ng h ng t h t nhân ( 1H-NMR) 54 3.1.2.2 Tính tốn kh i l ng phân t PAMAM b ng 1H-NMR 56 3.1.2.3 Hình thái PAMAM 57 3.1.2.4 Th zeta 59 3.1.3 Hi u su t ph n ng t ng h p PAMAM dendrimer 59 3.2 Bi n tính PAMAM dendrimer b ng PEG 60 3.2.1 Ph t ngo i – kh ki n (UV-Vis) 61 3.2.2 Ph h ng ngo i (FT-IR) 61 3.2.3 Ph c ng h ng t h t nhân (1H-NMR) 63 3.2.4 Hình thái PAMAM bi n tính PEG 66 3.2.5 Th zeta 69 3.3 Kh o sát nang hóa 70 3.3.1 ng chu n nh l ng carboplatin oxaliplatin b ng HPLC 70 3.3.2 K t qu nang hóa thu c carboplatin v i PAMAM-PEG 72 3.3.2.1 Ph FT-IR 73 3.3.2.2 nh TEM 74 3.3.2.3 Th zeta 75 3.3.3 K t qu nang hóa thu c oxaliplatin v i PAMAM-PEG 75 3.3.3.1 Ph FT-IR 77 3.3.3.2 nh TEM 78 3.3.3.3 Th zeta 79 3.4 Kh o sát phóng thích thu c Carboplatin Oxaliplatin 80 3.4.1 Kh o sát phóng thích thu c Carboplatin 80 vii 3.4.2 Kh o sát phóng thích thu c Oxaliplatin 81 3.4.3 D 83 ốn mơ hình d c 3.5 Kh o sát t 3.6 Kh o sát c tính t bào ng h c h PAMAM-PEG mang thu c platin ng h p sinh h c v i t bào s i chu t L929 86 89 3.6.1 Dòng t bào ung th t cung HeLa 89 3.6.2 Dòng t bào ung th ph i A549 93 3.6.3 Dòng t bào ung th vú MCF-7 97 3.6.4 T ng h p chung k t qu 99 c tính t bào ung th K T LU N VÀ KI N NGH DANH M C CÁC CƠNG TRÌNH TÀI LI U THAM KH O 101 Ã CÔNG B 103 105 viii DANH M C KÝ HI U VÀ CH VI T T T 5-FU : 5-fluorouracil, thu c i u tr ung th A549 : Dòng t bào ung th ph i ADP : Adenosine diphosphat ATP : Adenosine triphosphat BDA : Butylen diamin CAR : Carboplatin CM : Ch t mang DCC : Ch t ho t hóa dicyclohexyl cacbodiimid DLC : Drug loading content, Kh n ng mang thu c c a ch t mang DLE : Drug loading efficiency, Hi u su t nang hóa DLS : Dynamic Light Scattering, Tán x ánh sáng DLVO : Mơ hình lý thuy t c a DLVO (theo tên nhà khoa h c Derjaguin, ng Landau, Verwey Overbeek) DMEM : Môi tr ng Dulbecco's modified Eagle's medium DMSO : Dimethyl sulfoxide DNA : Deoxyribonucleic acid DOPE : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin DOT : (–)- -d-(2r, 4r)-dioxolanethymine DOX : Doxorubicin, thu c i u tr ung th DPBS : Phosphate-buffered saline, N EB : Ethidium bromide EDA : Ethylene diamin EDC : 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EPR : Enhanced Permeability and Retention Effect, C ch t ng tính th m c mu i t ng hi u qu l u gi FA : Folic axit FBS : Fetal bovine serum, Huy t bò m photphat Ph FT-IR c a G3.5-PEG@OXA - 71 - Ph FT-IR c a G4.0-PEG@OXA - 72 - - 73 Ph l c Hình thái kích th Gi n Gi n Gi n c h t: tán x ánh sáng ng DLS th zeta th zeta c a PAMAM G3.0-PEG th zeta c a PAMAM G3.5-PEG th zeta c a PAMAM G4.0-PEG - 74 - Bi u phân b kích th c h t c a PAMAM G3.5 – PEG PAMAM G3.5 Bi u phân b kích th c h t c a PAMAM G4.0 – PEG PAMAM G4.0 Gi n th zeta c a G3.0-PEG(CAR) - 75 - Gi n th zeta c a G3.5-PEG(CAR) Gi n th zeta c a G4.0-PEG(CAR) Gi n th zeta c a G3.0-PEG(OXA) - 76 - Gi n th zeta c a G3.5-PEG(OXA) Gi n th zeta c a G4.0-PEG(OXA) - 77 - K t qu o kích th c PAMAM dendrimer G3.0-PEG s d ng DLS - 78 - K t qu o kích th c PAMAM dendrimer G3.5-PEG s d ng DLS - 79 - K t qu o kích th c PAMAM dendrimer G4.0-PEG s d ng DLS - 80 Ph l c Kh o sát B ng hình nh k t qu o t t ng h p sinh h c ng h p sinh h c c a PAMAM,PAMAM-PEG - 81 B ng hình nh k t qu o c dòng t bào ung th t cung HeLa c a PAMAM-PEG mang thu c carboplatin oxaliplatin 10 g/ml 25 g/ml 50 g/ml 75 g/ml 100 g/ml Carboplatin G3.0PEG@CAR G3.5PEG@CAR G4.0PEG@CAR Oxaliplatin G3.0PEG@OXA G3.5PEG@OXA G4.0PEG@OXA - 82 B ng hình nh k t qu o c dòng t bào ung th ph i A549 c a PAMAM-PEG mang thu c carboplatin oxaliplatin 10 g/ml 25 g/ml 50 g/ml 75 g/ml 100 g/ml Bocartin G3.0PEG@CAR G3.5PEG@CAR G4.0PEG@CAR Lyoxatin G3.0PEG@OXA G3.5PEG@OXA G4.0PEG@OXA - 83 B ng hình nh k t qu o c dòng t bào ung th vú MCF-7 c a PAMAM-PEG mang thu c carboplatin oxaliplatin 10 g/ml 25 g/ml 50 g/ml 75 g/ml 100 g/ml Bocartin G3.0PEG@CAR G3.5PEG@CAR G4.0PEG@CAR Lyoxatin G3.0PEG@OXA G3.5PEG@OXA G4.0PEG@OXA G1.5 PAMAM G1.0 PAMAM G0.5 PAMAM 0.0 PAMAM G G-0.5 PAMAM T ng h p 20 g G1.0 PAMAM 20g G0.5 PAMAM 20 g G 0.0 PAMAM 20 g G-0.5 PAMAM s d ng PAMAM Th h 90 130 45 35 150 (ml) (ml) 20 MA EDA 245 290 235 330 170 (ml) metanol môi Dung (ngày) ph n ng Th i gian ng pháp tinh ch Cô quay chân không k t h p b sung Metanol Hút m t hút chân không Cô quay chân không s d ng toluene:Metanol (9:1) lôi kéo EDA, sau ó dùng Metanol lo i b toluene Cơ quay chân không k t h p b sung Metanol Hút m t hút chân không Cô quay chân không s d ng toluene:Metanol (9:1) lôi kéo EDA, sau ó dùng Metanol lo i b toluene Cô quay chân khơng k t h p b sung Metanol Ph Tóm t t quy trình t ng h p dendrimer G4.0 t EDA 84 G4.0 PAMAM G3.5 PAMAM G3.0 PAMAM G2.5 PAMAM G2.0 PAMAM T ng h p 30 g G3.5 PAMAM 30 g G3.0 PAMAM 30 g G2.5 PAMAM 40 g G2.0 PAMAM 30 g G1.5 PAMAM s d ng PAMAM Th h 100 110 0 50 75 (ml) (ml) 120 MA EDA (400) Metanol (350) Metanol (410) Metanol 475 420 (ml) metanol môi Dung (ngày) ph n ng Th i gian Ph ng pháp tinh ch Cô quay chân không s d ng toluene:Metanol (9:1) lơi kéo EDA, sau ó dùng Metanol lo i b toluene Ti p n th m tách b ng màng 6-8 kDa Metanol Cô quay u i Metanol Cô quay chân không k t h p b sung Metanol Sau ó th m tách b ng màng 6-8 kDa Metanol Cô quay u i Metanol Cô quay chân không s d ng toluene:Metanol (9:1) lơi kéo EDA, sau ó dùng Metanol lo i b toluene Ti p n th m tách b ng mànG3.500 Da Metanol Cô quay u i Metanol Cô quay chân không k t h p b sung Metanol Cô quay chân không s d ng toluene:Metanol (9:1) lôi kéo EDA, sau ó dùng Metanol lo i b toluene 85