Mồi Trình tự 5’-3’ Kích thƣớc sản phẩm Exon 5 F: GCCGTGTTCCAGTTGCTTTA R: ATAAGATGCTGAGGAGGGGC 368 Exon 6 F: ACAAGCAGTCACAGCACATG R: ACAACCACCCTTAACCCCTC 318 Exon 7 F: AGGAAGGAGAATGGCGTGAA R: GAAATCGGTAAGAGGTGGGC 390 Exon 8 F: GGACCTCTTAACCTGTGGCT R: GCTTCTTGTCCTGCTTGCTT 333 Cách thức tiến hành: a. Chuẩn bị tiêu bản
-Cắt 10 tiêu bản bệnh phẩm dày 10 µm, 1 tiêu bản nhuộm HE.
-Khoanh vùng tế bào u ở tiêu bản HE, chọn vùng chứa > 70% tế bào u. - Đánh dấu vùng tế bào u trên các tiêu bản còn lại.
b. Tách chiết DNA sử dụng bộ kit Kappa Express Extract
+ Chuẩn bị dung dịch tách chiết:
-Kappa express extract buffer: 10 µl -Kappa express extract enzyme: 2 µl - Nƣớc tinh khiết: 88 µl
+ Lấy mẫu và thu DNA:
-Sử dụng lƣỡi dao mỗ cạo lấy phần đã đƣợc đánh dấu trên tiêu bản với diện tích khoảng 2 mm2.
-Chuyển bệnh phẩm vào ống eppendorf chứa buffer đã chuẩn bị sẵn. - Votex đều và ly tâm.
-Votex nhẹ trong 2-3 giây, ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút.
-Dùng pipet hút phần dịch chứa DNA ở phía trên và chuyển ống mới. - Đo nồng độ DNA bằng máy đo Bio Drop:
Chọn chếđộđo Ds DNA.
Cân bằng (blank) máy đo bằng 2 ml TE hoặc H2O.
Lau khô về mặt cảm ứng bằng giấy không bụi.
Đo nồng độ 2 µl DNA: kết quả hiển thị trên máy với 2 thông số là nồng độ DNA và chỉ số tinh sạch 260/280 nm.
-Bảo quản dung dịch chứa DNA ở -20 độ C, dung dịch chứa DNA đƣợc sử dụng cho phản ứng khuếch đại gen quan tâm.
+ Phản ứng PCR với bộ kít KAPA2G Robust HotStart ReadyMix và kiểm tra kết quả.
-Thành phần phản ứng: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen TP53 đƣợc trình bày ở bảng: