Bước Nhiệt độ (độ C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chung 95 1-3 phút 1
Biến tính 95 10-15 giây
30-45
Gắn mồi 55-65 10-15 giây
Kéo dài chuỗi 72 10-15 giây
Kéo dài cuối cùng 72 1-10 phút 1
Làm mát 4-10 --- 1
-Kiểm tra kết quả PCR
+ Kiểm tra kết quả PCR bằng chạy điện di trên gel Agarose 1% hoặc trên gel Polyacrylamide 5% (nồng độ Gel phụ thuộc kích thƣớc đoạn DNA đƣợc nhân lên. Đoạn trình tự khuếch đại có kích thƣớc càng ngắn thì nồng độ gel càng cao). Các bƣớc tiến hành điện di Agarose:
Cân 0,5 g Agarose hịa tan trong 50 ml TAE.
Đun sơi 2-3 phút trong lị vi sóng.
Thêm 5 µl dung dịch gel Red.
Viết sơ đồ các mẫu DNA điện di.
Đặt khay điện di vào hốđiện di.
Lấy 10 µl DNA trộn với 2 ml Bromphenol blue.
Nhỏ dung dịch đã trộn vào giếng theo sơ đồ.
Điện di với hiệu điện thế 100V trong 40 phút. + Chụp ảnh gel xác định kích thƣớc DNA.
Hình 2.4: Hệ thống UPV chụp ảnh gel, xác định kích thước DNA
+ Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng bộ Kit DNA clear & concentrator – 5 (Zymo research):
Chuẩn bị cột tinh sạch.
Trộn sản phẩm PCR với dung dịch găn (binding buffer), tỷ lệ 1:5.
Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch.
Ly tâm 14.000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ phần dung dịch.
Thêm 200 µl dung dịch rửa, li tâm thêm 14.000 vòng trong 30 giây (lặp lại 2 lần).
Đặt cột tinh sạch vào 1 ống nghiệm 1,5 ml mới.
Thêm 20 µl dung dịch đẩy (elution buffer).
Li tâm 14.000 vòng trong 30 giây.
+ Sản phẩm PCR đặc hiệu của một đoạn DNA sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với các nucleotide gắn mầu huỳnh quang (BigDye Terminator kit) có thể đƣợc nhận dạng bởi máy giải trình tự.
- Phản ứng PCR giải trình tự
+ Sản phẩm PCR khuếch đại trình tự DNA exon từ 5 đến 8 của gen TP53
sau khi đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với các dNTP dánh dấu huỳnh quang. Các dNTP mang các màu khác nhau sẽ đƣợc phát hiện nhờ một thiết bị Laser trong quá trình giải trình tự.
+ Xác định nồng độ DNA khuôn sau khi tinh sạch sản phẩm PCR. + Pha loãng sản phẩm về nồng độ chuẩn 10 ng/µl.
+ Tiến hành PCR với thành phần phản ứng: