Dấu ấn miễn dịch Dịng (clone) Cơng ty sản xuất Độ pha loãng
p53 DO-7 Dako 1/100
Ki-67 MIB- 1 Dako 1/50
Kỹ thuật HMMD đƣợc thực hiện trên mơ đúc khối nến. Quy trình nhuộm HMMD bằng máy nhuộm tự động nhƣ sau:
+ Chuẩn bị tiêu bản: cắt mỏng mẫu mơ 3-5 µm rồi đặt vào khay đựng tiêu bản mang điện tích dƣơng.
+ Khởi động máy vi tính, máy nhuộm HMMD tự động;
+ Chạy chƣơng trình cho máy chung đã cài đặt sẵn trong máy; + Cài đặt chƣơng trình xử lý và quy trình nhuộm HMMD cho máy; + Chọn kháng thể thứ nhất để nhuộm;
+ Khử paraffin bằng dung dịch Ezpred (hóa chất chuyên dụng cho máy); + Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC1 ở 950C, thời gian 30 phút; + Phủ kháng thể trên mô với từng loại và tỷ lệ kháng thể thích hợp; + Hiển thị màu bằng bộ kít DAB;
+ Sau khi kết thúc quy trình nhuộm, lấy tiêu bản ra và rửa bằng dung dịch xà phòng để loại bỏ lớp dầu LCS phủ trên tiêu bản;
+ Nhuộm nhân bằng hematoxyclin, dán la men;
+ Đọc và phân tích kết quả trên kính hiển vi quang học:
Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm:
- Kiểm chứng dƣơng: Sử dụng tiêu bản đã chắc chắn là dƣơng tính p53, Ki-67 làm chứng dƣơng.
- Kiểm chứng âm: Không phủ kháng thể thứ nhất vào tiêu bản đối với tất cả các trƣờng hợp nhuộm tiêu bản chứng âm.
Đọc kết quả: Đánh giá mức độ biểu hiện của protein p53, Ki-67 dựa theo đánh giá tiêu chuẩn của Izumi và CS (2008) [93]:
Âm tính: < 10 % tế bào u bắt màu;
Dƣơng tính (1+): Từ 10% - 50% tế bào u bắt màu; Dƣơng tính (2+): Từ 51% - 80% tế bào u bắt màu; Dƣơng tính (3+): > 80% tế bào u bắt màu.
2.2.4.5. Đánh giá đột biến gen TP53
* Xét nghiệm giải trình tự gen TP53:
- Thu thập và bảo quản mẫu nghiên cứu: từ bệnh phẩm đúc paraffin (FFPE) đƣợc thu thập và bảo quản ở nhiệt độ phịng, có mã số bệnh nhân theo qui định khoa Giải phẫu bệnh –Tế bào.
Quy trình giải trình tự gen từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin:
- Các mẫu mô parafin (FFPE) đƣợc thu thập và bảo quản ở nhiệt độ phịng. - Các mẫu mơ tƣơi của UT da, sau khi đƣợc sinh thiết đƣợc bảo quản trong dung dịch TE, để nhiệt độ -80°C.
- Mỗi mẫu sẽ đƣợc đánh mã số nghiên cứu.
Các Exon có tần suất đột biến cao (Exon 5-8 thuộc vùng trung tâm hoạt động của gen TP53) đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và xác định những biến đổi trên phân tử DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp giải trình tự. Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen TP53
đƣợc công bố trên ngân hàng gen (Genbank U94788.1) sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer. Trình tự các cặp mồi đƣợc thiết kế khuếch đại đoạn gen