Thành phần Thể tích (µl)
BigDye Terminator Mix 4
5x sequencing buffer 2
Mồi F (hoặc R) 4umol/ul 1
DNA mẫu ~ 1 µl (10 ng)
Nƣớc 12
-Tinh sạch sản phẩm và chạy giải trình tự:
Sản phẩm PCR sau khi chạy Bigdye đƣợc tinh sạch với bộ kit ZR Sequencing Clear-up kit với các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
+ Cho thêm 240µl dung dịch Binding Buffer vào 5-20 µl sản phẩm PCR. + Chuyển hỗn hợp qua cột tinh sạch.
+ Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng trong 30 giây. + Thêm vào cột 300 µl dung dịch rửa.
+ Thêm 10-50 µl nƣớc hoặc Hidi-formamide vào cột. + Chuyển cột qua ống Effpendoft mới.
+ Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ 30 giây, đƣợc sản phẩm tinh sạch. + Lấy 10 µl sản phẩm tinh sạch biến tính ở 950C trong 5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh 1 phút.
+ Chuyển sản phẩm tinh sạch qua đĩa chuyên dụng cho máy giải trình tự. + Chạy giải trình tự và so sánh kết quả mẫu DNA chuẩn của GeneBank.
Bảng 2.6: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: Bƣớc Nhiệt độ(độ C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chung 95 3 phút 1
Biến tính 95 30 giây
25
gắn mồi 55 1 phút
Kéo dài chuỗi 72 4 phút
Làm mát 4-10 --- 1
+ Xác định trình tự gen TP53 đƣợc thực hiện trên máy ABI PRISM Genetic Analyzer. Các thông số, chất lƣợng đƣợc thu thập, kiểm tra bằng phần mềm ABI Data Collection v2.0 và Sequencing Sotfware v5.3. Trình tự gen TP53 của mẫu UT đƣợc so sánh với trình tự tham chiếu cơng bố trên GenBank qua sử dụng phần mềm BioEdit để xác định đột biến.
2.3. XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Các bệnh nhân đều đƣợc đăng ký thông tin vào các cơ sở dữ liệu mã hóa tại bệnh án nghiên cứu.
- Xử lý các dữ liệu bằng phần mềm Epidata 3.1 và SPSS 16.0.
- Các biến số nghiên cứu đƣợc tính tốn và trình bày bằng các bảng hoặc biểu đồ.
- Số liệu đƣợc trình bày dƣới dạng số lƣợng và tỷ lệ.
- Mối liên quan giữa các biến số đƣợc tính tốn bằng thuật tốn kiểm định giả thuyết 2.
- Các test thống kê đƣợc kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.
2.4. KHÍA CẠNH ĐẠO ĐỨC CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu đƣợc sự chấp nhận của Hội đồng chấm đề cƣơng nghiên cứu sinh của Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
- Ngƣời bệnh đƣợc tƣ vấn đầy đủ, đồng ý khi tham gia nghiên cứu.
- Kết quả nghiên cứu chỉ nhằm nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân và đƣợc phục vụ cho công tác điều trị cũng nhƣ áp dụng kết quả trong nghiên cứu, đánh giá bệnh và các phƣơng pháp phịng ngừa bệnh UT da.
- Các thơng tin của ngƣời bệnh tham gia nghiên cứu đƣợc giữ bảo mật, đƣợc mã hóa trên máy vi tính trong q trình xử lý số liệu.
SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Bệnh nhân UTTB đáy và UTTB vảy vùng
đầu mặt cổ tại Bệnh viện K
Phẫu tích diện cắt Nhuộm HMMD
Đánh giá mức xâm lấn
Đánh giá tình trạng đột biến gen
TP53. Mức độ bộc lộ p53, Ki-67 Bộc lộ P53, Ki67 Giải trình tự gen TP53
Phân tích kết quả, bàn luận về mức xâm lấn UT da. Đánh giá mức độ bộc lộ p53,Ki-67 và tình trạng
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu 71 trƣờng hợp UTTB đáy và UTTB vảy đƣợc khám lâm sàng, điều trị phẫu thuật, xét nghiệm MBH, xác định mức xâm lấn, HMMD với p53 và Ki-67, có 51 bệnh nhân đƣợclàm xét nghiệm giải trình tự xác định tình trạng đột biến gen TP53. Chúng tơi thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG
3.1.1. Tuổi và giới tính