T ỔNG QUAN
Ung thư vú
1.1.1 Khái ni ệ m và t ỷ l ệ m ắ cb ệ nh ung thư vú
Ung thư vú có hai loại chính: ung thư biểu mô tuyến sữa, phát sinh từ ống dẫn sữa, và ung thư biểu mô tiểu thùy, xuất phát từ tiểu thùy Các dạng ung thư vú này có sự khác biệt về trạng thái, mức độ ác tính, tính chất di truyền và tỷ lệ sống sót, tất cả đều phụ thuộc vào những yếu tố này.
Tỷ lệ ung thư vú tăng theo độ tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), nhưng gia tăng nhanh chóng sau đó, đạt khoảng 6,5% ở độ tuổi 30-40 Theo AJCC, tỷ lệ mắc bệnh theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-34 lên 200/100.000 dân ở độ tuổi 45-49 Nguy cơ mắc ung thư vú chậm tăng ở độ tuổi 45-50, cho thấy sự liên quan mật thiết với nội tiết Tại Việt Nam, ung thư vú bắt đầu gia tăng nhanh ở tuổi 35 và đạt tỷ lệ cao nhất trước và sau mãn kinh (45-).
Tỷ lệ mắc ung thư vú ở phụ nữ tăng nhanh chóng, đặc biệt ở độ tuổi 54 trở lên, nhưng sau đó có xu hướng giảm Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh gia tăng, tỷ lệ tử vong do ung thư vú vẫn ổn định ở một số nước phát triển nhờ vào những tiến bộ trong sàng lọc và điều trị Đáng chú ý, tỷ lệ mắc ung thư vú đã tăng gấp đôi so với những năm 50 của thế kỷ XX tại các quốc gia có nền công nghiệp phát triển mạnh như Nhật Bản và Singapore.
Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ung thư vú ở Việt Nam có thể được lý giải bởi những thay đổi trong lối sống, sự phát triển kinh tế và số lượng phụ nữ tham gia vào lĩnh vực công nghiệp ngày càng tăng Theo thống kê tại Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, tỷ lệ mắc ung thư vú năm 2000 ước tính là 17,4/100.000 dân, đứng đầu trong các loại ung thư ở phụ nữ Khác với các nước phương Tây, ung thư vú ở Việt Nam bắt đầu gia tăng nhanh chóng từ độ tuổi 35, đạt tỷ lệ cao nhất ở độ tuổi 45-54, trước và sau mãn kinh, sau đó có xu hướng giảm rõ rệt.
Năm 2004, tỷ lệ mắc ung thư vú theo tuổi ở Hà Nội là 29,7/100.000 dân, trong khi tại Thành phố Hồ Chí Minh và Cần Thơ là 19,4/100.000 dân, Hải Phòng là 10,5/100.000 dân, Thái Nguyên là 11,6/100.000 dân và Huế là 12,2/100.000 dân Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ Việt Nam và cũng đứng đầu trong số các loại ung thư ở phụ nữ trên toàn thế giới.
1.1.2 Ti ế n tri ển và các giai đoạn ung thư vú 1.1.2.1.Tiến triển ung thư vú
Ung thư vú có biểu hiện lâm sàng đa dạng và kéo dài giữa các bệnh nhân Hầu hết các trường hợp ung thư vú xâm lấn bắt nguồn từ tế bào biểu mô của thùy hoặc ống dẫn của tuyến vú, với tốc độ nhân lên khoảng 60 ngày một chu kỳ Thời gian từ khi tế bào chuyển biến ác tính đến khi phát hiện khối u 1cm có thể kéo dài vài năm Chỉ một số ít bệnh nhân (< 3%) có triệu chứng và tiến triển nhanh, dẫn đến tử vong trong vài tháng Tuy nhiên, ung thư vú có khả năng chữa khỏi cao nếu được chẩn đoán trong giai đoạn tiền lâm sàng, khi chưa có triệu chứng rõ ràng Nghiên cứu của Green Wood và Bloom cho thấy thời gian sống thêm trung bình từ khi chẩn đoán ở những trường hợp ung thư vú không điều trị.
31 tháng, tỷ lệ sống thêm 3 năm là 40% và 5 năm là 18-20%, có 4% sống thêm 10 năm[dẫn theo 5]
Khối u nguyên phát ở tuyến vú bắt nguồn từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, sau đó phát triển và xâm lấn sang mô lân cận, gây đẩy lùi tổ chức tuyến vú bình thường Khối u có xu hướng xâm nhập vào các cấu trúc xung quanh như da, dẫn đến hiện tượng co rút, sần da cam, phù nề, đỏ và loét da Khi khối u xâm lấn đến cơ ngực và thành ngực, nó sẽ hình thành một khối cứng.
Giai đoạn lan tr àn:
Ung thư vú thường lan rộng qua hệ thống bạch huyết, với hạch nách là vị trí phổ biến nhất do đây là nơi chính dẫn lưu dịch bạch huyết từ vú Sau đó, bệnh có thể di chuyển đến hạch thượng đòn và vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, nơi mà mạch máu liên sườn kết nối trực tiếp với vú.
Ung thư vú có khả năng di căn qua đường máu đến nhiều bộ phận trong cơ thể, nhưng thường tập trung vào xương, phổi, gan và não.
Khoảng 20-30% các bệnh nhân có hạch nách âm tính nhưng có di căn xa chứng tỏ di căn theo đường máu là chủ yếu ở các bệnh nhân này Đôi khi sự lan tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh mạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi
Tế bào ung thư vú có khả năng di căn sớm, và thường tại thời điểm chẩn đoán, các di căn này không thể được phát hiện bằng các phương pháp hiện có Do đó, việc điều trị toàn thân trở nên quan trọng ngay từ giai đoạn đầu của bệnh.
1.1.2.2 Các giai đoạn của ung thư vú
* H ệ thống xếp giai đoạn TNM
Hệ thống xếp giai đoạn của AJCC (2004) hiện đang được áp dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu, bao gồm cả các nghiên cứu đa quốc gia.
Tis(ung thư BM tại chỗ): ung thưbiểu mô nội ống, ung thư biểu mô thùy tại chỗ, bệnh Paget núm vú không có u
T 1 U có đường kính lớn nhất ≤2cm
T2 U có đường kính lớn nhất > 2cm và ≤5cm
T3 U có đường kính lớn nhất > 5cm
T4 U xâm lấn thành ngực hoặc da bất kể kích thước (thành ngực gồm xương sườn, cơgian sườn, cơ răng cưa trước, không tính cơ ngực)
N0 Không di căn hạch vùng
N 1 Di căn hạch nách cùng bên di động
N2 Di căn hạch nách cùng bên cố định hoặc dính nhau hoặc di căn hạch vú trong cùng bên nhưng không di căn hạch nách.
Di căn hạch hạ đòn cùng bên có thể đi kèm với hạch nách hoặc không, hoặc có thể có di căn hạch vú trong cùng bên kết hợp với di căn hạch nách Ngoài ra, di căn hạch thượng đòn cùng bên cũng có thể xảy ra, có thể kèm theo hạch nách hoặc hạch vú trong cùng bên.
Phân loại di căn hạch đã có những thay đổi quan trọng: di căn hạch hạ đòn hiện được xếp vào N3, điều này trước đây không được đề cập Di căn hạch thượng đòn không còn được phân loại là M1 mà đã chuyển thành N3 Ngoài ra, di căn hạch vú trong, trước đây thuộc N3, nay được phân loại chi tiết hơn với di căn hạch nách không kèm theo (N2b) và di căn hạch nách có kèm theo (N3b).
* Xếp giai đoạn lâm sàng
B ảng 1.1 : Phân chia giai đoạn ung thư vú
IV T bất cứ, N bất cứ, M 1
1.1.3 Ch ẩn đoán ung thư vú
Hiện tại, ung thư vú được chẩn đoán xác định dựa vào:
+ Lâm sàng: sờ thấy khối u ranh giới tương đối rõ
Chụp X-quang (XQ) thường được sử dụng để phát hiện khối u, di căn và tổn thương xâm lấn sâu, bao gồm cả xâm lấn xương Hiện nay, với sự phát triển của công nghệ XQ kỹ thuật số, độ phân giải hình ảnh đã được cải thiện, giúp tăng cường khả năng phát hiện khối u và di căn xương một cách hiệu quả hơn.
TBUTM và vai trò c ủa survivin mRNA, hMAM mRNA trong phát hi ện
Đặc tính sinh học của các TBUTM:
TBUTM trong máu bệnh nhân ung thư là dấu hiệu quan trọng cho sự phát tán của bệnh, với các tế bào mang đặc tính của tế bào ung thư nguyên phát và gen đặc trưng mà người bình thường không có Mặc dù tồn tại ở dạng không biệt hóa trong máu, các tế bào này sẽ phân chia khi đến tổ chức phù hợp dưới tác động của các yếu tố đặc thù Trái với quan niệm trước đây cho rằng di căn ung thư vú chỉ xảy ra ở giai đoạn muộn, nghiên cứu gần đây cho thấy quá trình này có thể bắt đầu ngay từ khi khối u mới hình thành Di căn qua đường máu chiếm 80% trong các con đường di căn, với các tế bào ung thư di chuyển (Circulating Tumor Cell) xuất hiện sớm, trở thành dấu ấn chẩn đoán ung thư ngay từ giai đoạn đầu Sự xuất hiện và di chuyển của các khối u vào máu ngoại vi diễn ra qua nhiều giai đoạn.
Các tế bào ung thư ban đầu phát triển nhanh và cần nhiều oxy, dẫn đến sự phát triển xâm lấn Chúng có mật độ thụ thể thấp trên bề mặt, làm giảm khả năng liên kết và kháng lại quá trình chết theo chương trình Kết quả là, các tế bào này sống sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào máu Khi vào máu, các tế bào ung thư mất khả năng biệt hóa và di chuyển đến các cơ quan khác Trong các mô hình nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10.000 tế bào bạch cầu.
Vai trò TBUTM trong chẩn đoán và điều trị
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng TBUTM đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng, với khả năng dự đoán di căn đến gan và phổi, giúp giảm tỷ lệ tử vong nhờ phát hiện sớm và áp dụng phương pháp điều trị thích hợp Việc phát hiện TBUTM từ bệnh nhân cho phép phân tích đặc tính phân tử của tế bào và thiết lập xét nghiệm xâm lấn tối thiểu để dự đoán di căn, từ đó tối ưu hóa điều trị TBUTM cũng có thể theo dõi hiệu quả điều trị, với sự tồn tại của nó sau hóa trị liệu là dấu hiệu cho thấy can thiệp điều trị không thành công Hơn nữa, phát hiện TBUTM trong máu sau phẫu thuật giúp phát hiện sớm tái phát, với độ đặc hiệu cao hơn so với các dấu ấn ung thư huyết thanh cổ điển Cuối cùng, kết quả phân tích TBUTM hỗ trợ lựa chọn phương thức điều trị phù hợp, khuyến khích điều trị toàn thân khi phát hiện TBUTM ở giai đoạn đầu.
Vì ý nghĩa quan trọng như vậy nên kỹ thuật phát hiện TBUTMđược coi là xét nghiệm thường xuyên trong suốt quá trình điều trị và sau điều trị[16]
1.2.2.K ỹ thu ậ t phát hi ệ n TBUTM trên th ế gi ớ i
TBUTM có nồng độ rất thấp trong máu và khó phân biệt với tế bào bạch cầu bình thường, do đó, để nâng cao độ nhạy của xét nghiệm TBUTM, cần phải “làm giàu” tế bào và giảm thiểu sự mất TBUTM trong quá trình thực hiện kỹ thuật Việc làm giàu tế bào dựa vào các yếu tố như kích thước, biến dạng, mật độ, điện tích, và đặc điểm sinh học như biểu hiện protein bề mặt và khả năng xâm nhập Có nhiều phương pháp để làm giàu tế bào dựa trên tỷ trọng và kích thước đặc trưng của từng loại tế bào Quá trình này có thể được thực hiện trước khi tiến hành kỹ thuật phát hiện hoặc kết hợp “làm giàu” cùng với phát hiện trong một quy trình duy nhất.
Hình 1.2: Sơ đồ “làm giàu” TBUTM
Có 2 cách phát hiện sự có mặt của TBUTM:
+ Trực tiếp: Không có sự phá hủy màng tế bào, đảm bảo tính toàn vẹn tế bào, cần thiết bị chụpđặc biệt.
Hình 1.3: Hình ảnh t ế bào ung thư di chuy ển phát hi ện dưới kính hi ển vi điện t ử
(nguồn MARIJA BALIC, National Medical Journal of India 2005[23])
+ Gián tiếp: Phát hiện gen, thụ thể…, protein có trong tế bào ung thư vú mà có thể phân biệtđược với tế bào bình thường.
Một sốphương pháp phát hiện TBUTM
1.2.2.1.Fibre-Optic scanning technology:Đây là một hệ thống tựđộng hiển vi kỹ thuật số siêu tốc độ và áp dụng kỹ thuật quét laser phát hiện tế bào hiếm gặp Quang học in laser được sử dụng để có thể phát hiện tới hơn 300.000 tế bào mỗi giây Hệ thống này giúp phát hiện các tế bào đánh dấu miễn dịch huỳnh quang nhanh hơn 500 lần so với kỹ thuật kính hiển vi tự động thông thường.Điều này tăngđộ nhạyđạtđược ~ 98% trong việc phát hiện TBUTM sau khi tách khỏi máu toàn phần[24]
Hình 1.4: T ế bào ung thư vú lưu hành trong máu quét lase
Hệ thống làm giàu và nhuộm miễn dịch từ tính tự động CellSearch ™ đã được Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ phê duyệt và trở thành "tiêu chuẩn vàng" trong phát hiện tế bào ung thư biểu mô (TBUTM) tại các bệnh viện Vào giữa những năm 1970, việc phát hiện TBUTM đã có bước tiến quan trọng nhờ vào sự biểu hiện khác nhau của EpCAM trong tế bào biểu mô ung thư, trong khi không có trong tế bào máu Phương pháp này dựa vào việc xác định TBUTM thông qua các kháng thể dòng biểu mô, như protein cytokeratins và EpCAM, cùng với bạch cầu đánh dấu thông thường (CD45) và các kháng nguyên khối u cụ thể Ngưỡng cắt ≥ 5 tế bào trong 7,5 ml máu đã được xác định qua sáu nghiên cứu trên 841 bệnh nhân ung thư vú, cho thấy đây là yếu tố tiên lượng độc lập liên quan đến sự sống còn Nghiên cứu của Franken năm 2012 trên 604 bệnh nhân ung thư vú chỉ ra rằng có 15% kết quả dương tính.
TBUTM có khả năng phát hiện sớm bệnh ung thư vú, với tỷ lệ phát hiện là 19% ở khối u lành tính, 16% ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn I, 18% ở giai đoạn II và 31% ở giai đoạn III Điều này cho thấy TBUTM có thể được sử dụng như một công cụ hiệu quả trong việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú.
Ngưỡng 5 TBUTM được rất nhiều nghiên cứu trên thế giới lựa chọn là ngưỡng tiên lượng bệnh ung thư vú[31]
1.2.2.3 CTC chip Đây là mộtđại diện cho công nghệ vi mạch trên nền một thiết bị vi lỏng được gọi là“CTC chip” có hiệu quả cao nhằm phân lập TBUTM Con chip này được tạo thành từ một loạt các 78.000 microspots có chứa kháng thể
EpCAM là một yếu tố quan trọng trong việc phát hiện tế bào ung thư Toàn bộ máu được bơm qua chip, giúp các tế bào EpCAM dương gắn vào các microposts và sau đó được nhận diện bởi máy ảnh Phương pháp này đã được Nagrath và cộng sự áp dụng thành công, cô lập tế bào ung thư từ 115/116 (99%) bệnh nhân Kết quả cho thấy chip đạt độ nhạy 99,1% và độ đặc hiệu 100%.
Phương pháp này sử dụng hai kháng thể kháng MUC1 và
EpCAM.Phương pháp này làm tăng năng suất và độ đặc hiệu của TBUTM phát hiện được Adnatest có độ đặc hiệu > 90% và độ nhạy là 2 tế bào mỗi
Phương pháp AdnaTest BreastCancer hiện nay được sử dụng để phát hiện tế bào ung thư vú trong 5ml máu toàn phần Tuy nhiên, không phải tất cả các tế bào trong mẫu máu đều chứa cả MUC1 và EpCAM, do đó, cần thực hiện quá trình làm giàu tế bào trước khi kết hợp với PCR để đạt được kết quả chính xác.
™ kit (AdnaGen AG, Langenhagen, Đức) phát hiện sự sao chép mRNA của MUC1, HER2 và EpCAM kết quả cho thấy độ nhạy của Adna Test
Breast Cancer ™ và CellSearch ™ đều có khả năng phát hiện từ 5 tế bào ung thư trở lên AdnaTest Breast Cancer cũng cho thấy khả năng phát hiện 60% di căn tới xương ở bệnh nhân nam mắc ung thư vú ở giai đoạn sớm.
1.2.2.5.Telomescan® Đây là một sao chép vector adeno virus vào đoạn telomere của tế bào ung thư Telomesca là một hệ thống phát hiện TBUTM đã đượcđưa ra bởi hai công ty dược phẩm trong năm 2009.Telomere là những trình tự lặp lại của DNA ở các đầu mút của nhiễm sắc thể Mặc dù cũng được cấu thành từ các đơn phân nucleotide, nhưng telomere không mã hóa cho protein.Telomere có nhiệm vụ bảo đảm sự bền vững của các chromosome, chống lại thóai hóa tế bào, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc và có vai trò điều hòa gen, chúng bảo vệ các nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào, giữ cho các nhiễm sắc thể không dính vào nhau.Rối loạn chức năng telomere làm thúc đẩy tạo nên nhiễm sắc thể không ổn định về số lượng và cấu trúc, đây chính là cơ sở để phát triển khối u Ở các TBUTM, người ta có thể thấy các cụm telomeric khác thường có liên quan đến thay đổi trong không gian hạt nhân Phát hiện thay đổi kiến trúc hạt nhân do sự co cụm telomere có liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể và là thước đo giai đoạn bệnh[34] Để phát hiện bất thường telomere có thể dùng các phương pháp: (i) Sử dụng công nghệ hình ảnh: Chụp 3D telomere bằng hệ thống TeloView phát hiện cấu hình hạt nhân tế bào bình thường so với tế bào ung thư (ii) Gắn vớiđoạn gen của Adenovirus: Vector adenovirus là một trong những phương thức chuyển gen trực tiếp hứa hẹn nhất in vivo, trên người, adenovirus là những virus DNA, thuộc họ
Virus Parvoviridae không có vỏ và có khả năng tái tạo đoạn phiên mã của telomere khi ủ với tế bào ung thư Quá trình này sử dụng plasmid mang gen chuyển để kết hợp với các điểm đánh dấu GFP của telomere Sau đó, các phương pháp như southern blot hoặc PCR được áp dụng để phân tích và sàng lọc Gen chuyển sẽ giúp xác định vector tái tổ hợp mong muốn.
PCR là phương pháp khuếch đại chuỗi DNA, bao gồm gen, phần gen hoặc chuỗi không mã hóa, dựa vào enzym DNA polymerase Enzym này cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn Mồi là các đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp với mạch khuôn, cho phép DNA polymerase nối dài và tạo ra mạch DNA mới Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích được nhân đôi thành hai bản sao, và nếu lặp lại 25-35 lần, số bản sao có thể đạt hàng tỷ, từ 1 DNA đích ban đầu.
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-PCR):
RT-PCR, hay còn gọi là phiên mã ngược PCR, là một kỹ thuật quan trọng trong sinh học phân tử, sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp chuỗi DNA bổ sung (cDNA) Quy trình này bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu tiên là tổng hợp cDNA từ RNA, diễn ra dưới tác dụng của enzym phiên mã ngược và các mồi oligo.
Nghiên c ứu phát hiện t ế bào ung thư vú bằng kỹ thuật sinh học phân tử ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã cho thấy thành công trong việc phát hiện tế bào ung thư, đặc biệt là qua nghiên cứu của Tạ Thành Văn về gen HIP trong mô ung thư vú, cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong mức độ sao chép mRNA giữa mô ung thư và mô u xơ Phan Tôn Hoàng cũng đã chỉ ra rằng mức độ biểu hiện của HIP phụ thuộc vào kích thước khối u và độ ác tính Nghiên cứu của Đặng Thị Tuyết Minh vào năm 2008 khẳng định rằng mức độ sao chép mRNA của HIP và EGFR cao hơn ở mô ung thư vú so với mô u xơ, và tăng theo giai đoạn tiến triển của bệnh Kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện tế bào ung thư qua biểu hiện gen đặc hiệu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hỗ trợ chẩn đoán và điều trị ung thư vú Tuy nhiên, theo AJCC 7, việc xác định giai đoạn di căn từ tế bào ung thư trong mô vẫn còn hạn chế, đặt ra thách thức trong việc phát hiện tế bào ung thư trong máu từ giai đoạn sớm, một lĩnh vực cần sự đầu tư và nghiên cứu sâu hơn để cải thiện hiệu quả chẩn đoán và điều trị ung thư vú.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NG HIÊN C ỨU
Đối tượng nghi ên c ứu
Nghiên cứu này tập trung vào nhóm bệnh nhân ung thư vú ở cả 4 giai đoạn theo phân loại TNM, bao gồm các bệnh nhân được chẩn đoán là u xơ tuyến vú Đối tượng nghiên cứu được thu thập từ Khoa Ngoại vú Bệnh viện K, nhằm cung cấp cái nhìn sâu sắc hơn về tình hình và đặc điểm của bệnh ung thư vú.
Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân cho nghiên cứu bao gồm những người được chẩn đoán xác định mắc ung thư vú hoặc u xơ vú thông qua các phương pháp lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả mô bệnh học tại Bệnh viện K.
+ Đã được chẩn đoán có khối u một cơ quan nào khác ngoài vú
+ Đã được điều trị ung thư bằng bất kỳ một phương pháp nào trước đó
+ Không muốn tham gia nghiên cứu.
Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thi ế t k ế nghiên c ứ u và x ử lý s ố li ệ u
- Tiến cứu kết hợp mô tả cắt ngang
- Lưu trữ số liệu bằng Excel 2007
- Thống kê dựa vào phần mềm SPSS 16.0
- Sử dụng các hàm số thống kê: Đối với Ttest so sánh 2 giá trị trung bình, Chi- Square (χ 2 ) và Fisher kiểm định biến tỷ lệvới độ tin cậy 95%
Khi thực hiện thống kê mô tả cho biến định lượng trên hai hoặc nhiều nhóm không tuân theo quy luật chuẩn, các hàm phi tham số là lựa chọn phù hợp Kiểm định Wilcoxon được sử dụng cho mẫu ghép cặp, trong khi kiểm định Mann-Whitney áp dụng cho mẫu độc lập.
SƠ ĐỒ TÓM TẮT QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
(l ấy trước khi điều trị) Mô
- Tách chiết , tinh sạch RNA
- PCR khu ếch đại gen hMAM, survivin, GDPH
- Điện di sản phẩm cDNA hMAM, Survivin
- Gi ải tr ình t ự DNA hMAM, Survivin
- So sánh trình t ự gen hMAM,Survivin
1.Đánh giá m ức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA t ừ mô ung thư vú
2.Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, Survivin mRNA t ừ TBUTM
Dòng tế bào ung thư vú MCF7, BT474, KPL4, MDA-MB
Xây dựng đường chuẩn và ngưỡng phát hiện Realtime PCR
-Bệnh nhân được lựa chọn từ Khoa Ngoại vú Bệnh viện K
- Hóa chất trang thiết bị nghiên cứu phục vụ cho phân tích hóa sinh thông thường, các xét nghiệm CA15-3 được thực hiện tại Khoa Hóa sinh Miễn dịch
- Mô bệnh học được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện K
- Hóa chất trang thiết bị nghiên cứu phục vụ cho phân tích gen:
+Thực hiện tại phòng thí nghiệm của Phòng Công nghệ Tế bào Động vật
Viện Công nghệ Sinh học
+Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội
Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật trên dòng tế bào ung thư vú sau đó áp dụng trên mẫu bệnh phẩm nghiên cứu Quy trình cụ thể như sau:
Sau khi có kết quả chẩn đoán xác định của lâm sàng và cận lâm sàng, những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn của nghiên cứu sẽ được lựa chọn
Mẫu máu được lấy từ bệnh nhân với 5ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA Sau khi ly tâm ở 4000 vòng trong 20 phút, phần huyết tương được loại bỏ và phần vòng trắng bạch cầu được thu thập Kỹ thuật này giúp "làm giàu" tế bào có nhân, bao gồm cả tế bào ung thư vú Các mẫu sau khi lấy cần được bảo quản đúng cách.
4 0 C và được gửingay về phòng nghiên cứu tách chiết RNA tổng số Quy trình đảm bảotuyệt đối vô trùng
Mẫu mô được thu thập từ bệnh nhân sau khi phẫu thuật cắt bỏ khối u, với khối lượng khoảng 20-30mg Mẫu này được bảo quản trong lọ vô trùng ở nhiệt độ -80°C cho đến khi tiến hành tách RNA.
Quy trình lấy mẫu đảm bảo nhất quán về dụng cụ cũng như nhiệt độtrong toàn bộ quá trình thực hiện đề tài
Mồi được thiết kế từ Phòng Công nghệ Tế bào Động vật Viện Công nghệ Sinh học
Tên primer Trình tự Tm KT
The GAPDH forward primer sequence is 5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3’ with a melting temperature of 65.3°C, while the reverse primer is 5’-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3’ with a melting temperature of 67°C Additionally, the hMAM forward primer sequence is 5’-CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC-3’ at 67.2°C, and the reverse primer is 5’-CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG-3’ with a melting temperature of 66.3°C.
SurvivinF 5’-AGA ACT GGC CCT TCT TGG AGG-3’ 63,3
SurvivinR 5’-CTT TTT ATG TTC CTC TAT GGG GTC-3’ 61,8
2.2.3.3 Quy trình nuôi cấy dòng tế bàoung thư vú Môi trường và hóa chất:
- Môi trường bổ sung đầy đủ: DMEM high glucose (invitrogen) + 10%
FBS (Invitrogen) + 1% P/S (Invitrogen) + 2mM L-Glutamin
- Môi trường giữ chủng tếbào: Môi trường bổsung đầy đủ + 10% DMSO
-Hemocytometer (buồng đếm tế bào)
Quy trình rã đông tế bào
-Tế bào giữ trong bình N2 lỏng được lấy ra và đưa vào bể ổn nhiệt 37 0 C trong vòng 1 đến 2 phút để làm tan hết đá.
Để chuẩn bị mẫu tế bào, hãy bổ sung 1ml tế bào với 10ml môi trường bổ sung đầy đủ, sau đó trộn đều và ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 5 phút với tốc độ 2000 vòng/phút Sau khi loại bỏ dịch nổi, hòa lại tế bào vào 10ml môi trường bổ sung đầy đủ và cho vào đĩa nuôi cấy kích thước 10 x 20cm.
-Tế bào được nuôi theo dạng bám đáy ở 37 0 C, 5%CO 2 và được cấy chuyển 2-3 lần trong một tuần.
-Sau khi tế bào phủ ít nhất 70% bề mặt đĩa nuôi cấy, lấy tế bào ra và loại bỏ dịch nuôi
-Rửa lại hai lần với PBS và thêm 1ml Trypsin/EDTA, ủ ở 37 0 C trong khoảng 2-3 phút cho đến khi tế bào bong ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy.
Bổ sung 10ml môi trường bổ sung đầy đủ và hòa đều để tách riêng từng tế bào Tiến hành ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút và sau đó loại bỏ dịch môi trường.
-Bổ sung môi trường và chia ra đĩa nuôi tùy theo nồng độ tế bào (thường chia 1 đĩa ra 2-3 đĩa tùy theo lượng tế bào) Đếm tế bào
Sau khi cấy chuyển từ 3-4 lần, tế bào được thu lại và xác định tổng số lượng Quy trình thu tế bào tương tự như quy trình xử lý trypsin, sau đó hòa trộn trong một thể tích môi trường nhất định Cụ thể, lấy 90µl dịch tế bào và 10µl trypan blue, ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3-4 phút Cuối cùng, hút 10µl tế bào đã nhuộm với trypan blue và đặt vào buồng đếm để xác định số lượng tế bào.
- Đếm số tế bào sống trong mỗi ô 1mm 2 Tế bào sống không bị nhuộm màu và tổng số tế bào được tính theo công thức như sau:
♦ Nồng độ tế bào trong dịch ban đầu = tổng số tế bào trong các lần đếm (trong các ô 1mm 2 )/ số lần đếmx 10 4 x độ pha loãng X (10/9)
(Đơn vị: tế bào/ml)
♦ Tổng số tế bào = Nồng độ tế bào trong dịch ban đầu x số ml dịch tế bào (Đơn vị: tế bào)
2.2.3.4 Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ dòngtế bào ung thư vú, máu và mô nghiên cứu
Tách chiết RNA là bước đầu tiên trong quy trình phát hiện sự biểu hiện gen, đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định thành công của các kỹ thuật tiếp theo Để đạt hiệu quả cao, RNA được tách chiết cần đảm bảo về hàm lượng và độ tinh sạch.
Sử dụng kit QIAamp RNA của hãng QIAgen để tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu mang lại nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp này không chỉ nhanh chóng và dễ thao tác, mà còn cho phép tách chiết tối đa 1,5ml máu để thu thập bạch cầu Hơn nữa, người dùng có thể tách đồng thời nhiều mẫu máu chỉ trong vòng 1 giờ, tiết kiệm thời gian và nâng cao hiệu quả nghiên cứu.
Tiến hành tách chiết RNA từ máu toàn phần, mô ung thư vú, mô u xơ vú lành tính và dòng tế bào ung thư vú.
Thành phần kit tách chiết: Buffer EL, Buffer RLT (Guanidine thiocyanate), Buffer RW1 (cồn và số lượng nhỏ guanidine thiocyanate), Buffer RPE, RNase-free Water
Trước khi tách chiết lần đầu tiên, bổ sung 1 thể tích Buffer RPE + 4 thể tớch ethanol Thờm 10àl β-Mecaptoethanol (β-ME) + 1ml Buffer RLT
+ Quy trình tách chi ết RNA tổng số từ máu như sau:
Bước đầu tiên là trộn 250 µl mẫu với 1,25 ml buffer EL trong ống Eppendorf 2 ml và ủ trong đá từ 10 đến 15 phút Trong quá trình ủ, cần trộn đều bằng vortex 2-3 lần để đảm bảo dung dịch đồng nhất, đây là bước quan trọng trong quá trình phân giải hồng cầu.
Bước 2: Ly tâm 2000 vòng/10 phút ở 4 o C Tế bào bạch cầu sẽ lắng ở phía dưới Loại hết lớp dịch nổi ở trên là hồng cầu
Bước 3: Thờm 500àl buffer EL, làm tan tế bào bằng vortex.
Bước 4: Ly tâm 2000 vòng/10 phút ở 4 o C Loại hoàn toàn lớp dịch nổi ở phía trên
Bước 5: Thờm 350àl buffer RLT đó bổ xung β-ME, làm tan tế bào bằng vortex hoặc pippet
Bước 6: Thu dịch vào cột ly tâm QIAshredder đặt trong ống tube 2ml
Ly tâm 10.000 vòng/2 phút ở 4 o C Loại bỏ dịch trong cột ly tâm QIAshredder, dùng pipet hút dịch nổi và chuyển vào ống effendorf sạch.
Bước 7: Bổ xung 600àl ethanol 70 o C vào mẫu Trộn đều bằng pipet
Bước 8: Thu dịch vào cột ly tâm QIAamp trong ống tube 2ml, đảm bảo không để thành cột bị ướt Đóng nắp và ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 giây tại 4 độ C Sau đó, loại bỏ ống tube chứa dịch lọc và chuyển cột ly tâm QIAamp vào ống tube sạch mới.
Bước 9: Thêm 700µl buffer RW1 vào mẫu Đậy nắp và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ 4°C Sau đó, loại bỏ ống tube chứa dịch lọc bên dưới và đặt cột ly tâm QIAamp vào ống tube sạch.
Bước 10: Thêm 500 µl buffer RPE vào cột ly tâm QIAamp, sau đó đậy nắp và ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 giây tại 4 độ C Tiến hành loại bỏ ống tube chứa dịch lọc ở dưới và đặt cột ly tâm QIAamp vào ống tube sạch.
Bước11: Thờm 500àl buffer RPE vào cột ly tõm QIAamp, ly tõm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 o C Loại bỏ ống tube chứa dịch lọc ở dưới
Đặt cột ly tâm QIAamp vào ống tube sạch và ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút tại 4 độ C Đảm bảo cặn RNA được làm khô, nhưng không để khô quá lâu để tránh giảm chất lượng RNA và khó hòa tan cặn.
Đặt cột ly tâm QIAamp vào ống tube mới 1,5ml và bổ sung 30µl nước sạch RNase Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút ở 4°C để thu được RNA tổng số Dung dịch RNA được bảo quản ở -80°C cho đến khi tổng hợp cDNA.
* Trường hợp mẫu đã được tách bạch cầu thì thực hiện từ bước 5 + Quy trình tách chi ết RNA tổng số từ mô
Bước1: Cắt một mẩu mô khoảng20-30mg, nghiền nhỏ bằng cối chày sứ
Sau đó đặt vào ống effendorf2ml nước sạch RNase đã được làm lạnh
Bước2: Thờm 350àl buffer RLT nghiền tiếp cho đến khi thành bột mịn.
Bước3: Thờm 5àlProtease Kvào mẫu, lắc nhẹ cho đều ủ 5 phỳt ở 37 o C
Th ời gian và kinh phí đề t ài
- Thời gian nghiên cứu: từ 1/2011 - 5/2013
- Kinh phí đề tài: Đề tài được hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ Y tế do
PGS.TS Phạm Thiện Ngọc làm chủ nhiệm theo quyết định số 905/QĐ-BYT, được nghiệm thu theo quyết định số 3018/QĐ-BYT ngày 4/9/4014.
V ấn đề đạo đức của đề t ài
Các đối tượng tham gia nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện và được giải thích rõ ràng trước khi tham gia Họ có quyền rút lui khỏi nghiên cứu nếu không còn muốn tiếp tục tham gia.
* Các thông tin liên quan đến bệnh nhân được đảm bảo bí mật.
* Các kỹ thuật thao tác trên bệnh nhân được bảo đảm đúng chuyên môn
* Đề tài nghiên cứu này được thực hiện hoàn toàn vì mục đích khoa học chứ không vì mục đích nào khác.
K ẾT QUẢ NGHI ÊN C ỨU
Xây d ựng quy tr ình phát hi ện sao chép gen hMAM và survivin ở d òng t ế bào ung thư vú nuôi cấy 49 1 K ết quả RT -PCR phát hi ện hMAM mRNA và survivin mRNA ở d òng t ế b ào 49
tế bào ung thư vú nuôi cấy
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các dòng tế bào ung thư vú như MCF7, BT474, KPL4 và MDA có khả năng khuếch đại nhiều gen liên quan đến ung thư vú.
Trong nghiên cứu MB231, các dòng tế bào ung thư vú được nuôi cấy và đếm số lượng cụ thể trước khi tiến hành thí nghiệm Để đảm bảo chất lượng cDNA, gen nội chuẩn GAPDH được sử dụng nhằm loại trừ những trường hợp âm tính giả do cDNA không đạt yêu cầu.
3.1.1 Kết quả RT-PCR phát hiện hMAM mRNA và survivin mRNA ở dòng tế bào
Hình 3.1: Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR cDNA c ủa hMAM, survivin,
GAPDH ở d òng t ế b ào ung thư vú
Dòng tế bào ung thư vú: MDA-MB231, KPL4, MCF7, BT474; M: thang chuẩn DNA=1kb
Sau khi thực hiện nhân bản cDNA của hMAM và survivin bằng phản ứng PCR trên bốn dòng tế bào ung thư vú, kết quả cho thấy dòng tế bào KPL4, MCF7 và BT474 xuất hiện băng điện di rõ nét kích thước khoảng 202bp, trong khi dòng tế bào MDA-MB231 không có băng điện di Khi sử dụng mồi survivin, các dòng tế bào MDA-MB231, KPL4 và MCF7 cho kết quả băng điện di kích thước khoảng 170bp, nhưng dòng BT474 không xuất hiện băng điện di Để xác nhận đoạn gen đã nhân bản, cần tiến hành giải trình tự và so sánh với đoạn gen đã được công bố trong ngân hàng gen.
3.1.2.Giải trình tự sản phẩm PCR gen hMAM, survivin đã khuếch đại Sản phẩm PCR khuếch đại gen nghiên cứu, được giải trình tựđể khẳng định chắc chắn mẫuđã khuếch đại được là bản sao của gen hMAM, survivin mà ngân hàng gen đã công bố
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR gen hMAM
Sản phẩm PCR với mồi gen hMAM F/R được giải trình tự trực tiếp trên máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems)
Hình 3.2: Trình t ự nucleotid e và trình t ự amino acid suy diễn của đoạn gen hMAM
Trình tự nucleotide của gen hMAM hoàn chỉnh có khoảng 202 nucleotide Trong đoạn DNA bổ sung, màu đỏ đánh dấu vị trí mồihMAM F, trong khi màu xanh đánh dấu vị trí mồihMAM R.
Hình 3.3: Hình ảnh c hromas trình t ự genhMAM khu ếch đại được t ừ mô c ủa bệnh nhân m ã s ố 4744 -11
Kết quả từ việc sử dụng phần mềm BLAST – NCBI (Basic Local Alignment Search Tool) hoặc FASTA cho thấy sự so sánh giữa đoạn gen hMAM nhân bản và trình tự gen hMAM đã được công bố tại Ngân hàng gen.
Hình 3.4: Hình ảnh so sánh k ết quả giải tr ình t ự bản sao gen hMAM nhân b ản được v ới tr ình t ự hMAM mRNA công b ố tại ngân h àng gen
Kết quả giải trình tự gen hMAM cho thấy có sự trùng lặp 100% với các trình tự đã được đăng trên Ngân hàng Gen Quốc tế, cụ thể là mã số Genbank AY893203, AY888136 và U33147 (xem thêm chi tiết trong phần phụ lục).
Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR gen survivin đã khuếch đại được
Hình 3.5: Trình t ự nucleotide v à trình t ự amino acid suy di ễn của đoạn gen survivin
Trình tự nucleotide của gen survivin hoàn chỉnh dài khoảng 170 nucleotide Trong đoạn DNA bổ sung, vị trí mồi survivin F được đánh dấu bằng màu đỏ, trong khi vị trí mồi survivin R được đánh dấu bằng màu xanh.
Kết quả xác định trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóasurvivin thể hiện ở hình 3.6
Hình 3.6: Hình ảnh chromas tr ình t ự đoạn gensurvivin khuếch đại được t ừ máu c ủa b ệnh nhân m ã s ố 4312 -11
Kết quả giải trình tự kiểm tra bằng phần mềm FASTA cho thấy sự so sánh giữa đoạn gen survivin nhân bản và trình tự gen survivin đã được công bố tại Ngân hàng Gen.
Hình 3.7: Hình ảnh s o sánh k ết quả giải tr ình t ự bản sao gen survivin nhân b ản được v ới tr ình t ự survivin công b ố tại ngân h àng gen
Kết quả giải trình tự gen survivin cho thấy có sự trùng lặp 100% với các trình tự đã được đăng trên Ngân hàng Gen Quốc tế Genbank, mã số: [thêm mã số ở đây].
BD167854,BD185366, AY893903(xem thêm kết quả phần phụ lục).
RT-PCR phát hi ện sự sao chép hMAM mRNA v à survivin mRNA
trong mô và trong máu bệnh nhân ung thư vú 3.2.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu
3.2.1.1 Đặc điể m lâm sàng, mô b ệ nh h ọ c c ủa nhóm ung thư vú nghiên cứ u B ảng 3.1: Đặc điểm lâm s àng, mô b ệnh học c ủa nhóm ung thư vú Đặc điểm n Tỷ lệ %
Thể ống tuyến xâm nhập 29 67.5
Dấu ấnung thư vú CA15-3 (bình thường0,05 0,85>0,05
Bệnh nhân ung thư vú và u xơ vú được lấy mẫu mô và máu đồng thời sau khi tách RNA tổng số Các mẫu đạt tiêu chuẩn độ tinh sạch đã được đưa vào nghiên cứu Kết quả cho thấy nồng độ RNA tổng số trong mô cao hơn trong máu, nhưng không có sự khác biệt về khối lượng RNA tổng số giữa mô ung thư và mô u xơ vú, cũng như giữa máu ung thư và máu u xơ vú với p>0,05.
3.2.2 RT-PCR phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô bệnh nhân ung thư vú
3.2.2.1 K ết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hMAM , survivin
Từ 100ng RNA tổng số trong 20 àl ống phản ứng tạo cDNA, sau khi nhân bản với mồi hMAMkết quả thể hiện ở hình 3.9
Hình 3.9: Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR nhân bản cDNAhMAM v à
GAPDH ở mô v à máu b ệnh nhân UTV giai đoạn II
Sản phẩm PCR khuếch đại hMAM từ mô bệnh nhânung thư (1-3)
Sản phẩm PCR khuếch đại hMAM từ máu bệnh nhânung thư vútương ứng (4-6)
Độ đậm của vạch PCR của GAPDH cho thấy các băng rõ nét và kích thước đồng đều, không có sự khác biệt giữa mô ung thư vú và máu của bệnh nhân ung thư vú Các giếng 1, 2, 3, 5, 6 cho thấy sản phẩm cDNA hMAM của bệnh nhân UTV giai đoạn II với băng kích thước khoảng 202 bp, không có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu mô ung thư vú và mẫu máu Giếng số 4 không có sự sao chép hMAM mRNA Điều này cho thấy bệnh nhân có thể thấy sự sao chép hMAM ở mô nhưng không ở mẫu máu tương ứng.
Hình 3.10: Hình ảnh điện di cDNA c ủa hMAM và GAPDH trên gel a garose mô u xơ (1 -6), mô ung thư (7 -8), thang DNA chu ẩn 1 kb (M)
Đậm độ vạch PCR của GAPDH thể hiện rõ ràng và đồng đều ở cả mô u xơ vú và mô ung thư vú Mẫu cDNA hMAM được khuếch đại ở giếng số 5, 6, 7 cho thấy sự sao chép mRNA hMAM ở mô u xơ vú, trong khi đó, đậm độ vạch ở mẫu mô ung thư vú lại rõ nét và đậm hơn so với mô u xơ.
Kết quảđiện di sản phẩm PCR khuếch đạigen survivin
Hình 3.11: Hình ảnh điện di s ản phẩm PCR nhân bản cDNA survivin và
GAPDH ở mô v à máu b ệnh nhân UTV giai đoạn II
Sản phẩm PCR khuếch đại survivin từ mô bệnh nhân ung thư (1-3)
Sản phẩm PCR khuếch đại survivin từ máu bệnh nhân ung thư vútương ứng (4-6)
Đậm độ vạch PCR của GAPDH thể hiện băng rõ nét với kích thước đồng đều, không có sự khác biệt rõ rệt giữa mô ung thư vú và máu của bệnh nhân ung thư vú Tất cả các giếng từ 1 đến 6 đều cho thấy băng với kích thước khoảng 170bp Đặc biệt, đậm độ băng điện di ở các mẫu mô ung thư vú khi khuếch đại gen survivin không cho thấy sự khác biệt so với mẫu máu ung thư tương ứng khi sử dụng 100ng RNA tổng số trong phản ứng RT-PCR.
3.2.2.2 T ỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA v à survivin mRNA trong mô ung thư vú và mô u xơ vú
Dựa trên kết quả điện di sản phẩm RT-PCR, nghiên cứu đã xác định tỷ lệ phát hiện mRNA hMAM và mRNA survivin trong mô ung thư vú cũng như mô u xơ vú.
Hình 3.12: T ỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA v à survivin mRNA ở mô nghiên c ứu
Kết quả điện di RT-PCR cho thấy hMAM mRNA được phát hiện trong 36/43 trường hợp ung thư vú, chiếm 83,7%, trong khi survivin mRNA có mặt trong 32/43 trường hợp, tương đương 74,4% Ngược lại, trong mô u xơ, tỷ lệ phát hiện hMAM chỉ đạt 2/21 trường hợp (9,5%) và survivin là 3/21 trường hợp (14,3%).
Mối liên quan giữa tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA trong mô ung thư với các yếu tố sinh học trong bệnh ung thư vú
Bảng 3.4 cho thấy mối liên quan giữa tỷ lệ sao chép của hMAM mRNA trong mô ung thư và các yếu tố sinh học liên quan đến ung thư vú Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của hMAM mRNA trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế phát triển của ung thư vú, đồng thời mở ra hướng đi mới cho các phương pháp điều trị và chẩn đoán bệnh Việc phân tích tỷ lệ sao chép này có thể cung cấp thông tin quý giá về sự tiến triển của bệnh và khả năng đáp ứng với liệu pháp điều trị.
Các yếu tố liên quan bệnh ung thư vú n hMAM (+)
Nhận xét: Có 90% phát hiện được bản sao gen hMAM ở T1, ở nhóm
Khi kích thước u lớn, tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA đạt 87,5%, không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA trong mô bệnh nhân ung thư vú theo kích thước u (p>0,05) Đối với trường hợp M0, tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA là 81,6%, trong khi trường hợp M1 với biểu hiện di căn rõ ràng có tỷ lệ 100% Không có sự khác biệt giữa tỷ lệ phát hiện hMAM trong mô ung thư vú và tình trạng di căn (p>0,05) Ở giai đoạn I, 87,5% trường hợp được phát hiện có sự sao chép hMAM mRNA, không có sự khác biệt thống kê về tỷ lệ phát hiện hMAM giữa các giai đoạn bệnh (p>0,05) Trong 13 trường hợp chưa phát hiện di căn hạch, có 10 trường hợp (76,9%) phát hiện sự sao chép hMAM mRNA, và tỷ lệ này không khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm di căn hạch và chưa di căn hạch (p>0,05) hMAM mRNA xuất hiện trong mô ung thư vú thể ống xâm nhập với tỷ lệ 93,1%, và sự khác biệt về tỷ lệ biểu hiện hMAM ở các thể mô bệnh học không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Không có sự khác biệt về tỷ lệ sao chép hMAM mRNA ở mô giữa bệnh nhân ung thư vú trên 50 tuổi và dưới 50 tuổi, cũng như giữa nhóm có tăng CA15-3 và nhóm không tăng CA15-3, với giá trị p > 0,05.
Mối liên quan giữa tỷ lệ biểu hiện survivin mRNA trong mô ung thư với các yếu tố sinh học trong bệnh ung thư vú
Mối liên quan giữa tỷ lệ sao chép của mRNA survivin trong mô ung thư và các yếu tố sinh học liên quan đến ung thư vú được thể hiện rõ trong bảng 3.5 Nghiên cứu này chỉ ra rằng mức độ sao chép của survivin mRNA có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và tiến triển của ung thư vú, đồng thời liên quan đến các yếu tố sinh học khác như sự phân chia tế bào và khả năng kháng thuốc.
Các yếu tố liên quan ung thư vú n Survivin (+)(%)
Thể tiểu thùy Thể nhầy
Trong nghiên cứu về mẫu mô ung thư vú, 50% trường hợp phát hiện bản sao gen survivin ở T1, không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện sao chép survivin mRNA theo kích thước u (p>0,05) Đặc biệt, 73,7% mẫu ung thư vú chưa di căn xa có sự sao chép survivin mRNA, mà không có sự khác biệt giữa tỷ lệ này và tình trạng di căn (p>0,05) Ở giai đoạn I, 87,5% trường hợp được phát hiện có sự sao chép survivin mRNA, và không có sự khác biệt thống kê giữa các giai đoạn bệnh (p>0,05) Tỷ lệ sao chép survivin mRNA giữa nhóm di căn hạch và nhóm chưa di căn hạch cũng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Cuối cùng, sự khác biệt về tỷ lệ biểu hiện survivin mRNA ở các thể mô bệnh học không đạt ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Không có sự khác biệt về tỷ lệ sao chép mRNA survivin giữa các mô của bệnh nhân ung thư vú trên 50 tuổi và dưới 50 tuổi, cũng như giữa nhóm có CA15-3 tăng và nhóm không tăng (p>0,05).
3.2.2.3.T ỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA v à survivin mRNA trong máu b ệnh nhân ung thư vú và máu bệnh nhân u xơ vú
Hình 3.13: Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA ở máu bệnh nhân ung thư vú và u xơ vú
Realtime PCR đánh giá mức độ sa o chép hMAM mRNA, survivin
mRNA trong nhóm nghiên cứu 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn xác định số bản sao từ dòng tếbào ung thư vú
Đường chuẩn và ngưỡng phát hiện hMAM mRNA từ tế bào ung thư vú BT474
Sử dụng dòng tế bào ung thư vú BT474: lấy 20.000 tế bào ung thư vú
Trong nghiên cứu này, RNA từ dòng tế bào ung thư vú BT474 được tách ra để tạo cDNA và thực hiện PCR nhằm nhân bản gen hMAM theo quy trình đã được mô tả Sản phẩm PCR thu được có nồng độ 679 ng, và theo công thức tính số bản sao trong Realtime PCR, khoảng 10^5 bản sao cDNA của hMAM đã được tạo ra Các mẫu được pha loãng theo các tỷ lệ 10/100/1.000/10.000 và đưa vào các ống phản ứng Sau 40 chu kỳ, kết quả đã cho phép xây dựng đường chuẩn như thể hiện trong hình 3.14.
Hình 3.14: Real time PCR hMAM cDNA xác định đường chu ẩntr ên dòng t ế bào ung thư vú BT474
A: Đường phản ứng B: Đường chuẩn
Kết quả xây dựng đường chuẩn (Standard Curve) cho phép xác định số bản sao của hMAM mRNA trong các nghiên cứu Từ đường chuẩn này, có thể tính toán số lượng bản sao của hMAM mRNA dựa trên kết quả chu kỳ ngưỡng.
Hình 3.15: Real time PCR hMAM cDNA xác định ngưỡng phát hiện tr ên dòng t ế bào ung thư vú BT474
Đường chuẩn được thiết lập bằng cách đo CP ở 5 ống phản ứng, trong đó ống 1x chứa cDNA hMAM từ 20.000 tế bào BT474, tương đương với 10^5 bản sao Khi pha loãng 100 lần, tương đương với 200 tế bào ung thư vú, CP được phát hiện là 33,14 với 893 bản sao Nếu số bản sao thấp hơn ngưỡng này, sẽ không được coi là phát hiện CP càng thấp thì số bản sao càng nhiều.
Đường chuẩn và ngưỡng phát hiện survivin mRNA từ tế bào ung thư vú MCF7
Quy trình xây dựng đường chuẩn và ngưỡng phát hiện bằng khuếch đại hMAM từ dòng tế bào ung thư vú BT474 tương tự như việc thiết lập ngưỡng phát hiện và đường chuẩn survivin, sử dụng 20.000 tế bào MCF7, như được minh họa trong hình 3.16.
Hình 3.16: Realtime PCR s urvivin cDNA xác định đường chuẩn tr ên dòng t ế bào ung thư vú MCF7
A: Đường phản ứng B: Đường chuẩn
Kết quả xây dựng đường chuẩn (Standard Curve) cho phép xác định số lượng bản sao của survivin mRNA trong các nghiên cứu Dựa vào đường chuẩn này, chúng ta có thể tính toán chính xác số lượng bản sao của survivin mRNA ở các bệnh nhân trong nghiên cứu.
Hình 3.17: Real time PCR survivin cDNA xác định ngưỡng phát hiện tr ên dòng t ế bào ung thư vú MCF7
Phân tích cho thấy phần mềm tính toán đã xác định số lượng bản sao khuếch đại từ các ống phản ứng Ở mức pha loãng 100, tương đương với 200 tế bào, đây là ngưỡng thấp nhất để phát hiện sự sao chép của survivin Ngưỡng Cp để phát hiện cDNA survivin nhân bản được xác định là 26,14, tương ứng với 1,08E4 bản sao.
Phân tích kết quả Realtime PCR
Dựa vào biểu đồđỉnh của đường cong chảy (Melting Peaks) có thể đánh giá được sản phẩm nhân bản được có đúng là đoạn cDNA hMAM hay không
Hình 3.18: K ết quả Tm nhân bản cDNA hMAM từ bệnh nhân ung thư vú
Kết quả nhiệt độ melting (Tm) của cDNA hMAM ở bệnh nhân ung thư vú dao động từ 80,5-83,0 °C, tương ứng với Tm của hMAM được khuếch đại từ dòng tế bào ung thư vú BT474 Sản phẩm khuếch đại từ cDNA hMAM cho thấy tính đồng nhất và đáng tin cậy trong nghiên cứu này.
Melting Peaks gần như nhau
Hình 3.19: Phân tích nhi ệt độ chảy nhân bản gen hMAM ở bệnh nhân u xơ vú, d òng t ế bào ung thư vú, máu và mô bệnh nhân ung thư vú
1: Nước (H2O) 2-6: Mô bệnh nhân u xơ vú (DC1,DC2,DC3,DC4,DC5) 7: Dòng tế bào ung thư vú BT474
8: Dòng tế bào MCF7 9: Mẫu mô bệnh nhân ung thư vú
10: Mẫu máu bệnh nhân ung thư vú
Kết quả phân tích nhiệt độ chảy (Melting Curves) cho thấy sự giảm đột ngột cường độ huỳnh quang trùng khớp với Tm của sản phẩm khuếch đại trong ống phản ứng, cho phép phân biệt giữa bệnh nhân u xơ vú và bệnh nhân ung thư vú cùng dòng tế bào ung thư vú Việc quan sát biểu đồ nhiệt độ chảy giúp xác định Tm của sản phẩm khuếch đại, từ đó phân biệt sản phẩm của đoạn gen cần nhân bản với các đoạn gen khác.
Hình 3.20: Phân tích nhi ệt độ ch ảy sản phẩm nhân bản gen survivin ở b ệnh nhân ung thư vú
2-17: Mẫu mô bệnh nhân ung thư vú
Kết quả nhân bản cDNA của gen survivin ở bệnh nhân ung thư vú cho thấy sự đồng nhất với nhiệt độ chảy khoảng 84-85 độ C Điều này chứng tỏ rằng các sản phẩm nhân bản từ mô và máu của bệnh nhân đều có Melting Curves gần giống nhau, khẳng định tính đồng nhất trong quá trình nhân bản gen survivin.
Hình 3.21 : Đánh giá số lượng b ản sao hMAM cDNA b ằng Real time PCR
Nhận xét: Dựa vào đường ngưỡng, từ CP có thể tính được số lượng bản sao của sản phẩm khuếch đại ở cột Concentratio
3.3.2 M ức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô ung thư vú Để đánh giá mức độ sao chép của đoạn gen khuếch đại cần tiến hành xác định số bản sao sau cùng chu kỳ luân nhiệt, cùnglượng RNA tổng số (100 ng) đưa vào tạo cDNA Bệnh nhân có CP càng thấp, số bản sao càng càng cao, cDNA đích càng nhiều.
B ảng 3 8: M ức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô ung thư vú và mô u xơ
Số bản sao n hMAM mRNA
Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy giá trị trung bình của số bản sao gen hMAM và survivin ở mô ung thư rất cao và không tuân theo phân bố chuẩn Để so sánh mức độ sao chép của hai gen này ở mô ung thư vú với mô u xơ vú, cần thực hiện kiểm định phi tham số (Nonparametric Tests), được áp dụng trong các trường hợp dữ liệu không có phân phối chuẩn, có độ lệch chuẩn lớn, hoặc cho các mẫu nhỏ với số lượng đối tượng ít.
B ả ng 3.9: So sánh m ức độ sao chép hMAM mRNA ở mô ung thư vú và mô u xơ vú
Bản sao hMAM trong mô ung thư và mô u xơ
Bệnh n Thứ hạng trung bình (Mean Rank)
Mann-Whitney U 88,500 Đơn vị lệch chuẩn (Z) -5,374
Nhận xét: So sánh bản sao hMAM trong mô
Thứ hạng trung bình của nhóm ung thư vú:40,9
Thứ hạng trung bình của nhóm u xơ vú: 15,21
Mann-Whitney U,5, đơn vị lệch chuẩn (Z)=-5,374 Mức ý nghĩa quan sát (2 đuôi) p