Thành phần Thể tích (µl) Buffer10X 2,5 dNTPs 2,5 Taq- polymerase 0,2 Mồi F 0,5 Mồi R 0,5 cDNA 3 H2O 15,8 Tổng 25
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tiến hành như sau: Bước khởi đầu
sử dụng nhiệt độ 95o
C/5 phút; Tiếp theo thực hiện 25-30 chu kỳ phản ứng với
chu trình nhiệt: Biến tính 95o
C/45 giây, bắt cặp 52o
C/45 giây, kéo dài72oC/45
giây; Bước kéo dài kết thúc 72o
C/7 phút để hoàn tất phản ứng. Sau đó mẫu được bảo quản ở 4o
C.
2.2.3.8. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc
Dựa vào đặc tính cấu trúc của DNA. Đó là các phân tử tích điện âm đều
khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương. Phát hiện sản phẩm PCR qua quan sát dưới đèn UV nhờ phát màu của
ethidium bromide gắn xen trong DNA.
Cách tiến hành
- Đun nóng trong lị vi sóng dung dịch gel agarose 0,8% hoặc 1%đã pha,
để nguội đến 50 - 60ºC, đổ dung dịch vào khay đã cài lược. Sau 30 phút, gel đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ dung dịch đệm TAE 1X ngập
bản gel khoảng 1 - 2mm.
- Trộnđều 5 μl sản phẩm PCR với 2µl đệm tra mẫu (loading buffer) nhỏ
vào giếng. Chạyđiện di ở hiệuđiện thế 100V trong 30 phút.
- Sau điện di, ngâm bản gel vào dung dịch ethidium bromid trong 20
phút. Lấy bản gel ra rửa qua bằng nước, quan sát và chụpảnh dưới ánh sáng
tia tử ngoại.
- Phân tích sản phẩm PCR sau điện di. Sản phẩm khuếch đại được nhận
biết nhờ kích thước của chúng dựa vào thang DNA chuẩn. Nếu băng gọn rõ thì sản phẩm PCR tốt.
2.2.3.9. Giải trình tự DNA
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với mồi survivin và hMAM, phân tích
hình ảnh điện di trên gel agarose 1% thu được sản phẩm khuếch đại genphù hợp với kích thước mồi đã thiết kế. Thực hiện giải trình tự DNA củavài mẫu
- Kết quả nhân bản được chính là trình tự gen đã nghiên cứu, so sánh với
ngân hàng gen.
- Tìm sự khác biệt nếu có trong các gen nghiên cứu ở mơ ung thư vú, tế
bào ung thư vú lưu hành trong máu.
Nguyên tắc:
Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên. Enzyme
DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’-OH, khi gặp ddNTP (khơng có nhóm 3’-OH) thì phản ứng tổng
hợp bị ngừng lại.Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắnkhác nhau1 nucleotide, có thể phân tách nhờ điện di trên gel polyacrylamid, phát hiện các ddNTP đã đánh dấu nhờ tia laser.
Cách tiến hành:
- Thực hiện phản ứng PCR.
- Sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch được đưa vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems).
So sánh với trình tự gen đã công bố trong ngân hàng gen
Kết quả giải trình tự được đối chiếu với trình tự gen đã được công bố
trong Ngân hàng Gen Quốc tế Genbank do NCBI (The National Center for
Biotechnology Information) cung cấp.
2.2.3.10. Realtime PCR
Để xác định đượcsố bản sao survivinvà hMAM được tạo ra trong mẫu
nghiên cứu, trước hết tiến hành xây dựng đường biểu diễn chuẩn cho phản ứng RealtimePCR sử dụng dòng tế bào ung thư vú. Phản ứng Realtime PCR với mồi
nghiên cứu cùng với bộ kit Realtime PCR sử dụng SYBR Green của hãng Roche. Từ dòng tế bào ung thư vú có thể xác định được đường chuẩn bằng cách
pha loãng cDNA theo các tỷ lệ. Sau khi đã xây dựng được đường biểu diễn
mồi survivinF/R và hMAM F/R với các mẫu nghiên cứu, xác định số lượng
bản sao dựa vào phần mềm cài đặt trên Light Cycle của Roche
- Phản ứng Realtime RT-PCR được tiến hành với:
Thành phần phản ứng: Maxter Mix, mồi survivinF/R, hMAM R/F cDNA,
nước cất.
Do phản ứng Realtime PCR là phản ứng nhạy, vì vậy để tránh trường
hợp dương tính giả do tạp nhiễm từ mơi trường phải có một đối chứng âm
NTC (non-template control), mẫu này cũng có đầy đủ các thành phần giống như một phản ứng Realtime PCR chỉ thiếu DNA khuôn. Phản ứng Realtime PCR chạy với thành phần trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2:Thành phần phản ứng Realtime PCR Thành phần Thể tích (µl)