Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN11397 2016 Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11397 2016 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM PHÁT HIỆN E COLI O157 H7 PHƯƠNG PHÁP 8 H Microbiology of f[.]
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11397:2016 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN E.COLI O157:H7 - PHƯƠNG PHÁP H Microbiology of foods - Detection of E.coli O157:H7 - 8-hour method Lời nói đầu TCVN 11397:2016 xây dựng sở tham khảo AOAC 2000.13 Reveal for E coli O157:H7 test system in selected foods 8-hour method; TCVN 11397:2016 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN E.COLI O157:H7 - PHƯƠNG PHÁP H Microbiology of foods - Detection of E.coli O157:H7 - hour method CẢNH BÁO - Escherichia coli O157 gây số bệnh nguy hiểm có liều lây nhiễm thấp Khả lây nhiễm phòng thử nghiệm ghi nhận Để đảm bảo an toàn cho nhân viên phòng thử nghiệm, phương pháp thử phải nhân viên có kinh nghiệm thực sử dụng kỹ thuật thực hành phòng thử nghiệm tốt tốt tiến hành thiết bị có khả bảo vệ Phải tn thủ quy định an tồn có liên quan Hết sức thận trọng hủy bỏ tất vật liệu bị lây nhiễm Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát E coli O157:H7 thực phẩm phương pháp h Phương pháp đánh giá liên phòng thử nghiệm việc xác nhận giá trị sử dụng sản phẩm từ thịt bò rau diếp Xem Phụ lục A thông tin chi tiết kết đánh giá liên phòng Nguyên tắc Phương pháp h sử dụng môi trường tăng sinh (môi trường h) thử kết tủa miễn dịch dòng chảy phụ nhanh để thu đưực kết tổng thời gian thử nghiệm h Môi trường h cung cấp chất dinh dưỡng có sẵn yếu tố khác cần thiết cho sinh trưởng phát triển nhanh E coli O157: H7 đến mức phát thiết bị h Bộ thử có chứa sẵn kháng thể có độ đặc hiệu cao kháng nguyên E coli O157:H7 Các kháng thể liên kết với vàng keo (colloidal gold) riêng rẽ với mẫu hỗ trợ đặc Phần mẫu thử tăng sinh đặt vào cổng mẫu dòng chảy ban đầu qua thiết bị Mọi kháng nguyên E coli O157:H7 có mặt liên kết với kháng thể cộng hợp vàng tạo thành phức kháng nguyên-kháng thể-nhiễm sắc thể Phức chảy qua màng dòng chảy phụ sau liên kết kháng thể giữ cố định màng tạo cộng hợp vàng dạng kết tủa tạo thành vạch nhìn thấy phản ứng dương tính Phép thử xác nhận hợp lệ vạch đối chứng xuất phía đọc kết sau kết thúc phép thử Nếu không thấy vạch đối chứng phép thử khơng có hiệu lực Môi trường thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất khử ion nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác 3.1 Mơi trường h dùng cho E coli O157:H7, chuẩn bị sẵn (một chai dùng cho phép thử), có bán sẵn từ Công ty Neogen Corp, Lansing, MI, Hoa Kỳ 1) Chuyển hết lượng chứa chai sang vật chứa vô trùng Thêm 225 ml nước vô trùng 43 oC Trộn mơi trường, thêm nước để có nồng độ 39,6 g/l trộn 3.2 Bộ thử E coli O157:H7, thử dùng cho mẫu, có sẵn từ hãng Neogen Corp 1) 3.3 Chất pha lỗng đệm phosphat Butterfield (BPB) 1) Ví dụ sản phẩm thích hợp có bán sẵn Thơng tin đưa nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Trộn 34,0 g monokali phosphat 500 ml nước Chỉnh pH đến 7,2 dung dịch natri hydroxit M (40 g/l) Pha lỗng đến lít nước Hấp 15 nồi hấp áp lực 121 oC Cho 1,25 ml dung dịch vào bình định mức lít (4.8) vơ trùng thêm nước đến vạch 3.4 Thạch phát E coli gây xuất huyết đường ruột (HC) 3.4.1 Thành phần Trypton 20,0 g Muối mật số 1,12 g Natri clorua 5,0 g Sorbitol 20,0 g Thuốc thử 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) 0,1 g Bromocresol tía 0,015 g Thạch 15,0 g Nước 1,0 lít 3.4.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng có khuấy Hấp 15 nồi hấp áp lực 121 o C pH cuối phải 7,2 ± 0,2 3.5 Môi trường thạch sinh màu Biosynth (BCM) O157:H7(+), có sẵn từ Biosynth International, Inc (1665 W Quincy Ave, Suite 155, Naperville, IL 60504, Hoa Kỳ) 1) 3.5.1 Thành phần BCM O157: H7(+) 80,0 g N,N-dimethylformamide (DMF, Sigma, Cat No D4254.)1) Natri novobiocin (dung dịch 0,2 %, Sigma, Cat No N1628.) Kali tellurit (dung dịch 0,1 %, Sigma, Cat No P0677.) 5,0 ml 1) 1) Nước 5,0 ml 0,2 ml lít 3.5.2 Chuẩn bị Cho DMF vào nước cất, sau thêm bột BCM đun sơi để hịa tan Chỉnh pH đến 6,8 ± 0,1 Không hấp áp lực Làm nguội đến nhiệt độ từ 50 oC đến 55 oC nồi cách thủy Lọc qua xyranh (4.3) để khử trùng novobiocin kali tellurit riêng rẽ bổ sung vào môi trường cách vô trùng 3.6 Môi trường CHROMagar™ O157, có sẵn từ CHROMagar Microbiology (Paris, Pháp)1) 3.6.1 Thành phần CHROMagar O157 29,2 g Nước lít 3.6.2 Chuẩn bị Hòa bột từ từ vào nước cách xoay bình Đun đến sơi (100 oC) xoay bình khuấy Nếu sử dụng nồi hấp áp lực, khơng dùng áp lực Khơng làm nóng 100 oC Làm nguội đến khoảng 45 oC đến 50 oC nồi cách thủy 3.8 Dung dịch natri hydroxit (NaOH), M Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm cụ thể thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 Tủ ấm, trì nhiệt độ từ 36 oC đến 38 oC từ 42 oC đến 43 oC 4.2 Nồi cách thủy, trì nhiệt độ 100 oC ± oC 4.3 Xyranh, trang bị lọc cỡ lỗ nhỏ 0,45 μm 4.4 Ống nghiệm, kích thước 16 mm x 100 mm thủy tinh bo silicat 4.5 Pipet LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn 4.6 Micropipet, phân phối xác 0,12 ml 4.7 Túi nhu động 4.8 Bình định mức, dung tích lít 4.9 Bình nón, dung tích 500 ml, có nắp vặn Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị huyền phù mẫu thử 5.1.1 Đối với rau Cắt mẫu rau cách vô trùng chuyển 50 g sang túi vô trùng Thêm 50 ml chất pha lỗng BPB (3.3), đóng nắp túi lắc tay 15 Gạn lấy 25 ml cho vào bình nón 500 ml (4.9) có chứa sẵn 225 ml môi trường h (3.1) Nới lỏng nắp bình, lắc nhẹ để trộn ủ h 42 oC đến 43 oC tủ ấm (4.1) Lấy ml môi trường cho vào ống nghiệm (4.4) Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (4.2) 100 o C 10 Làm nguội đến nhiệt độ phòng 5.1.2 Đối với thịt nguyên liệu thịt xay Cân vô trùng khoảng 25,0 g phần mẫu thử cho vào túi nhu động (4.7) có chứa sẵn 225 ml mơi trường h (3.1) Bóp tay để trộn ủ h nhiệt độ từ 42 oC đến 43 oC tủ ấm (4.1) Đối với mẫu thử khối thịt nguyên liệu khối thịt xay có khối lượng 375 g, cân vơ trùng 375 g phần mẫu thử cho vào vật chứa vơ trùng có dung tích thích hợp Thêm 3,375 lít mơi trường h (3.1) làm ấm đến nhiệt độ 42 oC ± oC Bóp tay để trộn ủ 12 h nhiệt độ 42 oC ± oC tủ ấm (4.1) Đối với hai trường hợp nêu trên, sau ủ, chuyển ml trường vào ống nghiệm (4.4) Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (4.2) 100 oC 10 Làm nguội đến nhiệt độ phòng 5.2 Xác định Mở túi chứa thử (3.2) Sử dụng thử cho phép thử Dùng pipet (4.6) chuyển 0,12 ml chủng cấy xử lý nhiệt từ ống nghiệm chuẩn bị 5.1, đưa mẫu vào cổng thử Ủ 15 nhiệt độ phòng 5.3 Đọc kết Kiểm tra thử sau phát triển 15 Kết dương tính đọc kết thử có vạch khác nhau: vạch vùng phía gần với vạch thử "T" vạch vùng phía gần với vạch đối chứng "C" Các vạch có màu đen tương phản trắng Kết âm tính có vạch vùng phía (vùng đối chứng) ô đọc kết Kết khơng hợp lệ khơng có vạch vùng phía (vùng đối chứng) đọc kết quả, cho dù có vạch vùng phía (vùng thử nghiệm) 5.4 Khẳng định kết Phép thử dương tính giả định (xem 5.3) phải khẳng định a) Đối với mẫu thử rau, thịt nguyên liệu thịt xay Chuẩn bị dung dịch pha loãng thích hợp từ chủng cấy tăng sinh mơi trường h dàn vào thạch HC (3.4) thạch BCM (3.5) Các khuẩn lạc âm tính với thuốc thử sorbitol MUG phân lập từ thạch HC cần khẳng định mặt huyết học với kháng huyết O157 H7 b) Đối với mẫu thử khối thịt nguyên liệu khối thịt xay có khối lượng 375 g Cấy đĩa chủng cấy tăng sinh môi trường h vào môi trường CHROMagar™ O157 (3.6) ủ 24 h ± h nhiệt độ 37 oC ± oC tủ ấm (4.1) Các khuẩn lạc E coli O157:H7 có màu tím hoa cà vi khuẩn coliform khác có màu xanh, màu xám khơng màu Tiếp tục thực phép thử khẳng định mặt huyết học Khuẩn lạc nghi ngờ khẳng định đáp ứng tiêu chí sau: - dương tính với phép thử sinh độc tố Shiga (ST); - dương tính với phép thử gen độc tố Shiga “stx”; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - xác định gen “H7” Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin sau đây: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; c) kết thử nghiệm; d) ngày kết thúc thử nghiệm; e) chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy chọn ảnh hưởng đến kết Phụ lục A (Tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Bảng A.1 - Kết phép thử liên phòng thử nghiệm E coli O157:H7 sản phẩm thịt bò Mẫu Mức MPN/g Tổng Kết số dương tính mẫu Hệ thống thử h X2 c Độ nhạyd, % Tỷ lệ âm tính giảe, % Giả Khẳng địnha địnhb Rau diếp Thử Đối Thử Đối Thử Đối Thử Đối h chứng h chứng h chứng h chứng 0,03 75 48 46 0,17 61,3 57,3 38,7 42,7 - - - - Cao 1,1 75 59 52 0,54 69,3 75 0 - 76 30,7 24 - - - - - - - 100 100 0 Thấp 0,24 70 55 48 15,4 68,6 32,9 31,4 67,1 - - - - Cao 2,92 70 67 63 21,46 90,0 70 0 Đối chứng Thịt bò xay nguyên liệu Tỷ lệ dương tính giảg % Thấp Đối chứng Thịt bò nguyên liệu Độ đặc hiệuf, % rau diếp - 50 10,0 50 - - - - - - - 100 100 0 - - - - Thấp 0,07 75 67 56 0,8 Cao 0,28 75 74 72 3,86 96,0 85,3 75 Đối chứng 74,7 66,7 25,3 33,3 - - 4,0 14,7 - - - - - - 100 100 0 CHÚ DẪN: MPN: Số đơn vị hình thành khuẩn lạc có xác suất lớn nhất, tính theo CFU/g (giới hạn tin cậy 95 %) a) Bộ thử cho kết dương tính với canh thang tăng sinh h b) Các chủng cấy tăng sinh mẫu dương tính giả định khẳng định theo 5.4a c) Khi bình phương hai mẫu độc lập: X2 = N x Trong đó: a: số mẫu dương tính phép thử h, b: số mẫu dương tính phép thử khẳng định (5.4), LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê Mẫu www.luatminhkhue.vn Mức MPN/g Tổng Kết số dương tính mẫu Hệ thống thử h X2 c Độ nhạyd, % Tỷ lệ âm tính giảe, % Độ đặc hiệuf, % Tỷ lệ dương tính giảg % c: số mẫu âm tính phép thử h, d: số mẫu dương tính phép thử khẳng định (5.4), N: tổng số mẫu thử với hai phương pháp Giá trị X2 > 3,84 cho thấy khác biệt đáng kể mức xác suất % d) Độ nhạy tỉ lệ phần trăm tổng số phần mẫu thử dương tính với phép thử khẳng định (5.4) so với tổng số mẫu cấy e) Tỷ lệ âm tính giả (100 - độ nhạy) Số phép thử dương tính khẳng định thấp cho tỷ lệ âm tính giả cao f) Độ đặc hiệu tỉ lệ phần trăm tổng số phần mẫu thử âm tính với phép thử khẳng định (5.4) so với tổng số mẫu chưa cấy Có thể tính số mẫu đối chứng chưa cấy g) Tỷ lệ âm dương giả (100 - độ đặc hiệu) Bảng A.2 - Kết phép thử liên phòng thử nghiệm E coli O157:H7 mẫu sản phẩm thịt bị có khối lượng 375 g Mẫu Thịt bị xay nguyên liệu Thịt bò nguyên liệu Chủng ATCC 35150 ATCC 43895 MPN/ga 0,015 (0,0037÷0,042) MPN/ Tổng Kết X d Thử h phần số Hệ thống thử mẫu mẫu 8h thử Giả Khẳng Độ Tỷ lệ Độ đặc (375 g)a Tỷ lệ địnhb địnhc nhạye, âm hiệug, dương % tính % tính giảf, giảh, % % 5,6 (1,416)