NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chù trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỐNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 KHẢO SÁT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG KHÁNG ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE ĐỊNH HƯỚNG KHÁNG ALZHEIMER số hợp đồng: 2017.01.45 /HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Hồng Phúc Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 12/2016 - 12/2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chù trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỐNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2016 -2017 KHẢO SÁT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG KHÁNG ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE ĐỊNH HƯỚNG KHÁNG ALZHEIMER số họp đồng : 2017.01.45 /HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyền Thị Hồng Phúc Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 12/2016 - 12/2017 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT Acetylcholin ACh AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesterase AChEi Acetylcholinesterase Chat inhibitor acetylcholinesterase AD, SDAT Alzheimer disease Bệnh Alzheimer APP Amyloid precursor protein Gen sản xuat protein tien kháng enzym chat amyloid ATCI Acetylthiocholin iodid Ap Amyloid beta BTLC Bioautography thin layer Sac ký lớp mỏng sinh học chromatography BChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesterase DMSO Dimethysulfoxid DTNB 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid EtOAc IC50 Ethyl acetat Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% NMDA N-methyl-D-aspartat MeOH Methanol vs Thuốc thử vanillin - sulfuric DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo acetylcholin Hình 1.2 Tóm tắt q trình tống họp ACh mắc bệnh Alzheimer có ức chế enzym AChE (Nguồn: Geriatrics Aging ©2009 1453987) Hình 1.3 Các vị trí hoạt động AChE Hình 1.4 Cơ chế chất ức chế AChE thuận nghịch 10 Hình 3.1 Pho uv - Vis hồn họp phản ứng enzym AChE với ACTI DTNB 32 Hình 3.2 Ket khảo sát động học phản ứng enzym nồng độ 0,25ư/ml 34 Hình 3.3 Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE in vitro 36 Hình 3.4 Cây dừa cạn 39 Hình 3.5 Hoa dừa cạn 40 Hình 3.6 Vi phẫu rễ dừa cạn 41 Hình 3.7 Vi phẫu thân dừa cạn 42 Hình 3.8 Vi phẫu dừa cạn (A), mơ mềm giậu (B), lồ khí (C) 43 Hình 3.9 Soi bột dược liệu dừa cạn 45 Hình 3.10 Quy trình chiết xuất alkaloid từ dược liệu Dừa cạn 47 Hình 3.11 Quy trình xử lý sơ cao alkaloid toàn phần 48 Hình 3.12 Sắc ký lóp mỏng kiểm tra cao phânđoạn 49 Hình 3.13 Sắc ký lóp mỏng phân đoạn H1-H8 52 Hình 3.14 Sắc ký lóp mỏng phân đoạn E1 - E18 54 Hình 3.15 Sắc ký lóp mỏng kiếm tra độ tinh khiếtkếttinh 56 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dược liệu tiến hành khảo sát sơ tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase 19 Bảng 2.2 Thành phần hồn họp phản ứng khảo sát tác dụng ức chế AChE 26 Bảng 3.1 Ket chiết xuất cao toàn phần mầu dược liệu thử nghiệm cồn 80% 31 Bảng 3.2 Ket khảo sát dung mơi hịa tan mẫu 33 Bảng 3.3 Thành phần hồn hợp phản ứng xác định 35 Bảng 3.4 Ket đánh giá sơ khả ức chế enzym AChE mầu dược liệu nghiên cứu 37 Bảng 3.5 Ket khảo sát thành phần hóa thực vật dừa cạn 45 Bảng 3.6 Kết tách cao phân đoạn 50 Bảng 3.7 Ket tách phân đoạn cắn không tan 52 Bảng 3.8 Ket đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cao phân đoạn 57 Bảng 3.9 Ket đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE phân đoạn cột cắn không tan 57 Bảng 3.10 Ket đánh giá hoạt tính kháng enzym AChE kết tinh thu 58 iii ĐẶT • VÁN ĐÈ Theo Bộ trưởng Nguyễn Thị Kim Tiến, hội thảo đối thoại sách "già hóa dân số phịng chống bệnh khơng lây nhiễm" khuôn khổ Hội nghị quan chức cao cấp lần thứ (SOM3 - APEC) diễn TP.HCM, Việt Nam 10 nước có tốc độ già hóa dân số nhanh the giới, số lượng người cao tuổi ngày nhiều thêm theo thời gian Cùng với phát triển sống đại sa sút trí tuệ - bệnh biết đến với tên Alzheimer trở nên phổ biến Bệnh thường xuất nhừng người 65 tuổi vần có trường họp mắc bệnh cịn trẻ tỉ lệ có chiều hướng tăng năm gần Đây vấn đề đáng lo ngại, thách thức với y học Alzheimer bệnh phức tạp Sinh bệnh học Alzheimer liên quan đến nhiều yếu tố amyloid beta (Ap), protein tau, viêm thần kinh, mát thiệt hại các synap tế bào thần kinh Vì việc sử dụng loại thuốc cố truyền với đặc tính đa mục tiêu có lẽ sè có ưu so với việc sử dụng loại thuốc điều trị triệu chứng bệnh lý Đây phương hướng điều trị phù hợp với xu hướng quay với thuốc có nguồn gốc tự nhiên giới, mà thuốc có nguồn gốc tổng họp hóa dược bộc lộ hạn chế nhiều tác dụng phụ, phản ứng có hại tương tác thuốc Achetylcholin có vai trị quan trọng hoạt động hệ thần kinh, chất dẫn truyền thần kinh khe synap nồng độ acetylcholine trì ổn định enzym acetylcholinesterase Acetylcholinesterase enzym có chức làm ngưng lại hoạt động chất dần truyền thần kinh acetylcholin thông qua việc thủy phân acetylcholin tạo thành cholin acid acetic Ớ bệnh nhân Alzheimer, nồng độ acetylcholin bị suy giảm đáng kể Do vậy, thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase đóng vai trị quan trọng việc ngăn chặn tiến trien bệnh Alzheimer Các thuốc ức chế cholinesterase chủ yếu thị trường đa số thuốc tân dược giá thành thuốc tương đối cao có tác dụng khơng mong muốn Do nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để hồ trợ điều trị Alzheimer điều cần thiết Việt Nam nước giới có nguồn dược liệu phong phú đa dạng Tuy nhiên có nhiều loại dược liệu chưa trọng nghiên cứu theo định hướng ức chế enzym acetylcholinesterase, nhu cầu sử dụng phố biến bệnh nhân phải mua thuốc nhập từ nước với giá thành cao Điều gây ton thất giá trị kinh tế ý nghĩa xà hội y học co truyền Việt Nam Vì tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng hoạt chất dược liệu định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase” với mong muốn có the tìm hoạt chất tiềm góp phần ngăn chặn tiến triển chứng suy giảm trí nhớ bệnh Alzheimer Đe tài thực với mục tiêu sau: Sàng lọc dược liệu có định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase Chọn dược liệu có tác dụng tốt Chiết cao tồn phần, phân lập thành phân đoạn nhỏ có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase Tách họp chất tinh khiết từ dược liệu định hướng tác dụng kháng enzym acetylcholinesterase CHƯƠNG 1- TỎNG QUAN TÀI LIỆU l.l.Bệnh Alzheimer l.l.l Tổng quan bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer (AD, SDAT) hay đơn giản Alzheimer chứng trí phố biến nhất, chiếm 60% đến 70% trường hợp Vào năm 1906, lần bác sĩ tâm thần thần kinh học người Đức Alois Alzheimer bệnh khơng the chừa được, mang tính thối hóa gây tử vong Căn bệnh đặt theo tên ơng Đó bệnh thối hóa thần kinh mãn tính thường từ sè tồi tệ theo thời gian Mặc dù ca bệnh Alzheimer có đặc điểm riêng biệt mồi cá nhân, nhiên có nhiều triệu chứng tương đồng xuất sớm quan sát thường nhầm lẫn với bệnh liên quan đến tuổi già, biểu stress [57] Trong giai đoạn đầu, triệu chứng phổ biến cơng nhận khơng có khả để nhớ việc vừa xảy Khi nghi ngờ mắc bệnh Alzheimer, chẩn đoán thường thực cách đánh giá hành vi kiểm tra nhận thức, có the kèm theo chụp cắt lớp não Khi bệnh tiến triến, triệu chứng bao gồm nhầm lẫn, khó chịu, thay đổi tâm trạng, khả phân tích ngơn ngữ, trí nhớ dài hạn, suy giảm giác quan Dần dần, thể sè số chức năng, cuối dần đến chết Bệnh Alzheimer phát triển tiềm tàng thời gian dài trước xuất triệu chứng phát bệnh Thơng thường triệu chứng bộc lộ, người bệnh sống khoảng 3-9 năm, 3% bệnh nhân sống thọ thêm 14 năm sau phát bệnh [571 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Hiện khoa học chưa hiếu rõ nguyên nhân tiến triến bệnh Alzheimer Khoảng 70% nguy cho di truyền với nhiều gen thường liên quan Các yếu tố nguy khác bao gồm tiền sử chấn thương đầu, trầm cảm, tăng huyết áp Nghiên cứu cho thấy bệnh có liên quan với mảng đám rối [55] Các nhà khoa học đưa số giả thuyết để giải thích nguyên nhân bệnh Giả thuyết cố điển giả thuyết hệ thống truyền đạt thần kinh bang acetylcholin (cholinergic) [25], giả thuyết sở cho đa số loại thuốc điều trị Giả thuyết đề xuất bệnh Alzheimer giảm tổng hợp chất truyền đạt thần kinh acetylcholin (ACh) Tuy nhiên giả thuyết cholinergic không ủng hộ gần đây, chủ yếu thuốc dùng đế điều trị thiếu hụt acetylcholin thực khơng có hiệu bệnh nhân Các hiệu ứng liên quan đế hệ thong truyền đạt thần kinh acetylcholin khác đề xuất, việc tích tụ sổ lượng lớn amyloid [521, dẫn đến việc viêm thần kinh lan dần Năm 1991, giả thuyết amyloid cho tích tụ amyloid beta (A[3) nguyên nhân bệnh [30] Một sở ùng hộ giả thuyết vị trí gen sản xuất protein tiền chat amyloid (APP) nằm nhiễm sắc the 21 người mắc hội chứng Down (có nhiễm sắc thể 21) tức có thêm phiên gen APP hầu hết mắc bệnh Alzheirmer độ tuối 40 [38] Đồng thời, đột biến gen APOE4, yếu tố nguy di truyền bệnh Alzheimer, gây việc tích tụ nhiều amyloid não trước có biểu bệnh Alzheimer xuất Vì tích tụ Ap ln có trước biếu bệnh Alzheimer lâm sàng [49] Một chứng chuột bị biến đổi gen để biếu dạng đột biến gen APP người cho thấy có đám rối sợi amyloid bệnh lý tương tự bệnh Alzheimer suy giảm khả học hỏi không gian [32] Tuy nhiên, nghiên cứu vào năm 2004 thấy tích tụ mảng amyloid không tương quan nhiều với việc nơ-ron [51] Nghiên cứu hỗ trợ cho giả thuyết tau the bất thường protein tau khởi đầu cho chuồi phản ứng gây bệnh [43] Trong mơ hình này, protein tau bị phosphoryl hóa nhiều bắt cặp với sợi tau khác Cuối cùng, chúng hình thành đám rối sợi thần kinh (neurofibrillary tangles) bên thân tế bào thần kinh [28] Khi điều xảy ra, vi ống tế bào (microtubule - thành phần cấu tạo khung xương tế bào) bị tan rã, làm hỏng hệ thong vận chuyển nơ-ron [33], dẫn đến làm hỏng chức liên lạc hóa sinh giừa nơ-ron sau gây chết tế bào [17] Một giả thuyết khác xác nhận bệnh phá hủy myelin não lão hóa Sự mát myelin dẫn đến giảm khả dẫn truyền trục thần kinh (axon), dần nơ-ron già cũ Quá trình phân hủy myelin thải sắt góp phần gây phá hủy thêm thần kinh Quá trình sửa chừa myelin cân nội mơi góp phần vào tích tụ protein protein A[3 tau [l2] Stress ơxi hóa ngun nhân đáng ke việc hình thành bệnh [531 Phản ứng oxy hoá mức dẫn đến tăng gốc tự Các gốc tự cho có liên quan đến kết hợp tăng lắng đọng protein Ap gây chết tế bào thần kinh Sự giảm lưu lượng máu não, rối loạn sinh tổng họp yếu tổ dinh dưỡng thần kinh giả định có vai trị chế gây bệnh Alzheimer ... Sàng lọc dược liệu có định hướng tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase Chọn dược liệu có tác dụng tốt Chiết cao toàn phần, phân lập thành phân đoạn nhỏ có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase. .. -2017 KHẢO SÁT MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG KHÁNG ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE ĐỊNH HƯỚNG KHÁNG ALZHEIMER số họp đồng : 2017.01.45 /HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Nguyền Thị Hồng Phúc Đơn vị công tác: ... CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dược liệu tiến hành khảo sát sơ tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase 19 Bảng 2.2 Thành phần hồn họp phản ứng khảo sát tác dụng ức chế AChE 26 Bảng 3.1