- Tìm dung môi thích hợp cho việc tách chiết kháng sinh từ nấm sợi
- Xác định một số tính chất của kháng sinh từ nấm sợi
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
3. Phương pháp nghiên cứu 2
CHƯƠNG I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 8
CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 29
2.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 29
2.1.1. Địa điểm 29
2.1.2. Thời gian 29
2.2. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm 29
2.3. Môi trường nghiên cứu 29
2.4. Phương pháp tiến hành thí nghiệm....................................................................... 30
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 32
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm sợi từ đất vườn tỉnh Bình Dương. 32
3.2. Khảo sát khả năng sinh các chất kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương 33
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của chất kháng sinh từ chủng nấm
Tr – Đ2.4 39
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
+ Giá bào tử, các thể bọng, thể bình.
+ Sợi nấm có hay không có sựphân nhánh và vách ngăn.
+ Màu sắc, kính thước bào tử, có gai hay không có gai.
Chụp hình trên kính hiển vi quanghọc ở độ phóng đại 400- 1000 lần.
- Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 5mm) khoan các lỗ thạch trên môi trường nghiên cứu tương ứng trong các hộp pêtri (MT1) với cơ chất tương ứng.
- Dùng pipet vô trùng nhỏ0,1 ml dịch enzym vào các lỗ khoan trên các môi trường thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp pêtri vào tủ lạnh ở 40C trong vòng 2 – 4 giờ. Sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm ở 280C - 300C, trong vòng 24 giờ.
- Kiểm tra kết quả:
- Chương 3: Kết quả thí nghiệm (10trang)
Hình 1.1.Sự phát triển của hệ sợi nấm Hình 1.2.Hình thái khuẩn lạc.
Hình 1.3. Các loại sợi nấm
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone).Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tếbào phát triển nhanh chóng, vùng này có thểdài đến 30µm. Dưới phần này thành tếbào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tếbào. Trên màng nguyên sinh chất có một sốphần có kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta gọi là biên thểmàng (plasmalemmasome) hay biên thể(lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó.Các chất dựtrữthường gặp ởnấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [24].
Nấm sợi chỉmọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì thếchúng phát triển trên bềmặt cơchất (khuẩn ty khí sinh) tạo thành lớp hình sợi, lớp mạng nhện hay lớp sợi bông.Một sốsợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơchất và hútchất dinh dưỡng (khuẩn ty cơchất).Bên trong khuẩn ty có một nhân, hai nhân hay nhiều nhân [6].
Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ởmột sốnấm, sợi nấm mang sắc tốtạo nên màu tối hay màu sặc sỡ.Sắc tốcủa một sốnấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển.Một sốnấm còn tiết ra các chất hữu cơtạo nên các tinh thểtrên bềmặt khuẩn lạc.Vì bào tửcủa nấm thường có màu nên cảkhuẩn lạc thường có màu [25].
Trong tế bào nấm còn có các cơquan như: ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus),thểribôxôm (ribosome), bào nang (vesicle), thểGolgi sinh (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể(chrystal) và các vi thể đường kính 0,5- 1,5nm (microbody), các thểVôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thểChitôxôm đường kính 40 -70nm (chitosome)… Ngoài ra trong tếbào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5- 8 nm (microfilament), các thểmàng biên (plasmalemmasome).
Hình 1.4.Cấu trúc sợi nấm [25].
1.1.3. Đặc điểm sinh lí, hóa sinh
Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh. Đểthực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu không giống nhau vềcác nguồn thức ăn cacbon. Chúng có thể sửdụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từcacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉtiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa sốlượng bào tử, mức độtích lũy tối đa các chất chuyển hóa. Sự sinh trưởng tối đa của hệsợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất.
Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉđường...[9].
Các loài nấm sợi khác nhau có thểcó nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sửdụng cảnguồn nitơhữu cơlẫn vô cơ. Nhiều loài nấm sợi (thuộc các chi Aspergillus, Penicillium) có khảnăng khửnitrat hóa. Một sốloài như Aspergillusflavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium verrucaria….. cókhảnăng đồng hóa trực tiếp nitơphân tử[9].
Các nguyên tốvi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tếbào nấm sợi. Các loại nấm sợi có quan hệrất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu vềchất sinh trưởng của một loài nấm sợi cóthểthay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống [9].
Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng nhưtất cảcác sinh vật khác còn có nhu cầu vềnước cho các họat động sinh lý, sinh hóa của tếbào.Liên quan đến lượng nước còn có độ ẩm.Các yếu tốnày ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60%). Khảnăng hấp thụhay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độmôi trường, khoảng từ15- 300C, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 300C, tùy loài [9].
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sựsinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ởpH = 6. Môi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu [9].
Riêng các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất ưa axít, phát triển tốt ởbất cứpH nào nhỏhơn 7 và chúng có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu ở đó có một lượng lớn CO2 và bicacbonat [15].
1.1.4. Phương thức sinh sản
Nấm sợi sinh sản chủyếu bằng bào tử, bào tửmọc ra từsợi nấm và sau đó là hệsợi nấm. Bào tửcó thểhình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Chúng khác nhau vềhình dạng và cách phát sinh.
* Sinh sản vô tính: Có 3 loại bào tửvô tính:
+ Bào tử động (zoospores)
+ Bào tửkín (sporangiospore)
+ Bào tửtrần (conidi): loại bào tửphát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội sinh, khi chín được giải phóng ra ngoài. Bào tửtrần có thểcó hoặc không có vách ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp..), có một vách ngăn ngang (Trichothecium spp…) có từhai vách ngăn trởlên (Fusarium spp..), có vách ngăn ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽhay nối tiếp nhau (Alternaria spp…) Hình dạng bào tửhình trứng, cầu, hạt chanh [24].
* Sinh sản sinh dưỡng: sinh sản bằng khuẩn ty hoặc bằng hạch nấm, đây cũng là hình thức sinh sản vô tính.
* Sinh sản hữu tính:
+ Phương pháp đẳng giao, dị giao, noãn giao
+ Bào tửtiếp hợp (zygospores)
+ Bào tửtúi (ascospores)
+ Bào tử đảm(basidiosppores)
Phương thức sống của nấm sợi: dịdưỡng, phần lớn hoại sinh, một sốsống ký sinh trênngười, động thực vật, còn một sốkhác thì sống cộng sinh.
1.1.5. Phân loại nấm sợi.
Vi nấm là thuật ngữ dùng đểchỉtất cảcác loại nấm hiển vi (nấm men và nấm sợi) không sinh quảthểlớn (mũnấm).Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ởthời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểmsinh lý sinh hóa và phương thức sinh sản. Các phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử được sửdụng ít trong phân loại vi nấm.
Nhà nấm học Italia P.A.Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu vềnấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷyếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủtrong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi)của G. C. Ainsworth và cộng sự(Vol 1, 2.3.4A.4B. New York and London: Academic Press, 1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ8 cuốn Từ điển vềnấm (Dictionary of the Fungi)của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum):
- Ngành Chytridiomycota
- Ngành Zygomycota
- Ngành Ascomycota
- Ngành Basidiomycota.
Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhómNấm bất toàn – Fungi imperfecti. Theo hệthống phân loại của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp- Lớp Deuteromyceteskhi phát hiện thấy cơquan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên loài và xếp sang các lớp khác. Ví dụnấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơquan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành loàiGibberella fujikuroi.Các Nấm bất toànhiện được xếp trong các nhóm conidial Ascomyceteshay conidial Basidiomycetes.
Nấm bất toàn (Deuteromycota),nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J.Carlile et al, 2001).Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm [26].
Khóa phân loại đến lớp (Robert A.Samson, 1984):
1. Lớp nấm túi (Ascomycetses): bào tửsinh ra trong túi bào tử.
2. Lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes)bào tửkín sinh ra trong các nang bào tửkín, hệsợi không có hoặc có ít vách ngăn.
3. Lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes): sợi nấm có vách ngăn, bào tửtrần. Theo hệthống phân loại căn cứvào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:
- Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tửtrần ởtrên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá).
- Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tửtrần ởtrong các thểquả(Fruit - body) gọi là các conidiomata[11].
- Nhóm Agonomycetes: gồm các nấm bất toàn không có bào tửtrần.
4. Lớp nấm đảm (Bacidiomycetes): sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính sốít bằng bào tửtrần, chủyếu bằng bào tử đảm [25].
Người ta cho rằng trong tựnhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 loài, Trung Quốc đã điều tra được 40 000 loài. Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ởnước ta hiện mới chỉphát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệsinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệvi nấm ởViệt Nam và có nhiều khảnăng tìm thấy những loài mới trong quá trình nghiên cứu [25].
Hiện tồn tại nhiều hệthống phân loại nấm không thống nhất với nhau, có nhiều khóa phân loại đã được sửdụng như: Saccardo P.A (1880- 1886), Barron G.L (1968)
Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G.C (1973), V.Arx (1981), Bùi Xuân Đồng (1984), Alexopoulos & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Nguyễn Đức Lượng (2003), Persoon ex Gray (1801). Sựphân loại vi nấm đang ởthời kỳphân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt đầu dựa vào sựphát triển của sinh học phân tử. Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tảtrong các khóa phân loại: Nguyễn Lân Dũng (2000)(trong tài liệu này có khóa phân loại của Saccardo P.A (cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972)), Bùi Xuân Đồng (1984), Nguyễn Đức Lượng (2003), Đặng Hồng Miên (1999).
1.1.6. Ứng dụng của nấm sợi
Một sốloài nấm sợi rất hữu ích trong sản xuất và đời sống (Penicillium notatumtổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvumtổng hợp nên griseofulvin...), nấm Aspergillus nigertổng hợp các acid hữu cơnhưacid citric, acid gluconic, nấm Gibberella fujikuroitổng hợp kích thích tốgibberellin và một sốloài nấm thuộc nhóm Phycomycetinahay Deuteromycetinacó thểký sinh trên côn trùng gây hại qua đó có thểdùng làm thiên địch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với thực vật nhưnấm rễ(Mycorrhizae), giúp cho rễcây hút được nhiều hơn lượng phân vô cơkhó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng.
Nấm còn là đối tượng nghiên cứu vềdi truyền học nhưnấm Neurospora crassa, nấm Physarum polycephalum dùng đểtổng hợp DNA và những nghiên cứu khác.Bên cạnh đó, Nấm sợi có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cách làm hưhỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trong chếbiến, bảo quản. Nấm sợi còn gây hưhại vật dụng, quần áo... hay gây bệnh cho người, động vật khác và cây trồng. Một sốloài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candidagây bệnh trên người, Microsporumgây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatusgây bệnh trên chim; Saprolegniavà Achlyagây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... đặc biệt nấm Aspergilus flavusvà Aspergillus fumigatusphát triển trên ngũcốc trong điều kiện thuận lợi sinh ra độc tốaflatoxin. Ngoài ra, các qui trình chếbiến thực phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sựcó mặt của VSV trong đó có nấm sợi. Nấm sợi cũng giúp tổng hợp acid hữu cơ(acid oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin),kích thích tố(gibberellin, auxin, cytokinin), một sốenzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược ... đã được sửdụng rộng rãi trên thếgiới, nấm sợi còn giữvai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơtrảlại độmàu mỡcho đất trồng. Đặc biệt, nấm sợi có khảnăng tổng hợp rất nhiều loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin…) [23].
1.2. Chất kháng sinh từ nấm sợi
1.2.1. Lịch sử tìm ra chất kháng sinh từ nấm sợi
Năm 1928, ởbệnh viện Saint Marie, chất kháng sinh được phát hiện tình cờ.Trong khi làm vệsinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiếm nấm sợi Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm.
Khi ông cấy nấm sợi trên thửnghiệm lại trên một sốloài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tựxảy ra. Từ đó, ông kết luận là nấm sợi đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sửdụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929).Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được sựquan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thếgiới, trong đó có các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bềmặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổlực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chếphẩm tinh chếvà do đó vấn đề penicillin tạm thời bịlãng quên. Mãi đến 1945, ông mới nhận được giải Nobel[1], [19].
Năm 1938, ởOxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicilliumvào sản xuất thử.Và sau hai năm đã tinh chếmột lượng penicillin đủ đểthửnghiệm trên chuột thí nghiệm và kết quả điều trị đã thành công Mỹmãn ngày 25/05/1940 và mởra kỷnguyên dùng kháng sinh để điều trịbệnh nhiễm trùng [1], [19].
Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tửcủa penicillin.Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrumcó khảnăng sinh kháng tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatumtìm ra trước đó. Năm 1946-1950, hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủyếu là Penicillium, khẳng định giá trịto lớn của Penicillin sửdụng trong chữa bệnh[27].
Tiếp theoPenicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện. Streptomicin: Năm 1944, Waksman và Schatz phân lập được chủng Streptomyces grieus(sau này đổi tên là Streptomyces streptomixin) có khảnăng sinh tổng hợp Streptomicin và cho đến nay nó mang nhiều tên khác nhau như: Streptomicin, Strepocvin, Strizolin. Loại kháng sinh nay có thểtiêu diệt nhiều VSV khác nhau (cảGram dương và Gram âm) [26].
Tetraxyclin: Đây là nhóm kháng sinh có chung một phân nhóm –N(CH3)2, nhóm CONH2, nhóm phenohydroxyl và hai hệthống nối đôi liên hợp chứa etol và enol. Nhóm tetraxyclin có nhiều loại. Các loại tetraxyclin được ứng dụng nhiều trong chữa bệnh cho người và gia súc bao gồm: Tetraxyclin, Clotetraxyclin, Oxytetraxyclin, Demetyltetraxyclin. Sản phẩm Tetraxyclin hiện nay có bán trên thịtrường được sản xuất bằng phương pháp sinh học và phương pháp hoá học từClotetraxyclin. Kháng sinh Tetraxyclin có khảnăng tiêu diệt vi khuẩn Gram âm tốt hơn vi khuẩn Gram dương. Trong sản xuất kháng sinh này, người ta thường sửdụng Streptomyces aureofaciensvà Str.Rimosus[26].
Cephalosporin: Năm 1948, Brotzu chiết từchủng nấm sợi thuộc giống Cephalosporium sp có khảnăng chống được cảVK Gram dương và VK Gram âm đặc biệt là Vibriocholerac. Ngày nay, người ta phát hiện nhiều loại nấm, xạkhuẩn và vi khuẩn khác nhau có khảnăng tổng hợp cephalosporin. Tuy nhiên, hoạt tính của Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin.
Griseofulvin:Năm 1959, Oxford và đồng sựphát hiện do chiết được từmột sốloài nấm sợi thuộc giống Penicillium (Pen. Urticae, Pen. Nigricans, Pen. Raistrichi..).Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có khảnăng chống nấm khá mạnh nên dùng đểchữa bệnh nấm cho người và gia súc.
Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòngpenicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp.
Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo. Kháng sinh được chiết suất từnấm sợi nhưCitrinin (P.citrinum), Fumagilin (A. fumigatus), Nudulin (A. nidulans), Humicolin (A. humicola), Viridin (T.viride)…
Có nhiều công trình nghiên cứu về Trichoderma, đã xác định nó có khảnăng chữa bệnh.Trong đó chú ý nhất là loài Trichoderma viride, phân tán khắp nơi trong đất.
Glytoxin là chất kháng sinh từgiống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài loàiPenicillium[19].
1.2.2. Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh từ nấm sợi
* Chất kháng sinh được hiểu là chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổbiến nhất là từvi sinh vật) với đặc tính là ởngay nồng độthấp (hoặc rất thấp) đã có khảnăng ức chếmạnh mẽhoặc tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tếbào ung thư(ởnồng độthấp: 10-3- 10-2/ µg /ml) mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị[2].
* Có giảthiết cho rằng chất kháng sinh là cơchếgiúp cho vi sinh vật tồn tại trong tựnhiên hoặc cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Cũng có giảthiết lại cho rằng chất kháng sinh chỉlà sản phẩm thải trong quá trình trao đổi chất của tếbào[3].Thường các CKS không có chức năng rõ rệt đối với tếbào sản sinh ra chúng.Sựmất khảnăng hình thành CKS không làmmất khảnăng sinh trưởng.
* Bản chất của chất kháng sinh: CKS là nhóm chất rất đa dạng vềmặt hóa học, trọng lượng phân tửbiến động trong khoảng 150 - 5000 Dalton. Trong một sốkháng sinh chỉchứa cacbon (C), hiđrô (H) hoặc thường chứa C, H, O, N, một sốkhác còn có S, P, halogen.
Trong phân tửkháng sinh thường chứa các nhóm chức như: hydroxyl (-OH), cacboxyl (COOH), cacbonyl (-CO), các nhóm định chức chứa nitơ...đồng thời có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ(mạch béo, vòng béo, vòng thơm, polipeptit, dịvòng cacbonhydrat..). Cho đến nay, CKS đều ởthểrắn, có cấu tạo hóa học rất khác nhau [19], gồm các nhóm sau:
Nhóm β - lactam: chứa hệthống vòng β - lactam, dịvòng phức tạp như Penicillin, Monolactam, Cephalosporin và hàng loạt nấm khác cũng sản sinh ra CKS chứa hệthống vòng này.
Nhómaminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glucoside, nhưstreptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin…
Nhóm teracylin: có cấu tạo hóa học vòng naphthalen, gồm clotetraxyclin, oxytetraxyclin, tetraxyclin… có phổkháng khuẩn lớn.
Nhóm macrolit: chứa vòng laton lớn nối với aminosacaroza và nhóm polyen, tiêu biểu là erythromycin.
Nhóm polipeptit: có cấu tạo gồm các axít amin [20].
* Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân loại CKS theo nguyên tắc sau:
- Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh.
- Phân loại theo phổkháng sinh.
- Phân loại theo cơchếtác dụng hay cơchếsinh tổng hợp ra CKS đó.
- Phân loại theo cấu tạo hóa học.
* Cơchếtác động của kháng sinh lên vi sinh vật [25].
Cơ chế tác động của CKS phụthuộc vào bản chất hóa học, nồng độchếphẩm, cấu trúc hiển vi của tếbào VSV và điều kiện biểu hiện của chúng. Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đó gắn kiền với cơchếtác động. Cơchếtác động của CKS cóthể được chia thành các nhóm cơbản sau:
- Ức chếquá trình tổng hợp của thành tếbào (vỏ) của vi khuẩn. Các nhóm KS gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp thành tếbào nên làm cho vi khuẩn dễbịcác đại thực bào phá vỡdo thay đổi áp xuất thẩm thấu.
- Ức chếchức năng họat động của màng tếbào. Các nhóm kháng sinh gồm có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơchếlàm mất chức năng của màng làm cho các phân tửcó khối lượng lớn và các ion bịthoát ra ngoài.
- Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.CKS thuộc nhóm này gồm nhiều chất nhưstreptomyxin, erythromixin, tetraxilin, cloramphenicol... gây cản trởtổng hợp prôtêin.
Tác động của một sốloại CKS này nhưsau:
Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác.
Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide.
- Ức chếquá trình tổng hợp acid nucleic.
Các CKS có thểgắn vào axít nuclêic (AND, ARN) tạo thành phức phân tửbất hoạt, ngăn cản sựsao chép của các axít này.
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) .
Nhóm quinolone ức chếtác dụng của enzyme DNA -gyrase làm cho hai mạchđơn của DNA không thểduỗi xoắn làmngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chếquá trình tạo acid nuclêic [25].
CKS nhómnày thì rất độc không những đối với VSV mà còn độc cho người và các VSV khác [8].
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi.
Trong quá trình sống, cơthểvi sinh vật thường xuyên trao đổi chất với môi trường ngoài tạo ra các sản phẩm trao đổi chất khác nhau [19].
- Sản phẩm trao đổi chất sơcấp là những sản phẩm cần thiết cho sựsống của tếbào, chúng là những vật chất tham gia xây dựng tếbào nhưcác axít amin, vitamin, nuclêôtic.
- Sản phẩm trao đổi chất thứcấp là những sản phẩm vềmặt hóa học là những hợp chất có cấu tạo cực kỳphức tạp, chúng không có chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tếbào nhưchất kháng sinh, giberelin, độc tốnấm, các polysacarit [19].
* Quá trình tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tốtrong đó có thành phần môi trường (nguồn cacbon, nitơ, nguyên tốvi lượng, phương pháp nuôi cấy, tuổi giống, độthông khí…) và điều kiện nuôi cấy. Vì vậy khi nuôi cấy chúng ta tìm điều kiện tối ưu cho các yếu tốtrên đểhiệu suất tổng hợp chất kháng sinh cao nhất [19].
- Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn. Tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp nhưcác loại đường đơn nhưglucose, manitol, các loại đường kép nhưsaccarose, lactose, cũng có thểlà các loại đường đa nhưtinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định nhưrỉ đường… Có nhiều chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza caonên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là CMC [8].
- Nguồn nitơvà nồng độ nitơtrong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sựdưthừa các ion amin hoặc các nitơchuyển hóa nhanh khác sẽ ức chếsinh tổng hợp chất kháng sinh.Quá trình sinh tổng hợp CKS ởnấm sợi thường cần cả2 nguồn nitơhữu cơvà vô cơtrong môi trường [19].
- Vai trò của phốt phát vô cơcũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sựtổng hợp CKS. Nồng độphốt phát thích hợp cho sinh tổng hợp CKS không quá 10mg/ml. Nồng độphốt phát ban đầu cao sẽlàm tăng lượng axít nuclêic trong tếbào, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tếbào dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS. Ngoài ra sựdưthừa phốtphát cũng ức chếtổng hợp các enzymtham gia vào quá trình tổng hợp CKS[19].
- Nhiệt độtối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng từ28- 300C. Sinh tổng hợp CKS phụthuộc đáng kểvào pH môi trường, pH thích hợp cho việc tổng hợp CKS là trung tính, môi trường hơi ngảvềaxít, pH axít hay kiềm đều ức chếquá trình tổng hợp CKS[20].
- Ngoài ra chất lượng bào tửcủa giống, tuổi, khảnăng đồng đều vềmặt di truyền, hoạt tính trao đổi chất cũng ảnh hưởng đến khảnăng tổng hợp CKS[19].
1.2.4. Chiết tách chất kháng sinh từ nấm sợi
Phần lớn các chủng sản sinh chất kháng sinh và tiết ra môi trường xung quanh, nhưng có 1 số chủng chỉ tiết 1 phần nào vào môi trường còn chủ yếu vẫn nằm trong sinh khối. Tuy nhiên cũng có những chủng, chất kháng sinh chỉ được tích tụ ở trong sinh khối.Để lựa chọn được phương pháp tách chiết chất kháng sinh phù hợp phải dựa vào bản chất hóa học của chất kháng sinh. Các chất kháng sinh có thể tan trong nước hoặc tan trong các dung môi hữu cơ. Đối với những chất tan trong dung môi hữu cơ dễ tinh sạch hơn so với tan trong nước. Thông thường nếu kháng sinh nằm trong dịch nuôi cấy có thể lựa chọn các phương pháp: chiết rút bằng các dung môi không hỗn hợp với nước, kết tủa thành dạng hợp chất không hòa tan hoặc hấp thụ bằng nhựa trao đổi ion, còn nếu chất kháng sinh trong sinh khối tế bào có thể chiết rút bằng các dung môi hữu cơ. Trước khi tiến hành chiết rút kháng sinh ra khỏi môi trường nuôi cấy, cần phải loại bỏ sinh khối tế bào ra khỏi dịch nuôi bằng phương pháp lọc hay li tâm[21].
Khi sử dụng phương pháp lọc để loại bỏ sinh khối, một điều cần lưu ý là ph của dung dịch nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến việc chất kháng sinh đi ra môi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều. Ví dụ nếu pH của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces rimosusthấp (axit), kháng sinh oxytetracylin đi ra môi trường nhiều, ngược lại nếu pH kiềm thì kháng sinh tích tụ trong sinh khối nhiều hơn [16].
Đối với các dịch lên men có độ nhớt cao thường gây khó khăn cho quá trình lọc. Vì vậy để khắc phục người ta thường bổ sung một số chất trợ lọc giúp cho quá trình lọc diễn ra tốt hơn
Phương pháp ly tâm không những loại được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất không có lợi ra khỏi dịch nuôi cấy. Tốc độ ly tâm được sử dụng với mục đích này là 15.000 vòng/phút
Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối
Trước khi tách chiết, cần phải rửa sinh khối bằng nước để loại bỏ các thành phần của môi trường.Chiết rút là phương pháp thích hợp nhất để tách chiết chất kháng sinh ra khỏi sinh khối tế bào. Hiệu suất tách chiết phụ thuộc vào khả năng hòa tan của chất kháng sinh ra khỏi sinh trong dung môi chiết. Các dung môi hữu cơ dùng để tách chiết chất kháng sinh có thể là: butanol, metanol, etyl axetat, axeton,... Trong đó, methanol là dung môi thường được dùng để tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối có hiệu quả
Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc
Các chất kháng sinh có trọng lượng phân tử thấp thường hòa tan trong nước và trong dung môi hữu cơ. Để tách chiết có hiệu quả cần phải lựa chọn các loại dung môi hòa tan chất kháng sinh và có thể bổ sung một số chất như: axit oleic, axit palmitic... vào dịch lọc để làm tăng khả năng hòa tan của chất kháng sinh. Dung môi có chứa chất kháng sinh được cô ở điều kiện chân không và nhiệt độ thấp (dưới 600C) để loại bỏ dung môi.
Chất kháng sinh nhận được từ dịch lọc hoặc chất kháng sinh được làm sạch hóa học bằng cách cô đặc hoặc loại bỏ tạp chất.Điểm đáng chú ý là các chất kháng sinh thường bị mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao, axit và kiềm cao. Do vậy khi tách chiết và tinh sạch, phải sử dụng các điềi kiện thích hợp sao cho chất kháng sinh giữ được hoặc tính.
Phương pháp cơ bản để tinh sạch chất kháng sinh
Phương pháp rút chiết: phương pháp này làm sạch chất kháng sinh nhiều lần bằng tách chiết dung môi, sau đó kết tủa và tinh chế
Phương pháp hấp thụ trao đổi ion: phương pháp này dựa trên bản chất hóa học của chất kháng là axit, kiềm hay là hợp chất vô định hình được hấp thụ dựa trên nhựa trao đổi ion mang điện tích dương hay âm, dạng catinoit hay anionit trong cột, sau đó sử dụng dung dịch để thổi chất kháng sinh ra khỏi nhựa ion. Dung dịch kháng sinh nhận được sẽ có độ sạch hơn.
Phương pháp kết tủa: phương pháp này dựa trên bản chất hóa học của chất kháng là chất hữu cơ hay vô cơ có thể kết tủa. Chất kết tủa nhận được bằng cách lọc hay ly tâm. Sau đó sấy khô nhận được chất kháng sinh ở dạng bột tinh sạch hơn
Tinh chế chất kháng sinh
Để chất kháng có độ tinh khiết cao hơn cần sử phương pháp kết tinh.Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế các hợp chất ở dạng rắn. Sự kết tinh có thể thực hiện bằng cách giảm nhiệt độ hay bằng cách thay đổi hệ dung môi. Dung môi chứa các vệ chất kháng sinh cuối cùng của quá trình kết tinh có thể loại bỏ bằng cách cô chân không. Các phương pháp: sắc ký hấp thụ, sắc ký bán mỏng hay sắc ký lòng cao áp là những phương pháp tinh chế chất kháng sinh rất có hiệu quả.
1.3. Ứng dụng của kháng sinh từ nấm sợi ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.1. Việt Nam
Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phòng chống côn trùng gây hại cây trồng [11],[14].
Ngày nay, các biện pháp kiểm soát sinh học các loại côn trùng gây hại có hiệu quả và an toàn cho môi trường đang được quan tâm. Tuy biện pháp này có tác dụng chậm hơn song không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng tới các sinh vật khác. Và có nhiều loài VSV được sửdụng trong kiểm soát sinh học nhưvi khuẩn, nấm sợi, virút. Ở Việt Nam, vào những năm 70 của thế kỷ20 cũng có những công trình nghiên cứu vềnấm diệt côn trùng và ứng dụng sản xuất chế phẩm diệt côn trùng.
Các kết quảnghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt đới đã cho thấy vai trò của nấm sợi đối với cây trồng.Nhưnấm Trichoderma có khảnăng tiêu diệt nấm Fusarium solani(gây bệnh thối rễ). Hoặc đểphòng trừbệnh thối gốc chảy mũtrên cây bưởi (do nấm Phytopthorasp gây ra) thì dùng một kg nấm Trichoderma harzianum trộn đều với 40 kg phân chuồng, rồi rải xung quanh cây từ3- 5 (kg thùy theo cây lớn nhỏ)[22].
Dùng các chủng nấm Trichoderma xửlí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm sợi với phân chuồng hoại mục trước khi bón ruộng 5- 10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chếbệnh khô vằn hại bắp [18].
Hiện nay các chủng Trichoderma ssp đã được sửdụng rộng rãi trong các chếphẩm sinh học thương mại như: GlioGard- một chếphẩm với thành phần chính là Trichoderma virensngăn chặn sựúng thối của cây con. Chếphẩm Trichodex với Trichoderma harzianum là thành phần chính kết hợp với Trichoderma polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trịcác vết thương đã bịnhiễm trùng ở cây trồng.
Các công trình nghiên cứu của các sinh viên khoa sinh trường Đại học Sư Phạm, trường Đại học Khoa học tựnhiên, Hà Nội vềcác nấm sợi phân lập từrừng ngập mặn ởViệt Nam có các hoạt tính đối kháng với các nấmgây bệnh cho cây trống và các côn trùng gây hại cây trồng, nghiên cứu đặc điểm của nấm sợi Trichoderma, nghiên cứu vềtính đa dạng và vai trò của nấm sợi, khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi, khảo sát khảnăng kí sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM…v..v…Theo công trình nghiên cứu của tác giảMai ThịHằng, các chủng nấm sợi phân lập được từrừng ngập mặn ởmột sốvùng Nam Định, Thái Bình còn thểhiện hoạt tính diệt sâu tơmạnh trong đó có chủng P.farinosusNT 33, thểhiện hoạt tính đối kháng cao với các loại vi sinh vật có hại cho cây trồng [15].
Sử dụng kháng sinh phòng chống bệnh cho người và động vật
Các bệnh nhiễm khuẩn, nhờ có thuốc kháng sinh và vacxin được khống chế ở các nước phát triển.Nhưng ởcác nước đang phát triển thì nhiễm khuẩn vẫn là vấn đề rất nặng nề. Bên cạnh những bệnh nhiễm khuẩn cũthì gần đây còn nổi lên một số bệnh nhiễm khuẩn mới nhưdo E.coligây tiêu chảy, xuất huyết tiêu hoá và tiết niệu (do nhóm EHEC), hoặc gây viêm loét dạdày do Helicobacter pylori. Vi khuẩn này còn là căn nguyên gây ung thưdạdày[21]
Trong đó có Việt Nam xuất hiện một loại dịch bệnh viêm phổi cực kỳnguy hiểm (SARS), do một loại virus mới giống như Coronaviridaevà gọi là virus SARS-COV. Tuy chưa lây lan ra toàn cầu và sốngười nhiễm khoảng 8000 người, nhưng tỷlệtửvong khá cao (gần 10%)[1].
Từ khi Penicillin được sản xuất đề đưa vào điều trị, sựphát triển của kỹthuật công nghệkháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụhữu hiệu trong việc kiểm soát và khống chếcác bệnh nhiễm khuẩn.Việc sản xuất CKS, sửdụng CKS trong trịliệu cùng với thời gian, nhiều chếphẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời. Hiện nay, vi khuẩn Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus đã kháng thuốc [Levy, 1998] [20].
Ứng dụng KS từ nấm sợi trong điều trịbệnh truyền nhiễm và hiện tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh.
Chương 2: QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM
2.1.Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
2.1.1. Địa điểm:
2.1.2. Thời gian
2.2. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
2.3. Môi trường nghiên cứu
2.4. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm sợi từ đất vườn tỉnh Bình Dương
tỉnh Bình Dương ở các vị trí lấy mẫu.
VSV kiểm
định
Số
chủng
nấm khảo sát
Họat tính kháng sinh
(D - d, mm)
Tổng số
chủng có
hoạt tính
KS
Mức độ họat tính
Yếu
Trung bình
Mạnh
Rất mạnh
B. subtilis
81
27
48
1
0
76
Tỉ lệ
100%
33,3%
59,3%
1,23%
0%
93,82%
E. coli
81
9
14
0
0
23
Tỉ lệ
100%
11,11%
17.28%
0%
0%
28,39%
3.3. Định danh đến chi cho chủng nấm Đ2.4
Kết quả
STT
Dung môi
Hoạt tính kháng sinh (D-d,mm)
Tr-Đ2.4
Đối chứng
1
Hexan
0
0
2
Diethyl eter
5 ± 0.16
0
3
Cloroform
18 ± 0.32
0
4
Ethyl axetat
0
0
5
Methanol
5 ± 0.25
0
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
1. Kết luận
2. Khuyến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO