Nghiên cứu xác định vùng axit amin trên Rad52 chịu trách nhiệm chính cho tương tác giữa hai protein Mus81 và Rad52.pdf

NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2017 -2018 Tên đề tài: Nghiên cứu xác định vùng axit amin Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác hai protein Mus81 Rad52 Số hợp đồng: 2017.01.02/HĐ-KHCN Chú nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Thu Hường Đơn vị công tác: Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng TP Hồ Chí Minh, ngày thảng 12 năm 2017 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2017-2018 Tên đề tài: Nghiên cứu xác định vùng axit amin Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác hai protein Mus81 Rad52 Sổ hợp đồng: 2017.01.02/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: TS Phùng Thị Thu Hường Đơn vị công tác: Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng Các thành viên phổi họp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Nguyền Lương Hiếu Hòa Õng Đăng Quang Sinh học Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao NTT Viện Kì thuật Công nghệ cao NTT Sinh học Ký tên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI • DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 NỘI DUNG NGHIÊN cứu 15 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 2.1 Tinh phức hợp Mus81-Mms4 và phân đoạn Rad52 tái tổ họp từ hệ thống biểu E coli cột sắc kí trao đổi ion cột lực 15 2.2 Thực phản ứng kiểm tra hoạt tính endonuclease phức họp Mus81-Mms4 chất thích họp có mặt/vắng mặt phân đoạn Rad52 17 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 Tinh protein Mus81-Mms4 tái tố hợp 19 Tinh Rad52 phân đoạn protein 19 Lập đồ vùng Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức Rad52 Mus81-Mms4 21 CHƯƠNG KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BĨ 27 BÁO CÁO sử DỤNG KINH PHÍ PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẢT HJs: mối nối Holliday MMS: methyl methanesulfonate RTR: Sgsl-Top3-Rmil HRR: tái tổ hợp tương đồng IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside NP40: Nonidet P40 IDZ: imidazole GG: độ lắng đọng mật độ gradient khác glycerol SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: SDS-polyacrylamide gel electrophoresis PHỤ LỤC 2: DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình Chức phức hợp Mus81 việc sửa chừa chạc chép dừng/lồi Hình Đặc hiệu chất chức loại protein khác thuộc họ XPF/Mus81 10 Hình Các chất ADN đặc hiệu phức hợp Mus81-Mms4 in vitro 11 Hình Con đường xử lý phân tử ADN tái tố hợp trung gian nấm men 12 Hình Tinh phức hợp Mus81-Mms4 19 Hình Ket tinh protein Rad5 234-504 20 Hình Vùng đầu N vùng Rad52 từ axit amin thứ 34 đến 327 chứa domain chịu trách nhiệm cho tương tác chức Rad52 phức họp Mus81-Mms4 21 Hình Lập đồ phân vùng Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức với Mus81-Mms4 22 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sán phẩn đăng ký thuyết minh Một báo đăng tạp chí ISI uy tín: Một báo đăng tạp chí qc tê uy tín YEAST (Impact factor 2.3) Thời gian đăng ký: từ ngày 1-1-2017 đến ngày 31-12-2017 Thòi gian nộp báo cáo: ngày MỞ ĐÀU (ABSTRACT) Mus81 endonuclease có tính bão tồn cắt cấu trúc ADN đặc trưng thuộc họ protein XPF/Radl tham gia vào đường sữa chữa nucleotide Mus81 tạo phức họp với protein không xúc tác, Emel người Schizosaccharomyces pombe, Mms4 Saccharomyces cerevỉsiae Phức họp Mus81 có khả cắt hiệu in vitro nhiều cấu trúc ADN nhánh mà hình thành in vivo te bào sứa chữa chạc chép dừng/khóa ADN lỗi tái tổ họp Tuy nhiên, việc cắt hạn chế mối nối Holliday (HJs) nguyên vẹn nói lên Mus81-Mms4 cần thêm protein trợ giúp để cắt HJs hiệu quà in vivo Vùng đầu N cùa Mus81 đóng vai trị thiết yếu tương tác Mus81 nhiều protein khác, thiếu hụt vùng gây nhiều tổn thương nghiêm trọng cho tế bào Chúng tin để trì ổn định cùa gene, Mus81-Mms4 can phối hợp với protein khác tham gia vào việc sữa chữa ADN, ổn định chạc chép, chế biến phân từ trung gian tái tổ họp s cerevisiae, tái tổ hợp tương đong kiểm sốt nhóm protein át che RAD52 bao gom Rad52, enzyme xúc tác bước q trình tìm kiếm trình tự tương đồng Những bang chứng gần cho thấy Mus81 hoạt động phía đường sửa chữa bang tái to hợp theo cách song song dư thừa với Sgsl, thành viên thuộc họ enzyme helicase ADN ubiquitous RecỌ, để xữ lý phân tữ trung gian tái tổ họp độc tính Mus81 Rad52 chứng minh có tương tác hiệp đong mặt di truyền Trong nghiên cứu trước, tiến hành nghiên cứu tương tác ve mặt chức phức họp Mus81-Mms4 Rad52 nấm men Với protein tái tổ hợp tinh từ E coli, chung chứng minh ràng Rad52 Mus81-Mms4 có tương tác ve mặt chức năng, cụ the có mặt cùa Rad52 tăng cường hoạt tính endonuclease cùa Mus81 -Mms4 nhiều chất ưa thích, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân đoạn Rad52 lập bàn đồ vùng Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức Mus81-Mms4 Rad52 K.ểt thu thể vùng chức đầu N Rad52, domain chịu trách nhiệm cho tương tác Rad52 ADN phân từ Rad52 với vùng quan trọng cần thiết cho tương tác chức với Mus81-Mms4 Những kết the rõ ràng rang nấm men Rad52 Mus81 -Mms4 phoi họp hoạt động việc xứ lý phân tữ trung gian tái tổ họp tương đồng CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU Hệ gene cùa tất te bào phải trài qua trình nhân đơi lần chu trình té bào đề tạo tế bào giống hệt mặt di truyền Q trình kiểm sốt điều khiển chặt chẽ nhằm bào tồn tính bền vững thơng tin di truyền Trong q trình chép ADN, nhiều rào càn cản trở di chuyển thơng thường chạc chép ADN, ví dụ thưởng tổn ADN hay protein bám dính ADN Thất bại việc sừa chữa khắc phục chạc chép lồi dẫn đen việc tái sap xếp lại hệ gene, qua có the khiến te bào rơi vào tình trạng bệnh lý chí bị chét Do te bào cần trợ giúp nhiều đường sữa chữa khác nhằm tránh hậu quà xấu sai sót xảy việc chép ADN Một đường thơng qua tái tổ hợp, trình cần hình thành phân từ ADN nhánh trung gian mà cách vật lý liên kết hai sợi nhiễm sắc lại với Sự tích tụ cùa phân tứ ADN nhánh trung gian có thề gây độc cho te bào cần phái xứ lý phân giải thông qua hoạt động "dissolution" tháo mờ xoắn cùa enzyme helicaza (ví dụ Sgsl) hoạt động cất endonucleotic loại enzyme endonucleaza chọn lọc cấu trúc chất ADN (ví dụ Mus81) Mus81 enzyme endonuclease cat cấu trúc ADN đặc trưng protein có tính bảo ton cao Mus81 thuộc họ protein XPF/Radl tham gia vào trình sứa chữa nucleotide lồi (Osman Whitby, 2007) Các thành viên họ XPF/Radl chứa cặp motif helix-hairpin-helix (HhH) domain xúc tác nam đau c có tính bảo ton với tâm hoạt động ERKX3D (Osman Whitby, 2007) Trên Mus81, motif HhH định vị cà hai đầu N c, protein khác thuộc họ XPF motif HhH lại chì nam đầu c Các motif HhH có the có vai trị quan trọng việc liên kết cúa protein với ADN hình thành cấu trúc dimer, chúng can thiết cho hoạt tính nuclease enzyme (Newman et at., 2005; Chang et al„ 2008) Các protein thuộc họ XPF cùa sinh vật nhân chuẩn cần phài có protein hồ trợ khơng xúc tác mà can thiết cho tính ổn định hoạt tính nuclease cùa (Newman et al., 2005) Mus81 chi kích hoạt thành endonuclease cat cấu trúc ADN đặc trưng hình thành phức hợp dị dimer với protein hỗ trợ, tên Emel/EMEl nấm men phân đôi người, Mms4 nam men choi Gene MƯS81 nấm men nảy choi xác định thông qua phương pháp sàng lọc lai nam men hai pha sử dụng RAD54, nhân tố giống Swi2/Snf2 mà có nhiều vai trị khác trình tái tổ họp, làm “mồi bắt” (Interthal Heyer, 2000) Còn gene s cerevisiae MMS4 phân lập lần phương pháp bo sung chức cùa kiều hình nhạy càm với methyl methanesulfonate (MMS) chúng đột bien mms4-l (Xiao et al., 1998) Các thí nghiệm lai nấm men hai pha đong kết túa miễn dịch cho thấy vùng đầu c Mus81 lần Mms4 cần thiết đủ cho hình thành cùa phức hợp dị dimer hai protein (Kaliraman et al., 2001; Fu Xiao, 2003) Tuy nhiên, chi thay the axit amin đơn lẻ vị trí thứ 173 gan đầu N cùa Mms4 phá bị tương tác này, qua nói lên cấu trúc khơng gian ba chiều có vai trò quan trọng Mms4 đe tương tác với Mus81 (Fu Xiao, 2003) Cất chạc chép Trong tế bào nguyên phân, phức họp dị dimer cũa Mus81 Tổn thương ADN sợi tổng hợp liên tục cho tham gia vào Chạc chép dừng lại phân giãi cấu trúc ADN Cắt ngẳn đầu 3' chép tái tổ họp, cấu trúc mà hình thành suốt trình sữa chừa chạc • Đàu 5' Xâm lán tim đoạn tương đồng Mus81-Mms4 chép dừng/hỏng hay đứt gãy đơi ADN (Hình 4; Boddy et I cắt cấu trúc * vòng D al., 2000; Interthal Heyer, 2000; Mullen et al., 2001; Heyer Chạc chép khới động lại et al., 2003; Doe et al., 2002; Whitby et al., 2003; Osman Whitby, 2007) Các đột biến gene mus81 khiến te bào trở nên nhạy Hình Chức phức hợp Mus81 việc sừa chữa chạc chép dừng/lỗi Mus81 phân cắt chạc chép dừng cấu trúc ADN trung gian thông qua tái tổ hợp nhằm khởi động lại chạc chép cảm với nhân tố gây tổn thương ADN tia cực tím, methyl methanesulfonate (MMS), hydroxide urea, 2-phenul-33nitroso-imidazo [1,2-ot] pyrimidine, cisplatin, doxorubicin, tirapazamine, camptothecin XŨ lý tế bào với tia cực tím MMS gây nhiều tổn thương ADN cách ngăn chặn di chuyến cùa chạc chép tạo nhiều đứt gãy đôi ADN (Boddy, 2000; Interthal Heyer, 2000; Abraham et al., 2003; Fu Xiao, 2003; McPherson et al., 2004; Dendouga et al., 2005; Hartung et al., 2006; Hiyama et al., 2006) Phức họp Mus81-Mms4 phân cắt nhiều cấu trúc ADN khác in vitro bao gồm HJs có khía, vịng D, chạc chép, cờ 3’ (3’-flap), phân từ ADN mà hình thành nhiều đường chuyển hóa khác cùa ADN in vivo (Hình 3; Boddy et al., 2001; Kaliraman et al., 2001; Bastin-Shanower et al., 2003; Ciccia et al., 2003; Whitby et al., 2003) Substrate specificity in vitro (nuclease activity) Function Splayed arm s cerevisae Radl/RadlO H sapiens XPF/ERCC1 NER, ICL repair Nicked HJ Stalled fork repair, meiotic recombination Yeast Mus81/Emel and Mus81 / mms4 Replication fork Stalled fork repair, NER (?) p furiosus Hef Replication fork Stalled fork repair (?), NER (?) s solfataricus XPF Hình Đặc hiệu chất chức loại protein khác thuộc họ XPF/Mus81 Mũi tên vị trí cắt enzyme chất Chấm đen thể đầu 5' cùa ADN Các kí hiệu viết tắt: HJ: mối nối Holliday; NER (nucleotide excision repair): đường sửa chữa loại bỏ nucleotide; ICL (interstrand crosslink): nối sợi ADN; s cerevisae, Saccharomyces cerevisae; H sapiens, Homo sapiens; p furiosus, Pyrococcus furiosus; s solfataricus, Sulfolobus solfataricus (Roxanne et al., 2010) Vai trò cùa Mus81 phân cắt cấu trúc HJs nghiên cứu lần s pombe, nơi mà tất cà kiểu hình khơng bình thường đột biến xóa bỏ mus81 s pombe khắc phục việc biếu RusA, enzyme resolvase thực khuẩn thể có khả phân cắt HJs cách đặc hiệu (Boddy, 2000) Bên cạnh đó, Mus81 xác định enzyme phân cat HJs tinh lực phức hợp Mus81-Emel nấm men phân đơi cho thay hoạt tính đặc hiệu phân từ HJs nguyên vẹn (Chen et al., 2001; Boddy et al., 2001; Gaillard et al., 2003) Tuy nhiên, tinh phức họp Mus81 tự nhiên tái tổ họp 10 tham gia vào việc sữa chữa ADN phục hồi sau điểm kiểm soát, gần chứng minh có khả kích thích phân cat cùa phức họp Mus81 -Mms4 phân từ trung gian tái tổ họp (Chavdarova et al., 2015) Và tương tác mặt chức cùa hai enyme phụ thuộc vào tương tác vật lý chúng, cụ thể vùng đầu N Mus81 đóng vai trị then chốt đoi với tương tác (Chavdarova et al., 2015) Ket quà thống với khám phá trước tương tác Mus81 Rad27 phụ thuộc vào vùng đầu N cùa Mus81 (Phung et al., 2015) Ngoài ra, phan kết cùa cho thấy Mus81-Mms4 có tương tác chức với phức hợp Slxl-Slx4 khả nàng kích thích Slxl-Slx4 lên hoạt tính endonuclease Mus81-Mms4 phụ thuộc lớn vào vùng đầu N Mus81 (Phung et al., 2015) Điều quan trọng tương tác vật lý chức Mus81 đoi tác vơ cần thiết đoi với chức cùa Mus81 te bào, ví dụ việc tương tác chức Mus81 Rad27 dẫn đen việc Mus81 khơng the hồn thành tốt vai trị in vivo, đặc biệt có mặt ngoại độc tố gây tổn thương ADN, dần đen việc tích lũy tăng cao phân tữ ADN trung gian độc tính, sản phẩm đường sứa chữa tái tổ hợp Những ton thương gây thiết hụt phần chức cùa Mus81 trở nên rõ ràng nghiêm trọng vắng mặt Sgsl, chí dần đến tế bào khơng thể tồn (Phung et al., 2015, Chavdarova et al., 2015) 14 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu NỘI DUNG NGHIÊN cưu Mus81 Rad52, enzyme đóng vai trị quan trọng bước q trình tìm kiểm trình tự tương đồng cùa tái tổ hợp, chứng minh có mối liên hệ mặt di truyền khiếm khuyết sinh trưởng tổng họp (synthetic growth defect) - thơng qua phân tích tính chết the diploid bang microarray thông qua thu thập đột biến dị họp tử knockout cùa nấm men (Pan et al., 2006) Hơn Mus81 gene tìm thấy thơng qua sàng lọc tìm kiếm điểm foci tăng thêm Rad52-YFP ngầu nhiên, điểm mà đại diện cho vị trí tập trung cùa protein tham gia tái tổ họp (Alvaro et al., 2007) Do chúng tơi muốn tiến hành phân tích khả tương tác ve mặt chức hai enzyme Mus81 Rad52 in vitro nhằm hieu rõ ve tranh tương tác hai loại protein mức độ di truyền hóa sinh nấm men, từ có nhìn tổng quát ve chức cùa Mus81 đường tái tổ họp bên te bào Trước đây, với protein tái tổ hợp tinh từ E coli, chứng minh rang Rad52 Mus81 -Mms4 có tương tác mặt chức nàng, cụ the có mặt Rad52 tăng cường hoạt tính endonuclease cúa Mus81 -Mms4 nhiều chất ưa thích, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân đoạn Rad52 lập đo vùng Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức Mus81-Mms4 Rad52 Cách tiếp cận chúng tơi thơng qua việc phân tích so sánh hoạt tính endonuclease cùa phức hợp Mus81 -Mms4 tái tổ họp tinh chất ưa thích cùa điều kiện ống nghiệm với có mặt/vắng mặt cùa phân đoạn Rad52 tái to họp tinh Từ tiến hành lập bàn đo phân vùng protein Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức phức họp Mus81-Mms4 Rad52 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Tinh phức hợp Mus81-Mnis4 và phân đoạn Rad52 tái tổ họp từ hệ thong biểu E coli cột sắc kí trao đổi ion cột lực Tinh phức hợp Mus81-Mms4 tải tô hợp Plasmid pET28a-Mms4-Mus81 biểu vi khuẩn E coli chúng BL21- CodonPlus (DE3)-RIL Te bào nuôi cấy 37 °C protein cảm ứng biểu 0.5 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) chi số quang học OD vào khoảng 0,5- 0,7, tiếng nuôi lac nhiệt độ 25 °C Te bào thu hoạch bang phương pháp ly tâm, rữa với dịch đệm Tris trữ -80 °C Tủa te bào tái hòa tan dịch đệm ly giải H100 (25 mM HEPES-NaOH/pH 7,5; 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0.01% Nonidet P40 (NP40), 15 ức chế protease) Chì số Hioothể nồng độ cùa muối NaCl theo đơn vị mM Sau bước phá màng te bào bang sóng siêu âm cường độ cao, dịch ly giãi thô phân tách phương pháp ly tâm tốc độ 45000 vòng phút (v/p) 30 phút Dịch nồi đưa gan lên cột Phosphocellulose cân bang với dịch đệm H100 Cột sau rửa với lần the tích cột cùa dung dịch H150 đẩy bang gradient nong độ muối NaCl từ 150 đến 1000 mM đệm H Các phân đoạn đẩy kết họp điều chinh nồng độ muối thành 600 mM bổ sung 10 mM imidazole (IDZ, nồng độ cuối), ủ theo mé với hạt lực chọn lọc đuôi His (Ni-NTA) °C Sau hai bước rữa với dịch đệm Hóoo chứa 10 mM IDZ Hóoo chứa 50 mM IDZ, protein bám cột rữa đẩy với dịch đệm Hóoo chứa 200 mM IDZ Phân đoạn đay đỉnh (có nồng độ protein cao nhất) phân tách theo độ lang đọng mật độ gradient khác cùa glycerol (GG, ml, 15-35% glycerol đệm H300) 45000 v/p 24 tiếng Các phân đoạn (chứa khoảng 250 pl) thu nhận từ phía đáy cùa ống GG bang cách thu giọt dịch Những phân đoạn đinh sau trữ -80°C sữ dụng cho phân tích hóa sinh sau Tinh phân đoạn Rad52 tải tổ hợp Plasmid pET28b-Rad52 biếu vi khuẩn E coli chủng BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Te bào nuôi cấy 37 °C protein cảm ứng biểu 0.1 mM IPTG chì số quang học OD vào khống 0,8, tiếng nuôi lắc nhiệt độ 25 °C Te bào thu hoạch bang phương pháp ly tâm, rữa với dịch đệm Tris trữ -80 °C Tùa te bào tái hòa tan dịch đệm ly giải T200 (50 mM Tris-HCl/pH 8,0; 200 mM NaCl, 10% glycerol, 0.01% NP40, ức che protease) Sau bước phá màng te bào sóng siêu âm cường độ cao, dịch ly giải thô phân tách bang phương pháp ly tâm tốc độ 45000 v/p 30 phút Dịch đưa lên cột Q Sepharose, dịch chày qua đưa lên cột SP Sepharose Cột SP rữa day bang gradient nồng độ muối NaCl từ 200 đen 1000 mM IDZ đệm T sau bước với lần tích cột cùa dịch đệm T200 Các phân đoạn đẩy kết hợp điều chỉnh nồng độ muối thành 500 mM bổ sung 10 mM IDZ, đưa lên bám cột Ni-NTA Sau bốn bước rữa với dịch đệm T500 chứa 50 mM IDZ, T2000 chứa 40% ethylene glycol 50mM IDZ, T500 chứa 50 mM IDZ, T500 chứa 100 mM IDZ, protein bám cột rửa đẩy với dịch đệm T500 chứa 500 mM IDZ Phân đoạn đẩy đinh phân tách theo độ lắng đọng mật độ gradient khác cũa glycerol (GG, ml, 15-35% glycerol đệm H300) 45000 v/p 24 tiếng Các phân đoạn (chứa 12 giọt) thu nhận từ phía đáy ống GG Những phân đoạn đinh sau trữ -80°C 16 sử dụng cho phân tích hóa sinh sau Các phân đoạn khác cũa Rad52 biểu cách biến nạp pET28b-Rad52x-Y vào vi khuẩn E coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, X Y tương ứng với vị trí axit amin Rad52 Các phân đoạn protein sau tinh bang cách sử dụng lan lượt cột SP sepharose Ni-NTA giống mô tà với Rad52 2.2 Thực phản ứng kiểm tra hoạt tính endonuclease phức hợp Mus81-Mnis4 chất thích hợp cỏ mặt/vắng mật phân đoạn Rad52 Chuẩn bị chất ADN Cơ chất ADN chuẩn bị đánh dấu phóng xạ đau 5’ theo phương pháp mơ tà (Bae Seo, 2000) Tóm lược là, oligonucleotide đánh dấu phóng xạ đầu 5’ bang cách ghép thêm [y-32P] ATP nhờ hoạt tính cùa enzyme kinase polynucleotide T4 Sau oligo ghép nối với oligonucleotide khác Phàn ứng ghép noi thực máy PCR với chương trình chạy sau: 95 °C, phút; 65 °C, 30 phút; chu kì: 65 °C, phút, -0.5 °C/chu kì, 80 chu ki Cơ chất sau ghép nối tinh phương pháp điện di gel polyacrylamide 10% trước sử dụng Các oligo tổng hợp công ty Genotech (Daejeon, Hàn Quốc) [y-32P] ATP (>5000 Ci/mmol) cung cấp cơng ty IZOTOP (Budapest, Hungary) Vị trí đánh dấu phóng xạ the dấu hiệu * chất ADN tương ứng Phản tích hoạt tỉnh endonuclease cùa MusSl-Mnis4 Phân tích hoạt tính endonuclease Mus81 -Mms4 thực hồn hợp phản ứng (20 pl) chứa lượng enzyme kiểm tra, 10 fmol chất ADN, 25 mM Tris-HCl/pH 8.0, 100 mM NaCl (nồng độ cuối), mM MgCb, 5% glycerol, 0.1 mg/ml albumin huyết bò, 0.1% NP-40, 0.2 mM dithiothreitol Phàn ứng ũ 30 °C 30 phút, việc khữ protein hóa cách ù phán ứng với 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 10 pg enzyme proteinase K 37 °C 15 phút 1/6 the tích phản ứng 6X dung dịch dừng phản ứng (60 mM axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA)/pH 8.0, 40% sucrose, 0.6% SDS, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol) bổ sung vào để kết thúc phàn ứng endonuclease Sản phẩm sau kiểm tra phương pháp điện di gel polyacrylamide 40 phút 150 V 0.5X đệm TBE (45 mM Tris-HCl, 45 mM axit boric, mM EDTA) Tiếp theo gel làm khơ giấy DEAE-cellulose kiểm tra tín hiệu phóng xạ 17 tự phát Sãn phẩm ADN đánh dấu định lượng máy chụp hình tín hiệu Phốt (BAS-1500, FUJIFILM) 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tinh protein Mus81-Mms4 tái tổ hợp Chúng tiến hành tinh phức hợp Mus81-Mms4 theo phương pháp mô tà phần Phương pháp nghiên cứu Chất lượng cùa protein tái tổ họp sau tinh kiểm tra bang điện di gel polyacrylamide sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) (Hình A) Nong độ protein định lượng bang phương pháp phân tích protein Bradford đường chuẩn albumin bovine serum Tiếp theo hoạt tính phức hợp Mus81-Mms4 kiểm tra phân tích nuclease sữ dụng chất ADN cấu trúc 3’-flap, protein tái tổ họp biểu hoạt tính xúc tác hiệu quâ chất kì vọng (Hình B) Tóm lại, chúng tơi tinh thành cơng phức họp Mus81 -Mms4 cỏ hoạt tính cao, đạt độ can thiết đe phục vụ cho bước phân tích hóa sinh kDa ■160 100 Mms4Mus81- 70 50 35 27 Hình Tinh phức hợp Mus81-Mms4 A Độ khiết phức hợp Mus81-Mms4 tái tổ hợp sau tình Thang protein thể phía bên phải theo đơn vị kilo Dalton B Hoạt tính endonuclease phức hợp Mus81-Mms4 chất 3’-flap Lượng protein khác sử dụng để cắt 10 fmol chất 3’-flap 30 phút 30 °C thể Sản phẩm cắt (ADN đơi có khoảng trống) phân tích điện di gel polyacrylamide 10% Tinh Rad52 phân đoạn protein 19 kDa 106.5 97.6 ««-Rad52 50.2 36.9 28.9 Hình Kết tinh protein Rad5234-504 Protein tái tổ họp Rad52 biểu E coli tinh đến mức gần đồng thể (Hình 6) Rad52 bao gồm vùng với chức khác (Hình 7A) Vùng đầu N Rad52 tương tác với paralog cùa Rad59 chứa domain tự liên két với phân tữ Rad52 khác, cho phép multimer hóa thành dạng cấu trúc vòng heptamer Phan vùng đầu c Rad52 chứa domain liên kết với protein bám ADN sợi đơn RPA protein Rad51 Domain bám ADN cùa Rad52 nằm hai đầu N c cùa protein; chúng tương tác tốt với ADN sợi đơn sợi đôi ưa thích sợi đơn Rad52 có vùng tín hiệu khu trú nhân (NLS) chịu trách nhiệm cho việc đưa Rad52 vào nhân tế bào đây, vùng thuộc Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức với phức hợp Mus81-Mms4 khảo sát Đe đạt mục đích này, đau tiên chúng tơi phân Rad52 thành phân đoạn, gồm vùng chức đầu N vùng tương tác với RPA (Rad5 234-327) gom vùng chức đầu c (Rad5 2328-504) (Hình 7A) Hai phân đoạn tiến hành biểu tinh mô tả phần phương pháp Ket quà tinh the Hình 7B Tiếp theo chúng tơi tiến hành kiểm tra khà ành hưởng hai phân đoạn lên hoạt tính endonuclease phức họp Mus81-Mms4 Chúng tơi nhận thấy phân đoạn chứa vùng đầu c Rad52 khơng thể tăng cường hoạt tính phức họp, phân đoạn chứa vùng đầu N vùng cùa Rad52 có khả kích thích hoạt tính endonuclease cùa Mus81-Mms4 chất cách tương tự protein Rad52 (Hình 7C) Từ kết này, kết luận rang vùng chịu trách nhiệm cho tương tác chức Rad52 phức hợp Mus81-Mms4 nằm phân đoạn chứa đầu N vùng Rad52 từ axit amin thứ 34 đen 327 20 ... Rad52 lập bàn đồ vùng Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức Mus81- Mms4 Rad52 K.ểt thu thể vùng chức đầu N Rad52, domain chịu trách nhiệm cho tương tác Rad52 ADN phân từ Rad52 với vùng quan trọng... NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2017-2018 Tên đề tài: Nghiên cứu xác định vùng axit amin Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác hai protein Mus81 Rad52 Sổ hợp đồng: 2017.01.02/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề... (NLS) chịu trách nhiệm cho việc đưa Rad52 vào nhân tế bào đây, vùng thuộc Rad52 chịu trách nhiệm cho tương tác chức với phức hợp Mus81- Mms4 khảo sát Đe đạt mục đích này, đau tiên phân Rad52 thành