ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC & CÔNG NGHỆ SINH HỌC Dự án Thực tập Chuyên ngành Sinh hóa KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MÔI TRƯỜNG LÊN MEN THÍCH HỢP[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC & CÔNG NGHỆ SINH HỌC Dự án Thực tập Chuyên ngành Sinh hóa KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC MƠI TRƯỜNG LÊN MEN THÍCH HỢP ĐẾN SỰ SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS Giảng viên hướng dẫn: Trần Thị Diễm Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đình Ninh 19150416 Nguyễn Thanh Trang 19150490 TP.HCM, 11/2022 ĐẶT VẤN ĐỀ Protease enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực, đó, đặc biệt cơng nghiệp thực phẩm protease có đóng góp to lớn việc phục vụ, nâng cao đời sống người Hiện giới công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật phát triển, tìm tịi nghiên cứu khả ứng dụng enzyme protease Ở Việt Nam có nhiều cơng trình công bố việc nghiên cứu sử dụng protease, chủ yếu tập trung vào protease thực vật động vật protease vi sinh vật nghiên cứu 10 năm trở lại [1] Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm tạo nhiều Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease cịn cao, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất Các chế phẩm thu sau q trình ni cấy sản xuất enzyme chưa phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 20 – 30% [2] Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp tách chiết tinh enzyme protease nhằm thu sản phẩm có nhiều sinh khối độ tinh khiết cao cần thiết Với dự án “Khảo sát ảnh hưởng môi trường lên men thích hợp đến sinh tổng hợp enzyme protease từ Bacillus subtilis” hy vọng đóng góp tích cực phần vào cơng trình nghiên cứu đã, thực liên quan đến yếu tố ảnh hưởng từ môi trường lên men vi sinh, phụ phẩm nông nghiệp khác ảnh hưởng phần đến sinh khối enzyme protease Chính thế, vấn đề dự án đặt nghiên cứu biện pháp sử dụng nguồn chất, nguyên liệu giàu protein từ phụ phẩm nông nghiệp làm môi trường cảm ứng tăng sinh protein cho vi sinh vật nhằm nâng cao giá trị sinh khối enzyme protease -1- DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT -2- DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU -3- MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH & BẢNG BIỂU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Protease 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu tạo phân loại 1.1.3 Tính chất protease từ vi sinh vật 1.1.4 Ứng dụng 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, ni cấy 1.2.4 Ứng dụng 1.3 Sự hình thành protease vi khuẩn 1.4 Các phương pháp thu nhận protease từ vi sinh vật 1.4.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 1.4.2 Phương pháp ni cấy chìm 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 1.5.1 pH 1.5.2 Nhiệt độ 1.5.3 Chất tăng hoạt chất kìm hãm 1.6 Khảo sát nguồn chất từ phụ phẩm nông nghiệp 1.6.1 Bột đậu nành 1.6.2 Đậu nành tách béo 1.6.3 Bã đậu 1.7 Tình hình nghiên cứu nước Thế giới CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO -4- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Protease 1.1.1 Định nghĩa Protease enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n phân tử protein chất tương tự đến sản phẩm cuối acid amin Ngoài ra, nhiều protease có khả phân thủy phân liên kết esther vận chuyển acid amin Hình 1.1.1 Mơ hình enzyme protease thủy phân phân tử protein 1.1.2 Cấu tạo phân loại 1.1.2.1 Cấu tạo Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật đến thực vật động vật So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết, hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cấu trúc bậc phân tử protein ảnh hưởng đến trình phân giải chất tác dụng protease Dạng monomer dimer chất dễ phân giải dạng tetramer -5- Hình 1.1.2.1 Mơ hình cấu trúc khơng gian enzyme protease 1.1.2.2 Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp lớp thứ (E.C.3.4) Hình 1.1.2.2 Sơ đồ phân loại protease Dựa vào vị trí tác dụng Protease lên peptide phân tử protein, người ta chia Protease thành nhóm chính: exopeptidase endopeptidase -6- Exopeptidase (Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptide): Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi polypeptide để giải phóng amino acid, dipeptide tripeptide Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide đầu C chuỗi polypeptide giải phóng amino acid dipeptide Endopeptidase (Dựa vào động lực học chế xúc tác): Serine proteinase: proteinase chứa nhóm -OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme Nhóm bào gồm nhóm nhỏ chymotrypsin subtilisin Nhóm chymotrypsin: bao gồm enzyme động vật chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm loại enzyme vi khuẩn subtilisin carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh vùng kiềm tính thể tính đặc hiệu chất tương đối rộng Cysteine proteinase: proteinase chứa nhóm -SH trung tâm hoạt động Cysteine proteinase bao gồm protein thực vật papain, bromelin, vài protein động vật protein ký sinh trùng Các cysteine proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu chất rộng Aspartic proteinase: hầu hết aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinse có chứa nhóm carboxyl nhóm trung tâm hoạt động thường hoạt động mạnh pH trung tính Metallo proteinase: nhóm proteinase tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc vi sinh vật bậc cao Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính hoạt độ giảm mạnh tác dụng EDTA Ngồi ra, Protase cịn phân loại dựa vào thành phần amino acid vùng pH tối ưu: -7- Protease acid: hoạt động vùng pH acid – Protease kiềm: hoạt động vùng pH kiềm – 11 Protease trung tính: hoạt động vùng pH trung tính – 1.1.3 Tính chất protease từ vi sinh vật Các kết từ cơng trình nghiên cứu protease vi sinh vật cho thấy protease loại vi sinh vật khác nhiều tính chất Căn vào chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp, protease vi sinh vật chia thành nhóm: P – serine; P – thiol; P – kim loại; P – acid Tính chất hóa lý Protease – serine Protease – thiol có khả phân giải liên kết esther liên kết amide dẫn xuất acid acid amin Protease – kim loại Protease – acid thường hoạt tính estherase dẫn xuất acid amin Trọng lượng phân tử Protease – serine: 20.000 – 27.000 dalton Protease – thiol Protease – acid: 30.000 – 40.000 dalton Protease – kim loại: 33.800 – 48.400 dalton 1.1.4 Ứng dụng Trong công nghiệp thực phẩm: chế biến thủy sản, chế biến thịt, sản xuất sữa phomat, tăng tính xốp dẻo cho bánh mì, bánh quy , sản xuất bia, ngũ cốc… Trong công nghiệp da, dệt: làm mềm dẻo da, làm tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo bóng sợi tơ… Trong số ngành công nghiệp khác: điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, điều chế môi trường dinh dưỡng để sản xuất kháng sinh, sản xuất chất tẩy, keo động vật… 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.1 Nguồn gốc -8- Bacillus subtilis phát lần vào năm 1835 Christion Erenberg tên loài vi khuẩn lúc “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy lồi trực khuẩn có đầu vng đặt tên Bacillus subtilis 1.2.2 Phân loại Theo phân loại Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc: - Giới (Kingdom): Bacteria - Ngành (Division): Firmicutes - Lớp (Class): Bacilli - Bộ (Order): Bacillales - Họ (Family): Bacillaceae - Giống (Genus): Bacillus - Lồi (Species): Bacillus subtilis 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, ni cấy Hình thái: Bacillus subtilis trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram (+) bắt màu tím, kích thước 0.5 – 0.8 μm x 1.5 – μm, đơn lẻ thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả di động, có – 12 lơng, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ nằm lệch tâm tế bào, kích thước bào tử từ 0.8 – 1.8 μm Bào tử phát triển cách nảy mầm nứt bào tử, không kháng acid, có khả chịu nhiệt (100℃ 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Hình 1.2.3 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát kính hiển vi -9- Sinh hóa: lên men không sinh loại đường như: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose arabinose Thử nghiệm indol (-), Voges – Proskauer (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), có khả di động (+) hiếu khí (+) Bảng 1.2.3 Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005) STT Phản ứng sinh hóa Kết Hoạt tính catalase + Sinh indol MR (Methyl – red) + VP (Voges – Proskauer) + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + 10 Arabinose + 11 Xylose + 12 Saccharose + 13 Manitol + 14 Glucose + 15 Lactose 16 Maltose + Nuôi cấy: vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển điều kiện hiếu khí, nhiên phát triển mơi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu 37℃, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4 Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết môi trường dinh dưỡng bản: - Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng trịn, rìa cưa khơng đều, màu vàng xám, đường kính – mm, sau – ngày bề mặt nhăn nheo, màu nâu - 10 - - Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại vẩn mây đáy, khó tan lắc - Trên mơi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng trịn lồi, nhẵn bóng, đơi lan rộng, rìa cưa khơng đều, đường kính – cm sau 72 nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần nguyên tố C, H, O, N số nguyên tố vi lượng khác Vi khuẩn phát triển tốt môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (glucose) nitơ (peptone) 1.2.4 Ứng dụng B subtilis ứng dụng công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc chúng có khả tổng hợp lysine với hàm lượng cao (15 - 20%) từ tinh bột Trong y dược, B subtilis sản xuất thành ống thuốc Subtilis 10 ml điều trị bệnh tiêu chảy trẻ em vi khuẩn Coliform, bệnh dường ruột lị trực tràng, B subtilis dùng để sản xuất kháng sinh thực vật, ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae Người ta thấy phát triển B subtilis làm tăng khả tổng hợp peptide kháng nấm vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium) Khả ứng dụng kiểm soát sinh học B.subtilis ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm tái phát bệnh tiêu chảy gia súc; bổ sung vào ao ni nhằm trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi Hệ enzyme B subtilis sử dụng nhiều sản xuất chất tẩy rửa Chúng biến đổi dạng chất thải độc hại thành dạng hợp chất vô hại nitrogen, carbon dioxide, nước B subtilis tái tổ hợp sử dụng sản xuất polyhydroxyalkanoates (PHA) chúng sử dụng malt phế thải nguồn cacbon, nhờ chi phí sản xuất PHA giảm - 11 - 1.3 Sự hình thành protease vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme sử dụng Protease động vật hay thực vật chứa hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả sinh hai loại trên, protease vi khuẩn có tính đặc hiệu chất cao Chúng có khả phân hủy tới 80% liên kết peptide phân tử protein Các chủng vi khuẩn có khả tổng hợp mạnh protease B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis S5 có khả tổng hợp protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các protease trung tính vi khuẩn hoạt động khoảng pH hẹp (pH 8) có khả chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo dịch thủy phân protein thực phẩm đắng so với protease động vật tăng giá trị dinh dưỡng Chúng cịn có khả lực cao acid amin ưa béo thơm sinh nhiều B subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus số giống thuộc chi Clostridium Protease Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện 11, khối lượng phân tử từ 20.000 - 30.000 dalton Ổn định khoảng pH - 12 hoạt động khoảng pH rộng - 12 1.4 Các phương pháp thu nhận protease từ vi sinh vật 1.4.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt Nguyên tắc: Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, sinh sản trao đổi chất bề mặt môi trường Môi trường sử dụng dạng rắn lỏng Nuôi cấy vi sinh vật bề mặt dịch thể thường dùng cho nhóm vi sinh vật hiếu khí Thiết bị ni cấy phải có bề mặt rộng thống để vi sinh vật phát triển Nuôi cấy vi sinh vật sử dụng môi trường bán rắn thường dùng cho nhóm vi sinh vật hiếu khí kỵ khí Trong q trình ni cấy cần lưu ý độ ẩm môi trường phải đảm bảo khoảng 60 – 70% - 12 - Chế phẩm enzyme thô nuôi cấy bề mặt bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme nước Hình 1.4.1 Sơ đồ ni cấy vi sinh vật phương pháp bề mặt Ưu điểm phương pháp: + Lượng enzyme tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao + Chế phẩm enzyme sau thu nhận dễ sấy khô bảo quản + Dễ thực hiện, quy trình cơng nghệ đơn giản, không tốn + Dễ xử lý nhiễm vi sinh vật lạ (do môi trường nuôi cấy tĩnh) Nhược điểm phương pháp: + Tốn lớn diện tích cho nuôi cấy + Chế phẩm enzyme thô nhiều thành phần dẫn tới tốn tinh 1.4.2 Phương pháp ni cấy chìm Ngun tắc: Phương pháp ni cấy chìm phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản trao đổi chất lịng mơi trường Mơi trường dùng ni cấy chìm thường mơi trường lỏng Phương pháp sử dụng cho vi sinh vật hiếu khí kỵ khí Quá trình phát triển, sinh sản trao đổi chất môi trường lỏng, vi sinh vật tổng hợp enzyme thủy phân Các enzyme thủy phân thường enzyme hịa tan nước Do đó, việc thu nhận enzyme trường hợp thu nhận dịch nuôi cấy (sau tách sinh khối thành phần khơng hịa tan mơi trường) - 13 - Q trình ni cấy chìm cần thực hiện: + Khuấy đảo sục khí + Theo dõi tạo bọt biện pháp phá bọt + Điều chỉnh pH môi trường + Điều chỉnh nhiệt độ môi trường Hình 1.4.2 Dây chuyền ni cấy vi sinh vật phương pháp ni cấy chìm Ưu điểm phương pháp: + Khơng nhiều diện tích + Dễ giới hóa, tự động hóa q trình ni cấy Nhược điểm phương pháp: + Đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị + Khó xử lý nhiễm vi sinh vật lạ (thải bị tồn dịch nuôi), tốn 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 1.5.1 pH Hoạt độ E phụ thuộc vào pH mơi trường, pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc R gốc a.a phân tử E, ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động, ion hóa chất, ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng Đường biểu diễn vận tốc đầu nhiều phản ứng E pH khác có dạng hình chng hẹp cân đối, có đỉnh chng ứng với pH trung tính Như pH thích hợp (pHopt) phần lớn E vào khoảng Tuy nhiên, có số E có pHopt thấp (pepsin, protease acid vi sinh vật), cao subtilisin (protease kiềm Bacillus), thay đổi khoảng pH xác định - 14 - Hình 1.5.1 Ảnh hưởng pH môi trường phản ứng đến phản ứng E a) Đường biểu diễn chung nhiều E; b) Pepsin; c) Subtilisin Bacillus pumilus; d) Cholinesterase; e) Papain với chất benzoylarginylamide Xác định độ bền pH E có ý nghĩa quan trọng q trình thu nhận chế phẩm E, tinh nghiên cứu E Để xác định độ bền pH E, tiến hành giữ E dung dịch đệm có pH khác thời gian xác định, sau chỉnh pH giống (pH thích hợp để xác định hoạt độ nó) trước tiến hành xác định hoạt độ 1.5.2 Nhiệt độ Do chất hóa học E protein nên khác với phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng E xúc tác tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc E Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng E cho thấy nhiệt độ hoạt động thích hợp (topt) nhiều E vào khoảng 40℃ - 50℃ - 15 - Trên 50℃ hoạt độ thường bị giảm mạnh làm hỏng cấu trúc phân tử E (ngoại trừ số E có nguồn gốc từ thực vật số E có nguồn gốc từ vi sinh vật có topt cao hơn) Dưới 0℃ hoạt độ E thường giảm nhiều, lại hồi phục đưa nhiệt độ bình thường Hình 1.5.2 Đường biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng E 1.5.3 Chất tăng hoạt chất kìm hãm - Chất tăng hoạt: ion kim loại kìm hãm hay hoạt hóa E Các ion kim loại nặng, nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm khơng thuận nghịch E Tác dụng ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ chúng, mức độ hoạt hóa tăng theo nồng độ ion kim loại nồng độ thấp giới hạn xác định, vượt ngưỡng nồng độ này, lại có tác dụng kìm hãm E Đặc điểm tác dụng ion kim loại: + Làm cầu nối E chất + Làm trung gian cho phản ứng oxy hóa – khử + Làm bền dạng cấu trúc trung tâm hoạt động phân tử E Một số ví dụ: + Các ion kết hợp chặt với E, tạo thành metallo E Ttong trình tinh sạch, ion kim loại kết hợp với E Các ion thường gặp metallo E là: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+ + Các ion có dung dịch liên kết lỏng lẻo với E, có vai trị kích thích, làm tăng hoạt độ E, thêm ion vào E tinh làm tăng hoạt độ Thuộc loại này, thường gặp ion kim loại kiềm hay kiềm thổ Na+, K+, Mg2+ hay Ca2+ - 16 - - Chất kìm hãm: Các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự chất Chất ức chế gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng enzyme cạnh tranh với chất, khiến cho hoạt động xúc tác enzyme chậm lại Khi chất ức chế giải phóng hoạt động xúc tác enzyme trở lại bình thường Cơ chế chất kìm hãm: + Kìm hãm thuận nghịch + Kìm hãm cạnh tranh + Kìm hãm khơng cạnh tranh Một số ví dụ: + Sử dụng carboxypeptidase tách gốc tyrosine đầu C khỏi phân tử fructose – biphosphate aldolase làm giảm hoạt độ cho phép giả thiết gốc Tyr đầu C có vai trị kết hợp với nhóm – phosphate chất + Sử dụng Subtilisin (protease kiềm Bacillus) cắt phân tử ribonuclease thành phần gọi S – peptide (gồm 20 gốc a.a E) phần lại phân tử ký hiệu S – protein (gồm 104 gốc a.a phân tử E Cả phần S – peptide S – protein hoạt tính xúc tác 1.6 Khảo sát nguồn chất từ phụ phẩm nông nghiệp Phân loại chế phẩm từ đậu nành: Isolated soy protein (ISP) (hàm lượng protein > 90%) ISP dạng đạm đậu nành sử dụng phổ biến thực phẩm Sau loại bỏ hầu hết thành phần non-protein chất béo, chất xơ cacbohydrate, ISP tinh chế với hàm lượng protein cao loại chế phẩm từ đậu nành hàm lượng tối thiểu 90% Đặc điểm: dạng bột, màu vàng nhạt, vị trung tính Textured Soy Protein (TSP) Soya chunks (hàm lượng protein>50%) TSP dạng khác protein đậu nành tạo nên từ hỗn hợp bột đậu nành đậu nành đặc Sau trải qua q trình loại nước, tách dầu, ép đùn làm thay đổi cấu trúc protein tạo nên chất dạng sợi, cấu trúc khô, xốp loại nước dai mềm sau ngâm nước Một số hình dạng TSP dạng vảy, dạng miếng, dạng hạt, vvv Do TSP/TVP ứng dụng thành phần sản phẩm chay thay thịt - 17 - TVP (texture vegan protein) tên gọi khác dòng sản phẩm thịt chay mà thay vào đậu nành từ nguồn đạm thực vật khác loại đậu, yến mạch, lúa mì, v.v có tên gọi phổ biến protein thực vật kết cấu Đặc điểm: cấu trúc giòn xốp, màu sắc đa dạng tùy vào phối trộn nguyên liệu hay màu Soy Protein Concentrate (SPC) (hàm lượng protein > 65%) Cả đạm đậu nành (ISP) đạm đậu nành cô đặc (SPC) chứa hàm lượng protein cao Tuy nhiên điểm khác biệt đạm đậu nành cô đặc loại bỏ chất béo thành phần tan nước, giữ lại carbohydrate chất xơ Vì vậy, hàm lượng protein SPC thấp ISP chứa 65%protein Đặc điểm: dạng bột, màu vàng nhạt, mùi vị đậu nành tự nhiên 1.6.1 Bột đậu nành Trong hạt đậu nành có thành phần hóa học sau protein (40%), lipit (12 25%), glucid (10 - 15%); có muối khống Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; vitamin A, B1, B2, D, E, F; enzyme, sáp, nhựa, cellulose Trong đậu tương có đủ amino acid isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoài ra, đậu tương coi nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh chứa lượng đáng kể amino acid không thay cần thiết cho thể Các thực phẩm làm từ đậu tương xem loại "thịt khơng xương" chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, thay cho nguồn đạm từ thịt động vật Cơ chất dùng khảo sát hạt đậu nành xay mịn thành bột 1.6.2 Đậu nành tách béo Đậu nành tách béo hay gọi protein đậu nành sản phẩm phân tách từ hạt đậu nành khử chất béo, ngâm rửa cồn nước để loại bỏ đường chất xơ Ngày dễ dàng tiếp cận đa dạng hóa cơng thức chế biến từ dạng chế phẩm protein đậu nành 1.6.3 Bã đậu nành Bã đậu nành (có gọi bã đậu) thành phần từ hạt đậu nành thu được, sau trình sàng lọc để làm sữa đậu nành, váng đậu, đậu phụ Bã đậu nành phần không hòa tan hạt đậu nành với nước trình - 18 - sản xuất chế biến sữa đậu nành đậu phụ Phần bã cịn lại có màu trắng sữa vàng nhạt, mịn Trong bã đậu nành có chứa nhiều dưỡng chất như: Chất béo - 15%, chất xơ 12 - 14.5%, chất đạm 24% 17% đạm đậu nành, canxi, sắt, Do bã đậu nành có độ ẩm hàm lượng dinh dưỡng cao nên nhanh bị hư hỏng Thành phần bã đậu nành giàu chất xơ (high fiber) Mỗi 100 gam bã đậu nành chứa đến 12 gam chất xơ, nhiều vượt trội so với loại thực phẩm khác Chất xơ chứa bã đậu nành khơng hịa tan nước, chất xơ bã đậu nành giúp loại bỏ độc tố tích tụ thành ruột, ngăn ngừa việc ứ đọng mỡ thừa thể, tránh bị táo bón cịn giúp phòng ngừa bệnh ung thư ruột Bã đậu nành chứa nhiều chất đạm, canxi, kali, tinh bột, Mỗi 100 gam bã đậu nành chứa 81 mg calcium, 350mg potassium, khoảng 14g gam carbohydrate (tinh bột), khoảng 17 gam chất đạm thực vật Chất tinh bột bã đậu nành có nguồn gốc từ hạt đậu nành nên cung cấp số vi sinh có lợi cho q trình tiêu hóa hấp thụ dưỡng chất ruột Bã đậu nành chứa số sinh tố Vitamin E, K, B1, B2 Ngồi cịn cung cấp thêm folic acid số khống chất khác kẽm, magiê, sắt, phốt pho, đồng, muối natri 1.7 Tình hình nghiên cứu nước Thế giới Việt Nam: Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng cộng phân lập thành công hai chủng Bacillus sp.7.2 Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme nattokinase mơi trường đậu nành hấp chín ni cấy đĩa petri khay Năm 2013, Bùi Thị Nhung cộng nghiên cứu thu kết điều kiện lên men bề mặt Bacillus subtilis với chất bột đậu nành cám mì thu enzyme nattokinase có hoạt lực cao pH 9, độ ẩm từ 50 - 60% thời gian lên men 48h Năm 2016, Nguyen Nhut Huy Nguyen Thuy Huong thực lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto với chất hạt đậu nành điều kiện nhiệt độ 37℃; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu nhận enzyme nattokinase có hoạt lực cao Năm 2016, Nguyễn Thị Minh Nguyệt phân lập định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ natto thương phẩm Nhật Bản Năm 2019, Phan Thị Bích Trâm, Lương Thị Thu Hương Khúc Ngọc Vy, “Sản xuất protease từ Bacilus subtilis N1 sử dụng phụ phẩm đậu nành” - 19 - ... dự án ? ?Khảo sát ảnh hưởng mơi trường lên men thích hợp đến sinh tổng hợp enzyme protease từ Bacillus subtilis? ?? hy vọng đóng góp tích cực phần vào cơng trình nghiên cứu đã, thực liên quan đến yếu... trình nghiên cứu đã, thực liên quan đến yếu tố ảnh hưởng từ môi trường lên men vi sinh, phụ phẩm nông nghiệp khác ảnh hưởng phần đến sinh khối enzyme protease Chính thế, vấn đề dự án đặt nghiên... thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis S5 có khả tổng hợp protease mạnh Các vi khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp vùng pH trung tính kiềm yếu Các protease trung tính vi khuẩn hoạt