THỰC HÀNH HÓA SINH pptx

Chương I: PROTEINBài 1: PHẢN ỨNG BIURE I Nguyên tắc:  Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide CO-NH-  Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên

THỰC HÀNH HÓA

SINH

MỤC LỤC

BÀI 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH 5

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 8

BÀI 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 10

BÀI 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ KÌM HÃM ĐẾN

BÀI 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ  -AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ

18

Chương I: PROTEIN

Bài 1: PHẢN ỨNG BIURE

I) Nguyên tắc:

 Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptide (CO-NH-)

 Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ

 Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide

 Phản ứng này thường thường đượcứng dụng để định lượng protein

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch lòng trắng trứng 1%

 Ure tinh thể

 Dung dịch NaOH 10%

 Dung dịch CuSO4 1%

III) Cách tiến hành & kết quả:

Điều chế biure: cho vào ống nghiệm khô một ít tinh thể urê, đung trên ngọn lửa yếu Lúc đầu urê nóng chảy, đến khi bắt đầu cứng lại thì ngừng đun Quá trình này tạo ra biure, acide cianuric và amoniac

và protein đều cho phản ứng màu giống nhau với NaOH và CuSO4, Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide

 Phản ứng so màu Biure, liên kết peptide với Cu2+ trong MT kiềm, là phản ứng đặc trưng để nhận biết protein

 Nguyên tắc các phản ứng màu khác của protein:

 Phản ứng xantoproteic: đặc trưng với các axit amin vòng thơm Các gốc

amino acid Tyr,Trp,Phe trong protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màuvàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam

 Phản ứng ninhydrin: đặc trưng với các - axit amin.

 Phản ứng Pholia: đặc trưng với các axit amin chứa lưu huỳnh

 Phản ứng Millon : phát hiện Tyrosin gốc Tyr tác dụng với thủy ngân

nitrate trong HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất

 Phản ứng Folin: phát hiện Tyrosin, Tryptophan.

 Phản ứng Sakaguchi: phát hiện Arginin Gốc Arg tác dụng với dung dịch

kiềm của α-naphtol và hypobromite cho màu đỏ anh đào

Bài 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI

TRUNG TÍNH

I) Nguyên tắc:

 Các muối của kim loại kiềm và kiềm thổ (thường dùng là (NH4)2SO4 , Na2SO4, NaCl, MgSO4)có tác dụng gây kết tủa thuận nghịch protein Sau đó nếu loại bỏ nhanhcác yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền

 Các protein khác nhau có thể bị kết tủa vơí các nồng độ muối khác nhau,vì vậy cóthể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch lòng trắng trứng không pha loãng

 Dung dịch (NH4)2SO4 bảo hòa

 Tinh thể NaCl

 Nước cất

III) Cách tiến hành & kết quả:

1) Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng + 3ml dd (NH4)2SO4 bảo hoà, lắc đều đến khi dung dịch bán bảo hoà và xuất hiện kết tủa globulin Để 5 phút, lọc bỏ kết tuả ( thấm ướt giấy lọc bằng dd (NH4)2SO4) vào một ống nghiệm khác

Cho vào dịch lọc 3g tinh thể (NH4)2SO4 (nếu dịch lọc là 4ml) cho đến khi dung dịch bảo hoà, lắc, albumin kết tủa,lọc, thu kết tủa

Cho riêng kết tủa globulin và albumin vào 2 ống nghiệm tương ứng, thêm vào 2 ống từ 3ml nước cất, lắc đều

 Ống 2 : tức là ống chứa kết tủa albumin,sau khi cho nước cất vào thì kết tủa tan

ngay trong nước cất.

 Do Albumin trở về trạng thái dung dịch keo như ban đầu, kết tủa tan hoàntoàn (hiện tượng kết tủa thuận nghịch)

2)Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng , cho tiếp NaCl vào ,dùng đũa thuỷ tinh

khuấy cho đến khi dung dịch bảo hoà Để yên 5 phút thì thấy xuất hiện kết tủa a Lọc kết

tủa sau đó acid hoá phần dịch lọc đó bằng cách thêm vào 1 giọt CH3COOH 1% ,thì thấy

xuất hiện kết tủa b.

 Kết quả:

Kết tủa a là Globulin

Kết tủa b là Albumin

Giải thích :

Globulin kết tủa trước Sau đó đó lọc hết kêt tủa ,cho vào dịch lọc CH3COOH 1%, pH giảm làm xuất hiện kết tủa Albumin.

Bài 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN (Phương pháp xác định đạm formol)

I) Nguyên tắc:

 Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn xuất metylenic.Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó ,ngược lại nhóm

cacboxyl trong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH

 Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp nhóm cacboxyl và nhóm amin tự

do bằng nhau

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chỉ chuẩn bị trước khi dùng)

 Bình 2 : Dùng làm bình thí nghiệm Cho vào 10ml dịch mẫu (đã được pha loãng

từ 5 đến 20 lần ), thêm 10ml dd formol ½ đã trung hoà và 3 giọt phenolphthalein 3%, lắc đều cho phản ứng xảy ra hoàn toàn Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1)

Thực hiện 3 thử thật và 3 thử không(thay dd đạm bằng nước cất), lấy trị số trung bình:

Trong đó : V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không

V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật

a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml = 0,001 l)

 M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21

Bài 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KJELDAHL (Giảng trên mô hình)

I) Nguyên tắc:

 Dưới tác dụng cùa H2SO4 đặc ở nhiệt độ cáo ,các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O ,còn nitơ chuyển thành ammoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate Quá trình được tiến hành theo các bước sau :

NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4dư

 Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng dung dịch NaOH 0,01N

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Vật phẩm có chứa Nitơ ( nước mắm ,đậu hũ ,các loại thực phẩm )

(Nên dùng ống chuẩn để chuẩn bị H2SO4 và NaOH 0,1N)

III) Cách tiến hành & kết quả:

 Đầu tiên hút 1ml (đối với nguyên liệu lỏng ) hay cân chính xác 1g (đối vớinguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn ) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H2SO4

đậm đặc (d=1,84).Để tăng quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần cho thêm chất xúctác.Tốt nhất là dùng 0,5g hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 : Se (100:10 :1) Có thể dùng mộtmình Se kim loại 0,05g hoặc dùng hỗn hợp CuSO4 và K2SO4 hoặc acid perchloric.Hỗn hợp xúc tác có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi,do đó làm tăng vận tốc của quá

tình phản ứng Sau khi thêm các chất xúc tác đun nhẹ hợp cho đến khi dunh dịch hoàntoàn mất màu Chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng Trongquá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ,tráng khéo léo sau cho không còn một vết đen nàocủa mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun cho tớikhi dung dịch hoàn toàn trắng.

bộ dung dịch sau khi đã vô cơ

hóa xong ở bình Kjendahl vào

bình định mức 100ml ,thêm

nước cất cho đến ngấn chia,lắc

đều Dụng cụ cất trước khi sử

dụng phải rửa sạch : lấy vào

bình tam giác 10ml H2SO4

0,1N ,thêm vài giọt chỉ thị

phenolphthalein và lắp vào

máy cất như mô hình Đun sôi

nước trong bình cầu tạo hơi

nước ,mở nước và ống sinh hàn

.Sau đó qua phễu cho vào bình

cất 10ml dd thí nghiệm từ bình

định mức và tiếp đó 8-10ml

dung dịch NaOH 40% Tráng phễu bằng một lượng nhỏ nước cất ,rồi đóng khóa Hơinước từ bình cầu sục qua bình phản ứng và kéo theo NH3 sang bình hấp phụ Quátrình cất kết thúc sau 15 phút Định phân lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH0,1N

 Sau khi đã lấy bình hấp phụ đặt bình nước cất vào ,đóng khóa,đồng thời

mở khóa ở bình rửa Dung dịch chuyển từ bình cất sang bình rửa ,tháo bỏ dung dịchbẩn đi Sau khi thí nghiệm xong phải rửa sạch máy cất vi lượng 1 lần bằng HCl loãng

.10

100.10000.0014,0)

( 



X: hàm lượng nitơ (g/l)

a: số mol H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3

b: số mol NaOH 0,1N tiêu xchuẩn tiêu tốn cho chuẩn sđộ

V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa

0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

Chương II: ENZYME

Bài 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT

TÍNH CỦA ENZYME

I) Nguyên tắc:

 Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme Sự tăng tốc

độ phản ứng của enzyme bằng cách nân nhiệt độ chỉ có hiệu quả trong một khoảngnhiệt độ tương đối hẹp

 Nhiệt độ tối thích của phần lớn các enzyme là trong khoảng 40-600C Ở nhiệt độtrên 800C hầu hết các enzyme bị biến tính không thuận nghịch

II) Cách tiến hành & kết quả:

Chuẩn bị 4 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2ml dd tinh bột 1%

2 phút Xanh đen Đen nhạt Tím đen Nâu đất

4 phút Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt Nâu đất nhạt

6 phút Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt nhạt Nâu đất nhạt

8 phút Xanh đen Nâu đất Nâu nhạt hơn Nâu đất nhạt hơn

12 phút Xanh đen Nâu đen Nâu rất nhạt Màu của lugolQua bảng trên ta thấy : trong ống 1 và ống 2 thì màu dd tinh bột thay đổi không đáng

kể, trong ống 3 và ống 4 màu của dd tinh bột thay đổi nhờ enzyme đã thủy phân

 Giải thích :

Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme Nhiệt độ tốithích của phản ứng enzyme nằm trong phạm vi 40-500C và có thể biển đổi phụ thuộc vàonhiều yếu tố như độ sạch của enzyme, thời gian phản ứng…Nhiệt độ mà enzyme bị mấthoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, thường vào khoảng trên 700C Ở nhiệt

độ tới hạn, enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng được hồi phục lại hoạt độ Ngược lại,

dưới 00C, hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bìnhthường

Bài 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA

VÀ KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

I) Nguyên tắc:

Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme Chất kìm hám làgiảm ái lực của enzyme với cơ chất hay làm enyme mất khả năng kết hợp với cơ chấtII) Cách tiến hành & kết quả:

Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

Ống nghiệm

Sau cho vào mỗi ống 1ml nước bọt và 1ml dd tinh bột, lắc đều Sau vài phút, thêm vào mỗi ống vài giọt

thuốc thử Lugol, lắc đều

 Kết quả:

Ta thấy enzyme hòa tan tốt trong nước, trong dung dịch muối loãng nhưng không tantrong dung môi không phân cực

Bài 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ  -AMYLASE THEO

PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

I) Nguyên tắc:

 Các amylase là các enzyme thủy phân tinh bột, có 2 loại là -amylase và

-amylase Sự tác dụng của hỗn hợp -amylase và -amylase trên tinh bột cho ta hỗnhợp càng lúc càng nhiều glucose, maltose và dextrin đơn giản

 Để xác định hoạt độ của enzyme, ta xác định nồng độ enzyme thấp nhất cókhả năng gây thủy phân hoàn toàn tinh bột cho các sản phầm không đổi màu dd iode

Đó là nguyên tắc của phương pháp Wohlgemouth

 Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn1mg tinh bột ở 37oC sau 30 phút có Cl- làm chất hoạt hóa

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần) => nước bọt của bạn nữ

 Dung dịch tnh bột 0,1%

 Dung dịch NaCl 0,9%

 Dung dịch Iode 0,02N

 Nước cất

III) Cách tiến hành & kết quả:

Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ 1-10,cho vào mỗi ống 1ml dd NaCl 0,9% Trongống nghiệm 1 cho vào 1ml dịch enzyme, lắc đều Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm 1 chovào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm 10 thì hút 1ml và bỏ đi Trongmỗi ống nghiệm cho vào 2ml dd tinh bột 0,1%, lắc đều và để vào tủ ấm ổn nhiệt ở 37oCtrong 30phút Khi thời gian hết, làm nguội các ống đến nhiệt độ phòng và cho vào mỗiống 2 giọt dd Iode 0,02N và lắc đều

 Vai trò của NaCl trong thí nghiệm: Cl- trong NaCl làm chất hoạt hóa

enzyme

Chương III: GLUCIDE

Bài 1: PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FEHLING

I) Nguyên tắc:

 Do có chứa chức aldehyde hoặc ceton cho nên các monosaccharide có tínhkhử và được gọi là đường khử Nếu 2 monosaccharid kết hợp với nhaubằng 2 hydroxyl glucoside thì disacccharide tạo thành bị mất tính khử.Còn nếu nhóm OH glucoside của nhóm này liên kết với nhóm OH alcolcủa monosaccharid kia thì disaccharid tạo thành vẫn còn tính khử

 Khi đun đường khử với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của Cu2O hìnhthành ( do đường khử đã khử Cu(OH)2 có trong Fehling thành CuO2)II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch Glucose 1%

 Dung dịch Mantose 1%

 Dung dịch Saccharide 1%

 Thuốc thử Fehling A (CuSO4)

 Thuốc thử Fehling B (Seignet + NaOH)

III) Cách tiến hành & kết quả:

Lấy 3 ống nghiệm, đánh số từ 1-3 như sau :

 Ống 1 : cho 2ml glucose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút

- Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu2O )

- PTPỨ:

 Ống 2 : cho 2ml maltose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút

- Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu2O )

- PTPỨ:

 Ống 3 : cho 2ml saccharide 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút

- Kết quả: không hiện tượng

- PTPỨ:

 Giải thích:

 Thuốc thử Fehling là hỗn hợp 2dd : ddCuSO4 và dd muối Seignet với NaOH Khi trộn

2 dd trên với nhau thì xảy ra phản ứng :

 CuSO4 + 2 NaOH  Cu(OH)2 + Na2SO4

 Sau đó dd CuSO4 tác dụng với muối seignettạo muối phức hòa tan, dd có màu xanh thẫm

 Muối phức trên là hợp chất không bền

 Trong môi trường kiềm, các mono và 1 sốdixacarit khử Cu2+ dưới dạng alcolat đồng thành

Cu2+, chức aldehit bị oxi hóa thành axit hoặcmuối tương ứng

 Do glucose và maltose có tính khử nên khiđun với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của

Cu2O hình thành ( do đường đã khử Cu(OH )2

có trong Fehling thành CuO2 )

Bài 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF

I) Nguyên tắc:

 Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu Phản ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxi hóa thành acid dehidro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng không màu

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Dung dịch fructose 1%

III) Cách tiến hành & kết quả:

Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml thuốc thử Seliwanoff và thêm vào :

 Ống 1 : 2ml dd fructose 1%

 Ống 2 : 2ml dd glucose 1%

 Ống 3 : 2ml nước cất

Tất cả đun cách thủy trong 5 phút Kết quả

Bài 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG

I) Nguyên tắc:

 Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur(Fe2+) ion này có màu xanh đậm (xanh prusse) Do đó ta có thể dùng phương pháp somàu để định lượng đường

II) Chuẩn bị mẫu:

 1g nguyên liệu thơm + H2SO4 10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1h,lấy ra cho NaOH vào để trung hòa đến pH=7, lọc nếu có cặn ta được dung dịch mẫu

 Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30-100ml dd dùng để xác định đườngkhử

III) Cách tiến hành & kết quả:

Thực hiện 9 ống nghiệm theo mẫu sau:

 Đồ thị theo nồng độ đường và độ hấp thu

Chương IV: VITAMIN

Bài 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A

I) Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc , Vitamin A bị mất nước và tạo thành sản phẩmngưng tụ có màu không bền Sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của liporom(nâu đen)

II) Cách tiến hành & kết quả:

 Nhỏ 1 giọt dầu cá hòa tan trong 25giọt Cloroform, sau đó cho 1 giọt H2SO4đđ vàorồi lắc đều

 Do khi tác dụng với H2SO4đđ, vitamin

A trong dầu cá bị mất nước tạo thành sản phẩmngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biếnđổi nhanh thành màu nâu đen

Bài 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C

I) Nguyên tắc:

Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu Phản ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxy hoá thành acid dehydro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng không màu

II) Nguyên liệu và hóa chất:

Từ màu xanh  trong suốt

Ống 2: 1ml nước cất Thêm vào 3 giọt NaOH 5%,

Bài 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C

I) Nguyên tắc:

Để xác định hàm lượng Vitamin C (Acid ascorbic) trong nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ iod người ta cho tất cả acid ascorbic bị oxy hoá bởi iod , phần iod còn thừa

sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột Điều đó nói lên phản ứng đã kết thúc

II) Nguyên liệu và hóa chất:

 Chanh trái ,bưởi ,cam

III) Cách tiến hành & kết quả:

 Lấy 10g thịt trái chanh và 20ml HCl 5% vào cối sứ để giã ,nghiền nhỏ cho đếnkhi dung dịch có dạng đồng thể, dùng nước cất để chuyển toàn bộ dịch chiết đồng thểvào trong bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch 100ml Lắc đều cho lượngaxit ascorbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn, lọc cặn vào trong bìnhtam giác 250ml, ta có dung dịch mẫu hay dd nguyên liệu

 Hút 20ml dd nguyên liệu đã được lọc cặn vào trong bình nón, thêm5-10 giọt hồtinh bột 1%

 Dùng I2 0,01N chuẩn độ cho đến khi dung dịch bắt đầu xuất hiện màu xanh lamnhạt là được

 Lặp lại chuẩn độ 3 lần, lấy kết quả trung bình ta được V(ml) dd I2 0,01N dùng đểchuẩn độ Vitamin C

V V

100.00088,

0

2 1

Trong đó : m : lượng mẫu thí nghiệm (5gr)

0,00088 : số gram acid ascorbic ứng với 1ml dd I2 0,01N

100 00088 , 0 50 533 , 0





 Phản ứng oxy hoá acide ascorbic :