XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA từ LÔNG HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG HEO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS TRẦN THỊ DÂN KS NGUYỄN VĂN ÚT NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Kính dâng Bố Mẹ, ngƣời sinh thành, dạy dỗ động viên để có đƣợc kết hơm Cảm ơn Anh hai hỗ trợ động viên em suốt trình học tập Cảm ơn gia đình thân yêu tôi! iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: * PGS TS Trần Thị Dân, KS Nguyễn Văn Út hƣớng dẫn tận tình cho em suốt q trình thực tập giúp em hồn thành luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Q thầy cô tạo điều kiện tốt đẹp nhƣ truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trƣờng * Ban giám đốc tập thể cán nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực tập tốt nghiệp * Xin cảm ơn KS Lê Thị Thu Hà anh chị phịng Cơng Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam tận tình bảo giúp đỡ thời gian làm quen với thao tác phịng thí nghiệm trình làm đề tài * Tập thể cán thú y lị mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng giúp đỡ tơi suốt q trình lấy mẫu Sinh viên thực NGUYỄN THỊ NHA TRANG iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” đƣợc tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Hƣớng dẫn đề tài: PGS TS Trần Thị Dân KS Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu trở nên quen thuộc thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc Tuy nhiên, nhiều khơng thể có loại mẫu đó, ví dụ khoa học hình sự, khảo cổ học, hay nghiên cứu loài tiệt chủng hay lồi q hiếm, ta có đƣợc mẫu lơng hay tóc Do đó, việc lấy mẫu lơng hay tóc ly trích DNA từ loại mẫu trở nên cần thiết trƣờng hợp Ngồi ra, việc thu thập mẫu lơng dễ dàng thu thập loại mẫu khác (nhƣ máu, da, cơ…) thú sống Chúng ta nhổ cắt vài lông thú cách dễ dàng mà giết mổ hay gây stress cho thú sống Việc ly trích DNA từ lơng mở rộng cho ly trích DNA từ cấu trúc tƣơng tự lơng nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lơng, từ nhiều vị trí sợi lông xác định xuất gen halothane, đề tài đƣợc tiến hành lông heo Kết ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD mẫu DNA hiệu suất thành công PCR với đoạn mồi phát gen halothane Kết đạt đƣợc nhƣ sau: Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml, mg/ml 1,2 mg/ml cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84 DNA đƣợc ly trích với DTT nồng độ 50 mM tinh (OD = 1,65) thành công đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh (tỷ số OD trung bình 1,80) phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan nồng độ CTAB 0,2% Vị trí gốc lơng cho DNA ly trích tinh (OD = 2,05), vị trí thân lơng (OD = 1,84), sợi lông (OD = 1,75) vị trí lơng (OD = 1,4) Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao mẫu gốc lông (70%), mẫu thân lông (60%) sợi lông (50%) Phản ứng PCR không thành công mẫu lông vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt khóa luận v Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt .x Danh sách bảng xi Danh sách hình biểu đồ xii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu .2 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Cấu trúc lông 2.1.1 Cấu trúc tổng quan .3 2.1.2 Cấu trúc melanin 2.1.3 Cấu trúc keratin 2.1.4 Các liên kết lông 2.1.4.1 Liên kết cuộn xoắn A .5 2.1.4.2 Liên kết protein keratin 2.1.4.3 Liên kết hydrogen .6 2.1.4.4 Liên kết muối 2.1.4.5 Liên kết cystine 2.1.4.6 Liên kết đƣờng 2.1.5 Chu kỳ phát triển lông heo 2.2 Những cơng trình tách chiết DNA từ lông .7 2.2.1 Những cơng trình tách chiết DNA từ lơng nƣớc ngồi vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.2.2 Những cơng trình tách chiết DNA từ lơng nƣớc 2.3 Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10 2.3.1 Nguyên tắc PCR 10 2.3.2 Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR .10 2.4 Gen halothane 11 2.4.1 Khái quát gen halothane .11 2.4.2 Ảnh hƣởng gen halothane 12 2.4.2.1 Ảnh hƣởng gen halothane đến suất sinh sản 12 2.4.2.2 Ảnh hƣởng gen halothane đến sinh trƣởng phẩm chất thịt 13 2.5 Những cơng trình nghiên cứu halothane 13 2.5.1 Nguyên tắc xác định gen halothane 13 2.5.2 Những cơng trình nghiên cứu halothane nƣớc 14 2.5.3 Những cơng trình nghiên cứu halothane nƣớc .14 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Nội dung nghiên cứu 16 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 16 3.3 Vật liệu 16 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA 16 3.3.2 Đoạn mồi 16 3.3.3 Hóa chất 16 3.3.4 Dụng cụ thiết bị dùng đề tài 17 3.3.4.1 Dụng cụ 17 3.3.4.2 Thiết bị 17 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 18 3.4.1 Lấy trữ mẫu 18 3.4.2 Tách chiết DNA .19 3.4.2.1 Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lơng heo 19 3.4.2.2 Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí khác lơng heo 20 3.4.3 Định lƣợng DNA quang phổ kế 21 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.4.4 Thực phản ứng PCR 21 3.4.5 Điện di quan sát kết 22 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose .22 3.4.5.2 Đọc kết 22 3.5 Xử lý số liệu 22 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K .23 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 26 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB 27 4.4 Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí lơng heo 29 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề nghị 30 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO .31 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cs cộng DNA deoxyribonucleic acid OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide PCR polymerase chain reaction PSE Pale, soft, exudative Taq Thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit international UV ultra violet W wave KAP keratin associated proteins HP halothane positive HN halothane negative x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 22 * Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB DTT phân cắt keratin mà khơng có khả loại bỏ đƣợc melanin Theo Giambernardi cs (1998), melanin làm ức chế phản ứng PCR Theo Nozawa cs (1999), CTAB loại bỏ melanin khỏi DNA ly trích Do đó, thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh chất lƣợng DNA ly trích quy trình: quy trình khơng sử dụng CTAB; quy trình sử dụng CTAB nồng độ 0,1% quy trình sử dụng CTAB nồng độ 0,2% Sử dụng DTT theo nồng độ cho kết tốt thí nghiệm Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ thí nghiệm Các bƣớc đƣợc thực theo trình tự thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên yếu tố Mẫu thí nghiệm mẫu gốc lơng heo Số mẫu đƣợc khảo sát cho nghiệm thức Chỉ tiêu khảo sát tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR gen halothane 3.4.2.2 Áp dụng quy trình ly trích DNA lên vị trí khác lông heo Để khảo sát xem quy trình ly trích tối ƣu đƣợc rút từ thí nghiệm cho kết tốt vị trí lơng heo, thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mơ tả bên dƣới * Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên vị trí khác lơng Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhằm khảo sát hiệu việc tách chiết DNA theo quy trình tối ƣu vị trí khác lơng Từ rút vị trí tốt lơng để ly trích DNA Thí nghiệm đƣợc thực theo trình tự quy trình tham khảo với nồng độ proteinase K, nồng độ DTT, nồng độ CTAB cho kết ly trích DNA tốt qua thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên yếu tố Có lơ thí nghiệm: lơ gồm 10 mẫu gốc lông, lô gồm 10 mẫu thân lông, lô gồm 10 mẫu lông lô gồm 10 mẫu sợi lông (vị trí lơng đƣợc phân chia theo hình 3.4) Chỉ tiêu khảo sát tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR gen halothane 3.4.3 Định lƣợng DNA quang phổ kế DNA sau ly trích đƣợc đo máy quang phổ kế bƣớc sóng 260 nm 280 nm Độ tinh DNA đƣợc tính tỷ số OD260nm/OD280nm DNA đƣợc xem tỷ số khoảng 1,8 – 2,0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 23 Hàm lƣợng DNA đƣợc tính cơng thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng Mẫu đƣợc pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 990 µl H2O đo OD 3.4.4 Thực phản ứng PCR DNA sau đƣợc ly trích từ lơng heo theo quy trình đƣợc sử dụng làm mẫu để thực PCR xác định gen halothane Kết PCR tiêu để đánh giá chất lƣợng DNA ly trích Quy trình PCR xác định gen halothane đƣợc tham khảo từ Lƣơng Quý Phƣơng (2006) Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 5X 1X MgCl2 25 mM mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 25 mM 200 µM/ loại Taq polymerase UI/µl UI DNA 150 ng H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006) Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt PCR xác định gen halothane Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Biến tính hồn tồn 94 phút Biến tính 94 45 giây Bắt cặp 54 90 giây Kéo dài 72 90 giây Kéo dài cuối 72 phút Trữ 35 chu kỳ (Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 3.4.5 Điện di quan sát kết 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định gen halothane 2% Ví dụ cần 100 ml dung dịch agarose 2%, tiến hành nhƣ sau: - Cân g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X - Đun sôi hỗn hợp phút - Để nguội dần nhiệt độ phòng, đến vừa ấm đƣợc - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc đổ), ý tránh bọt khí - Để cho gel cứng hoàn toàn, rút lƣợc khỏi gel Cho gel vào bể điện di, bổ sung thêm TBE cho ngập gel đƣợc - Trộn 10 sản phẩm PCR với loading dye bơm hỗn hợp vào giếng gel Vận hành máy điện di với thông số 100 V, 250 mA, 30 phút - Sau điện di, ngâm gel ethidium bromide 10 mg/ml 30 phút 3.4.5.2 Đọc kết Điện di 7,5 µl sản phẩm PCR 30 phút với TBE 0,5 X ; dòng điện 100 V; 250 mA Vớt gel khỏi buồng diện di cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 10 mg/ml 30 phút Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết với phần mềm Geldoc Biorad 3.5 Xử lý số liệu Xử lý số liệu với hàm thống kê F Excel phần mềm Statgraphics 7,0 Kết đƣợc trình bày dạng X ± SE (Với SE = SD/√ n ) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K Sử dụng mẫu gốc lơng để ly trích DNA Kết đo OD hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ proteinase K Nồng độ proteinase K Chỉ tiêu P 0,8 mg/ml mg/ml 1,2 mg/ml Tỷ số OD 1,84 0,03 1,82 0,03 1,75 0,03 1,71 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,33 0,03 0,32 0,03 0,28 Số mẫu 4 1,84 1,82 1,8 1,75 1,6 1,4 Tỷ số OD 1,2 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0,8 0,6 0,4 0,32 0,33 0,32 0,8 mg/ml mg/ml 1,2 mg/ml 0,2 nồng độ proteinase K Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ proteinase K McNevin cs (2005) đƣa khoảng nồng độ proteinase K sử dụng dung dịch đệm ly trích DNA lơng từ 0,05 đến 20 mg/ml Qua bảng 4.1 cho thấy khác biệt tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi nồng độ 0,8 mg/ml; mg/ml 1,2 mg/ml (P > 0,05) Phản ứng PCR từ mẫu thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 cơng Do đó, tiến hành thí nghiệm ly trích DNA từ lơng, dùng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml để có lợi mặt kinh tế 1: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 0,8 mg/ml 586 bp 2: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K mg/ml 3: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1,2 mg/ml 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) Hình 4.1 Kết PCR mẫu gốc lơng nồng độ proteinase K 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT Sau đo OD tính hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc từ mẫu gốc lơng đem thí nghiệm, chúng tơi tính toán giá trị thống kê (xem bảng 4.2) Bảng 4.2 Kết tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ DTT Nồng độ DTT Chỉ tiêu P 50 mM 65 mM 80 mM Tỷ số OD 1,65 0,02 1,81 0,09 1,64 0,03 1,67 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,36 0,08 0,43 0,04 0,29 0,03 0,40 Số mẫu 4 1,8 1,81 1,65 1,64 1,6 1,4 Tỷ số OD 1,2 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0,8 0,6 0,4 0,36 0,43 0,29 0,2 50 mM 65 mM 80 mM nồng độ DTT Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ DTT LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 Khơng có khác biệt tỷ số OD việc sử dụng DTT nồng độ 50 mM, 65 mM 80 mM (P > 0,05) Phản ứng PCR gen halothane thành cơng mẫu có sử dụng nồng độ DTT 50 mM nhƣng không thành cơng với mẫu ly trích từ hai nồng độ lại Sự diện DTT dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích (Kalbe cs, 1988) điều làm giảm việc gắn kết deoxyribose nucleotides DNA, làm chúng đƣợc nhận biết Taq polymerase (McNevin ctv, 2005) Đó giả định giải thích phản ứng PCR khơng xảy mẫu sử dụng nồng độ DTT 65 mM 80 mM Do đó, buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng DTT nồng độ 50 mM DNA có chất lƣợng tốt 1: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 50 mM 586 bp 2: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 65 mM 3: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 80 mM 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) Hình 4.2 Kết PCR mẫu gốc lông nồng độ DTT 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB Thí nghiệm đƣợc tiến hành mẫu gốc lơng Kết đo OD hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ CTAB Chỉ tiêu Nồng độ CTAB P 0% 0,1% 0,2% Tỷ số OD 1,39 0,02 a 1,53 0,03 b 1,80 0,02 c 0,03 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,37 0,03 0,33 0,04 0,31 Số mẫu 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 1,8 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 1,8 1,53 1,39 Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 0,32 0% 0,37 0,10% 0,33 0,20% nồng độ CTAB Biểu đồ 4.3 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với nồng độ CTAB Có khác biệt tỷ số OD quy trình ly trích sử dụng CTAB nồng độ 0%, 0,1% 0,2% (P < 0,05) Sử dụng CTAB nồng độ 0,2% cho tỷ số OD cao Phản ứng PCR thành công mẫu có sử dụng CTAB nồng độ 0,2% Theo Nozawa cs (1999), CTAB có khả loại bỏ melanin khỏi hỗn hợp mẫu lông Ở mẫu khơng sử dụng CTAB mẫu có sử dụng CTAB 0,1%, có lẽ nồng độ CTAB sử dụng không đủ để loại hết thành phần melanin hỗn hợp mẫu lông Theo Sambrook ctv (2001), độ tinh DNA ảnh hƣởng lớn đến hiệu PCR DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem Ở đây, mẫu không dùng CTAB mẫu dùng CTAB 0,1% có tỷ số OD trung bình 1,39 1,53 Tỷ số thấp, chứng tỏ lƣợng protein dịch DNA cịn nhiều Đó lý giải thích cho phản ứng PCR không thành công mẫu không sử dụng CTAB mẫu sử dụng CTAB 0,1% Do đó, buffer ly trích DNA từ lơng nên sử dụng CTAB nồng độ 0,2% LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 1: Mẫu gốc lông không sử dụng CTAB 586 bp 2: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,1% 3: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,2% 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) Hình 4.3 Kết PCR mẫu gốc lơng nồng độ CTAB 4.4 Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên vị trí khác lơng Thí nghiệm đƣợc bố trí lơ mẫu gốc lông, thân lông, lông sợi lông heo Kết đo OD hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày bảng 4.4a Bảng 4.4a Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với vị trí lông heo Mẫu Chỉ tiêu Tỷ số OD Hàm lƣợng DNA (µg/µl) p Gốc Thân Ngọn Cả sợi 2,05±0,15 a 1,84±0,15 b 1,40±0,15 c 1,75±0,15 b 0,04 0,33±0,15 a 0,30±0,15 ab 0,24±0,15 c 0,28±0,15 b 0,03 10 10 10 10 Số mẫu 2,5 2,05 1,84 1,75 1,4 1,5 Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 0,5 0,33 0,3 0,24 0,28 Gốc Thân Ngọn Sợi Biểu đồ 4.4 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ứng với vị trí lơng heo LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30 Qua bảng 4.4a cho thấy có khác biệt tỷ số OD vị trí khác lơng heo (P < 0,05) Vị trí cho tỷ số OD tốt mẫu gốc lông (2,05), mẫu thân lơng (1,84), vị trí cho tỷ số OD thấp mẫu lông (1,40), vị trí cho tỷ số OD chấp nhận đƣợc sợi lơng (1,75) Ngun nhân mức độ keratin hóa gốc việc tách keratin khỏi hỗn hợp DNA ly trích từ gốc dễ dàng so với phần Kết cho thấy hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu gốc lơng đạt cao (0,33 µg/µl) Trong đó, mẫu thân lơng đạt 0,3 µg/µl, mẫu sợi lơng đạt 0,28 µg/µl mẫu lơng thấp (0,26 µg/µl) Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (P < 0,05) Nguyên nhân phần lớn tế bào lông tế bào chết nên hết DNA, lƣợng DNA thu hồi so với lƣợng DNA thu hồi từ gốc thân lơng (nơi có nhiều tế bào cịn sống) Bảng 4.4b Kết PCR từ vị trí lơng heo Số mẫu tiến hành Số mẫu có sản Tỷ lệ mẫu có sản PCR phẩm PCR phẩm PCR (%) Gốc lơng 10 70 Thân lông 10 60 Ngọn lông 10 0 Sợi lông 10 50 Mẫu P 0,03 Qua bảng 4.4b cho thấy DNA ly trích từ mẫu gốc lông cho tỷ lệ thành công phản ứng PCR cao (70%), mẫu thân lông (60%) mẫu sợi lông (50%) Mẫu lơng tỷ số OD cịn q thấp nên phản ứng PCR không xảy (tỷ lệ PCR thành công 0%) Sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) Trong nghiên cứu sử dụng mẫu lông thú sống, việc nhổ sợi lông thú với số lƣợng lớn dễ làm cho thú bị stress, ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng, phát triển sinh sản thú Để giải vấn đề này, dùng dao cắt sợi lông bề mặt da thú áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 31 Nhƣ vậy, ly trích DNA từ gốc lơng thân lông cho DNA chất lƣợng tốt so với sợi lông lông Trong trƣờng hợp thú sống, sử dụng mẫu thân lơng để ly trích DNA thích hợp Do vậy, xem thân lơng vị trí thích hợp để ly trích DNA 586 bp 1->7: Các mẫu gốc lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) Hình 4.4a Kết PCR vị trí gốc lơng 586 bp 1->7: Các mẫu thân lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) Hình 4.4b Kết PCR vị trí thân lơng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 32 586 bp 1->7: Mẫu sợi lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) Hình 4.4c Kết PCR vị trí sợi lơng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml, mg/ml 1,2 mg/ml cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84 - DNA đƣợc ly trích với DTT nồng độ 50 mM tinh (OD = 1,65) thành công đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR - Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh (tỷ số OD trung bình 1,80) phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan nồng độ - Vị trí gốc lơng cho DNA ly trích tinh (OD = 2,05), vị trí thân lơng (OD = 1,84), sợi lơng (OD = 1,75),vị trí lơng (OD = 1,4) Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao mẫu gốc lông (70%), mẫu thân lông (60%) sợi lông (50%) Phản ứng PCR không thành công mẫu lông 5.2 Đề nghị - Tiếp tục cải thiện quy trình ly trích DNA từ lơng hiệu suất PCR cao - Sử dụng thân lông (đoạn cm kể từ da thú trở lên) dùng làm ngun liệu ly trích DNA - Áp dụng quy trình ly trích DNA từ lơng lên lồi thú khác nhau, kể với lông ngƣời lĩnh vực có liên quan LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt Bùi Thị Ngọc Bích, 2006 Sử dụng số hóa chất để cải thiện hiệu ly trích DNA từ lơng Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Đinh Văn Chỉnh ctv, 1999 Xác định tần số kiểu gen tính sản xuất lợn Landrrace Yorshire có kiểu gen khác đƣợc nuôi số sở giống miền Bắc Báo cáo Khoa học – NXB Nông Nghiệp Lê Thị Thu Hà, 2006 Chọn lọc đàn giống hạt nhân qua đánh giá giá trị giống kết hợp với phân tích gen estrogen (Esr), halothane (Hal) Đề tài nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông nghiệp miền Nam, Việt Nam Lê Thị Thu Phƣơng, 2004 Phát gen halothane, gen thụ thể estrogen mối liên quan hai gen đến suất sinh sản heo nái Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Lƣơng Quý Phƣơng, 2006 Sản xuất kit ly trích DNA kit phát gen halothane heo Khóa luận tốt nghiệp, ngành Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, 2000 Vài kinh nghiệm ứng dụng PCR để phát gen halothane gen thụ thể estrogen , mối quan hệ hai gen với sức sản xuất nái, nọc heo thịt Hội nghị KH chuyên ngành Chăn nuôi -Thú y Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2005 Ảnh hƣởng gen halothane, gen thụ thể estrogen đến suất sinh sản phẩm chất thịt Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp, số 2&3/2005 Nguyễn Văn Út, 2005 Xác định giới tính kỹ thuật multiplex PCR giống bị Khóa luận tốt nghiệp,ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 *Tài liệu Tiếng Anh DeSilva U., Guo X., Kupfer D.M., Fernando S.C., Pillai A.T.V., F Z., Najar S So, Fitcha G.Q., Roeb B.A., 2003 Allelic variants of ovine prion protein gene (PRNP) in Oklahoma sheep Cytogenet Genome Res 102: 89 – 94 10 Elizabeth A G, David R F., 2005 A simplified method for mitochondrial DNA extraction from head hair shafts J Forensic Sci 50: 11 Galan M., Baltzinger C., Hewison A J M., Cosson J., 2003 Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method Trends in Ecology and Evolution 12: 223 – 227 12 Haase A., Retzel E F., Stakus K A., 1990 Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells Proc Natl Acad SCUSA 87: 4971 – 4975 13 Pfeiffer, I Volkel, H Taubert, B Brenig, 2004 Forensic DNA-typing of dog hair: DNA-extraction and PCR amplification Forensic Science International 141: 149 – 151 14 James N J., Mary V A., 2004 Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii) Zoo Biology 23: 521– 531 15 Mark R Wilson, Joseph A DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995 Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis J Legal Med 108: 68 – 74 16 Mark R Wilson, Joseph A DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995 Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis J Legal Med 108: 68 – 74 17 McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005 Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair Forensic Science International 153: 237 – 259 18 Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C., Lobie P E., 1998 In situ reverse transcription - polymerase chain reaction Applications for light and electron microscopy Biology of the Cell 90: 137 – 154 19 Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999 Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences Legal Med 1: 61 – 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 20 Rees J L., 2003 Genetics of hair and skin colour Annu Rev Genet 37: 67 – 90 21 Riginaldo Gaspar Bastos, Joreci Federizzi, Joao Carlos Deschamps, Ricardo Cardellino and Odir Antonio Dellagostin, 2000 Characterization of swine stress gene by DNA testing using plucked hair as a source of DNA Genetics and Molecular Biology 23: 815 – 817 22 Sake R K., Scharf S., Faloona F., Mullis K B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985 Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230: 1350 – 1355 23 Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G I., 2000 Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay Nucleic Acids Research 28: p 23 24 Vigilant L., 1999 An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs Bio Chem 390: 1329 – 1321 25 Werner A Baumgartner, 1979 Radioimmunoassay of hair for determining opiate abuse histories, J Nucl Med 20: 749 – 752 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lơng heo? ?? 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lơng heo - Tìm vị trí tốt sợi lơng heo để ly trích DNA 1.2.2... 21 Quy trình quy trình tham khảo Từ đó, tiến hành thí nghiệm nhƣ mơ tả bên dƣới để tìm quy trình ly trích DNA từ lơng phù hợp 3.4.2.1 Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lơng heo Để thiết lập quy. .. so với DNA ly trích từ lơng; DNA ly trích từ gốc lơng có độ tinh cao so với DNA ly trích từ lơng Bùi Thị Ngọc Bích (2006) sử dụng số hoá chất để cải thiện hiệu quy trình ly trích DNA từ lơng