SỬ DỤNG một số hóa CHẤT để cải THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA từ LÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** BÙI THỊ NGỌC BÍCH SỬ DỤNG MỘT SỐ HĨA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS TRẦN THỊ DÂN KS NGUYỄN VĂN ÚT BÙI THỊ NGỌC BÍCH Khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** USE SOME CHEMICALS TO ENHANCE ABILITY OF EXTRACTING DNA FROM HAIR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: Ph D TRAN THI DAN Ba NGUYEN VAN UT BUI THI NGOC BICH Term: 2002 – 2006 HCMC 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Quý thầy cô tạo điều kiện tốt đẹp nhƣ truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trƣờng * Ban giám đốc tập thể cán nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực tập tốt nghiệp * Tập thể cán thú y lị mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng giúp đỡ tơi suốt q trình lấy mẫu * PGS TS Trần Thị Dân, KS Nguyễn Văn Út hƣớng dẫn tận tình, để tơi hoàn thành tốt đề tài * Bạn Lƣơng Quý Phƣơng giúp tơi lấy mẫu lơng để thí nghiệm * Các anh chị Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM tạo điều kiện sở vật chất, kỹ thuật để làm tốt đề tài * Xin cảm ơn bạn bè lớp CNSH 28 giúp đỡ học tập suốt năm đại học Sinh viên thực Bùi Thị Ngọc Bích iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT KHÓA LUẬN BÙI THỊ NGỌC BÍCH, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9/2006, “SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LƠNG” Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Trần Thị Dân KS Nguyễn Văn Út Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Trong thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng mẫu máu, da, để ly trích DNA Tuy nhiên, nhiều ta khơng thể có loại mẫu đó, ví dụ khoa học hình hay nghiên cứu loài tiệt chủng hay loài quý Ngồi ra, thu thập mẫu lơng dễ dàng thu thập loại mẫu khác thú sống Với mục đích tìm quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lơng, đề tài đƣợc tiến hành lơng bị lơng heo Kết ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD mẫu DNA hiệu suất thành công PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính đoạn mồi phát gen halothane Kết đạt đƣợc nhƣ sau: Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K Ca2+ nồng độ mM, mM 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69 Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA gốc lơng bị ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ cho băng dài 370 bp gen giới tính DNA ly trích từ mẫu gốc lơng heo gốc lơng bị khơng có khác biệt tỷ số OD hàm lƣợng DNA từ gốc lơng bị (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh có hàm lƣợng cao DNA từ lơng (1,2) DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh DNA từ dung dịch đệm khơng có DTT (1,58) iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nồng độ CTAB trình ly trích có ảnh hƣởng đến độ tinh DNA Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao (1,84 ); 0,06% CTAB cho OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3 Sử dụng BSA khơng có tác dụng việc cải thiện kết PCR khơng nhân đƣợc đoạn DNA 655 bp gen giới tính Nhìn chung, hố chất đƣợc bổ sung vào quy trình ly trích DNA hỗn hợp PCR cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà khơng có đoạn DNA dài (655 bp) gen giới tính Đồng thời, thí nghiệm khơng cho kết mong muốn PCR phát gen halothane mẫu lông heo v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn Tóm tắt khóa luận iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình biểu đồ x PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu .1 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Cấu trúc tổng quan lông .3 2.2 Cấu trúc lơng bị lơng heo .3 2.3 Cấu trúc melanin 2.4 Cấu tạo keratin 2.5 Những công trình tách chiết DNA từ lơng .5 2.6 Nguyên tắc PCR 2.7 Nguyên tắc xác định gen giới tính gen halothane 2.7.1 Nguyên tắc xác định gen giới tính .9 2.7.2 Nguyên tắc xác định gen halothane PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Nội dung nghiên cứu 11 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 11 3.3 Vật liệu 11 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA 11 3.3.2 Đoạn mồi 11 3.3.2.1 Đoạn mồi gen xác định giới tính 11 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.2.2 Đoạn mồi gen halothane 12 3.4 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .12 3.4.1 Lấy trữ mẫu 12 3.4.2 Tách chiết DNA .12 3.4.3 Đánh giá độ tinh hàm lƣợng DNA ly trích 15 3.4.4 Thực phản ứng PCR 15 3.4.4.1 Multiplex PCR xác định giới tính 15 3.4.4.2 PCR xác định gen halothane 16 3.4.5 Điện di quan sát kết 17 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose 17 3.4.5.2 Kết điện di PCR 17 3.5 Xử lý số liệu 17 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ dung dịch đệm ly trích DNA 18 4.2 Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc lơng bị .19 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lơng heo lơng bị 20 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng DTT việc phân cắt keratin ly trích DNA .21 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng CTAB việc loại bỏ melanin 23 4.6 Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA phản ứng PCR 23 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Đề nghị 25 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO .26 PHỤ LỤC 28 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair ctv cộng tác viên DNA deoxyribonucleic acid NST nhiễm sắc thể OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide BSA bovine serum albumine PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit UV ultra violet W wave viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi gen xác định giới tính 12 Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính 15 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt PCR xác định giới tính 16 Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane .16 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt PCR xác định gen halothane 17 Bảng 4.1 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với nồng độ Ca2+ 18 Bảng 4.2a Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ vị trí lơng bị 19 Bảng 4.2b Kết PCR từ vị trí lơng bị 19 Bảng 4.3 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ nguồn lông 21 Bảng 4.4 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT 22 Bảng 4.5 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ mức CTAB 23 Bảng 4.6 Kết PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung 24 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 15 Do đó, thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh lƣợng DNA đƣợc tinh quy trình DTT có sử dụng CTAB quy trình DTT không sử dụng CTAB CTAB đƣợc thêm vào quy trình sau ủ lơng với dung dịch có DTT Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên yếu tố Thí nghiệm đƣợc chia làm nghiệm thức: 0%, 0,06% 0,2% CTAB Số mẫu đƣợc kiểm tra cho nghiệm thức Mẫu gốc lông đƣợc cắt dài khoảng cm tính từ gốc Chỉ tiêu quan sát tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR gen giới tính gen halothane 3.4.3 Đánh giá độ tinh hàm lƣợng DNA ly trích Đo độ tinh hàm lƣợng DNA sau ly trích đƣợc xác định quang phổ kế bƣớc sóng 260 nm 280 nm Độ tinh DNA đƣợc tính tỷ số OD260nm/OD280nm DNA đƣợc xem tỷ số khoảng 1,8 – Hàm lƣợng DNA đƣợc tính cơng thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng Mẫu đƣợc pha loãng 10 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 90 µl H2O đo OD 3.4.4 Thực phản ứng PCR 3.4.4.1 Multiplex PCR xác định giới tính Thực phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày Bảng 3.2 chu kỳ nhiệt Bảng 3.3 PCR xác định giới tính đƣợc dùng để khẳng định hiệu ly trích DNA từ thí nghiệm đến thí nghiệm Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Đệm PCR 10 X 1X MgCl2 25 mM 1,5 mM RIV/UIV 100 µM 0,5 µM BTA1/ BTA2 100 µM 0,5 µM dNTP 10 mM 200 µM/ loại Taq polymerase UI/µl 1,5 UI DNA ng/µl H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Nguyễn Văn Út, 2005) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 16 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt PCR xác định giới tính Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Biến tính hồn tồn 94 Biến tính 94 Bắt cặp 54 Kéo dài 72 Kéo dài cuối 72 Trữ 35 chu kỳ (Nguồn: Nguyễn Văn Út, 2005) * Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA (bovine serum albumine) ức chế melanin phản ứng PCR Ngồi CTAB có khả loại melanin khỏi dịch DNA ly trích BSA có khả ức chế melanin phản ứng PCR Ferri ctv (2001) thấy BSA khắc phục đƣợc ức chế melanin Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên yếu tố Sử dụng BSA nồng độ µg/µl; 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; 0,1 µg/µl 0,5 µg/µl DNA đƣợc ly trích dung dịch đệm khơng EDTA nhƣng có proteinase K Ca2+ Nồng độ Ca2+ thí nghiệm cho tỷ số OD cao đƣợc sử dụng thí nghiệm Mỗi nồng độ BSA đƣợc thêm vào hỗn hợp PCR để tích cuối đạt 30 µl Sản phẩm PCR theo dõi gen giới tính lơng bị gen halothane lơng heo 3.4.4.2 PCR xác định gen halothane Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 10 X 1X MgCl2 25 mM mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 10 mM 200 µM/ loại Taq polymerase UI/µl UI DNA ng/µl H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 17 Thực phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày Bảng 3.4 PCR xác định gen halothane đƣợc thực với DNA thí nghiệm Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt PCR xác định gen halothane Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Biến tính hồn tồn 94 phút Biến tính 94 45 giây Bắt cặp 54 90 giây Kéo dài 72 90 giây Kéo dài cuối 72 phút Trữ 35 chu kỳ (Nguồn: Lê Thị Thu Phƣơng, 2004) 3.4.5 Điện di quan sát kết 3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định giới tính 1,5%; 2% sản phẩm PCR xác định gen halothane Ví dụ để chuẩn bị 1,5% ta làm nhƣ sau: cân 0,225 g agarose hoà tan 15 ml TBE 0,5 X lắc Đun agarose lò viba 650 w phút Để gel nguội đến khoảng 50oC, đổ vào khn có gắn lƣợc Chờ gel đông rút lƣợc 3.4.5.2 Kết điện di PCR Dùng 7,5 µl sản phẩm PCR trộn với 1,5 µl loading dye X Điện di 30 phút TBE 0,5 X với dòng điện 100 V, 250 mA Vớt gel khỏi buồng diện di cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% 30 phút Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết 3.5 Xử lý số liệu Xử lý số liệu với hàm thống kê Excel phần mềm Statgraphics 7.0 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 18 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ dung dịch đệm ly trích DNA DNA lơng bị đƣợc ly trích từ nồng độ Ca2+, kết đo OD hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA tƣơng ứng với nồng độ Ca2+ Nồng độ Ca2+ Chỉ tiêu P mM mM 10 mM 1,6 0,08 1,62 0,12 1,69 0,15 0,49 ( X ± SD) (µg/µl) 0,51 0,22 0,24 0,13 0,3 0,3 0,19 Số mẫu 5 Tỷ số OD ( X ± SD) Hàm lƣợng DNA 1.6 1.69 1.62 1.5 Tỷ số OD 0.51 0.5 0.3 0.24 Hàm lượng DNA (µg/µl) mM mM 10 mM Biểu đồ 4.1: Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với nồng độ Ca2+ Sự khác biệt tỷ số OD nồng độ DNA khơng nhiều (P > 0,05) Trong thí nghiệm McNevin ctv (2005), ông ta đề nghị dung dịch đệm ly trích có sử dụng Proteinase K bổ sung 40 mM Ca2+ Do đó, bố trí thêm nhiều thí nghiệm nồng độ Ca2+ từ 10 mM đến 40 mM để xác định nồng độ Ca2+ cho hiệu tối ƣu Trong kết ly trích trên, dung dịch đệm ly trích chứa 655 bp 370 bp 10 mM Ca2+ có tỷ số OD cao nên lấy DNA để chạy PCR Phản ứng PCR từ lơng bị khuếch đại đƣợc băng dài 370 bp nên không đạt yêu cầu Kết PCR xác định gen halothane âm tính mẫu La Ca Ca Ca Ca ĐC LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 19 655 bp 370 bp Hình 4.1: Kết PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ La: ladder, Ca: 10mM Ca2+, ĐC: đối chứng sản phẩm PCR với DNA ly trích từ vân 4.2 Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc lơng bị DNA đƣợc ly trích từ mẫu gốc lơng dài khoảng cm tính từ gốc mẫu lơng dài khoảng cm phần đuôi thân lông Kết đo OD hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày bảng 4.2a Bảng 4.2a Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ vị trí lơng bị Chỉ tiêu Gốc lông Thân lông P Tỷ số OD 1,76 0,09 1,2 0,07 0,0001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,34 0,28 0,07 0,03 0,04 Số mẫu 1.76 1.5 Tỷ số OD 1.2 0.5 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.34 0.07 Gốc lơng Thân lơng Biểu đồ 4.2: Tỷ số OD DNA ly trích từ gốc lơng lơng bị LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 20 Bảng 4.2b Kết PCR từ vị trí lơng bị Số mẫu tiến Số mẫu có sản Tỷ lệ mẫu có hành phẩm PCR sản phẩm PCR Gốc lông 5 100% Ngọn lông 0% Mẫu P 0,0414 Có khác biệt đáng kể tỷ số OD hàm lƣợng DNA mẫu gốc thân lơng bị (P < 0,05) Càng xa phần gốc lơng bị keratin hố tế bào sống (Wagner ctv, 1996) Do đó, DNA ly trích từ phần thân lơng lẫn tạp chất nhiều so với phần gốc lông Theo Sambrook ctv (2001), độ tinh DNA ảnh hƣởng lớn đến hiệu PCR DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem Ở đây, mẫu lơng có tỷ số OD trung bình 1,2 Tỷ số thấp chứng tỏ lƣợng protein dịch DNA nhiều Điều rõ ràng xa gốc lơng bị keratin hóa mạnh Do đó, sản phẩm PCR mẫu lông không đƣợc tạo thành Tuy nhiên, sản phẩm PCR có băng 370 bp dùng DNA ly trích từ gốc lơng, nhƣ sản phẩm PCR chƣa đạt yêu cầu N N N N G G G G G ĐC 655 bp 370 bp Hình 4.2: Kết PCR từ lơng gốc lơng bị N: ngọn, G: gốc, ĐC: đối chứng sản phẩm PCR với DNA ly trích từ vân 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lơng heo lơng bị Các mẫu đƣợc ly trích từ gốc lông, tỷ số OD hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày Bảng 4.3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 21 Bảng 4.3 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ nguồn lông Chỉ tiêu Lơng bị Lơng heo P Tỷ số OD 1,82 0,08 1,69 0,11 0,07 Hàm lƣợng DNA (µg/ µl) 0,31 0,3 0,09 0,05 0,14 Số mẫu 5 1.82 1.69 1.5 Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.31 0.5 0.09 Lơng bị Lơng heo Biểu đồ 4.3: Tỷ số OD DNA ly trích từ mẫu gốc lơng heo lơng bị Tỷ số OD DNA gốc lơng heo bị khơng có khác biệt nhiều (P > 0,05) Sản phẩm PCR DNA ly trích từ lơng heo khơng cho băng Có thể DNA ly trích từ lơng heo cịn tạp chất lý khác, cần làm thêm vài thí nghiệm để giải thích rõ H H H H H B B B B B 370 bp Hình 4.3: Kết PCR với DNA từ gốc lơng heo gốc lơng bị H: heo, B: bị 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng DTT việc phân cắt keratin ly trích DNA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 22 Bảng 4.4 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT Chỉ tiêu Không DTT DTT P Tỷ số OD 1,58 0,14 1,84 0,09 0,008 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,3 0,18 0,21 0,13 0,44 Số mẫu 5 1.84 1.58 1.5 Tỷ số OD 0.5 Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.3 0.21 Khơng DTT DTT Biểu đồ 4.4: So sánh DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT khơng có DTT Có khác biệt tỷ số OD việc sử dụng DTT không sử dụng DTT (P < 0,05) Tỷ số OD dung dịch đệm ly trích theo DTT đạt khoảng tinh (1,8 – 2) Gen giới tính (2 mẫu) từ lơng bị gen halothane từ lơng heo có bổ sung DTT khơng có dấu hiệu phản ứng Kalbe ctv (1988) chứng tỏ diện DTT dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích, điều làm giảm việc gắn kết deoxyribose nucleotides DNA làm chúng đƣợc nhận biết Taq polymerase (McNevin ctv, 2005) Đó giả định để giải thích sản phẩm PCR không đƣợc thấy Kết PCR xác định gen halothane âm tính mẫu 1 2 1: DTT 2:Khơng DTT 370 bp Hình 4.4: Kết PCR từ mẫu có DTT khơng DTT LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 23 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng CTAB việc loại bỏ melanin Bảng 4.5 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu CTAB CTAB Chỉ tiêu P 0,0% 0,06% 0,2% Tỷ số OD 1,84 0,09 1,6 0,04 1,3 0,03 0,001 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,17 0,04 0,16 0,06 0,1 0,02 0,46 Số mẫu 5 1.84 1.6 1.5 1.3 Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) 0.5 0.17 0.16 0.1 CTAB 0,0% CTAB 0,06% CTAB 0,2% Biểu đồ 4.5: Tỷ số OD DNA ly trích dung dịch đệm có khơng có CTAB Có sai biệt tỷ số OD hàm lƣợng DNA từ quy trình ly trích DTT khơng sử dụng CTAB quy trình có CTAB Sử dụng CTAB nồng độ cao độ tinh DNA giảm Theo Sambrook ctv (2001), CTAB đƣợc loại khỏi dung dịch kết tủa DNA hỗn hợp phenol Tuy nhiên có lẽ hỗn hợp phenol chƣa thể loại hết đƣợc CTAB khỏi dung dịch kết tủa DNA, cần phải tìm thêm chất để có khả loại bỏ CTAB hiệu DNA từ dung dịch đệm có bổ xung CTAB 0,06% chạy PCR gen giới tính halothane khơng có dấu hiệu phản ứng 4.6 Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA phản ứng PCR Bảng 4.6 Kết PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung Nồng độ BSA (µg/µl) Số mẫu tiến hành Kết PCR * 0,0005 Băng 370 bp Băng 370 bp 0,01 0,1 0,5 1 Băng 370 bp Không dấu hiệu Không dấu hiệu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 24 * Chỉ phát băng ngắn gen giới tính, khơng có sản phẩm PCR gen halothane Sản phẩm PCR từ DNA ly trích từ lơng bị cho băng dài 370 bp Số mẫu có sản phẩm PCR mẫu có BSA nồng độ 0,0005 µg/µl; 0,01 µg/µl; cịn mẫu dùng BSA nồng độ 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl không cho sản phẩm PCR Một mẫu DNA ly trích từ lơng heo có bổ sung BSA 0,1 µg/µl; 0,5 µg/µl cho sản phẩm âm tính Nồng độ BSA nhỏ băng điện di sáng Điều cho thấy lƣợng BSA thêm nhiều phản ứng PCR trở thành chất ức chế phản ứng ĐC ĐC 1,2: Khơng BSA 3: 0,0005 ng/µl BSA 655 bp 370 bp 4: 0,01 ng/µl BSA 5: 0,1 µg/µl BSA 6: 0,5 µg/µl BSA Hình 4.6: Kết PCR từ mẫu sử dụng BSA không sử dụng BSA Qua thí nghiệm, PCR xác định gen giới tính có băng 370 bp; PCR xác định gen halothane không cho băng Trong thí nghiệm đánh giá ly trích từ lơng rụng tự nhiên, Vigilant (1999) thấy DNA ty thể khuếch đại đoạn lên tới 300 bp với tỷ lệ thành công 80%, giảm xuống 60% đoạn 400 bp 15% cho đoạn 500 bp (McNevin ctv, 2005) Cũng theo McNevin ctv (2005), ngƣời ta nghĩ DNA ty thể dễ dàng ly trích từ lơng diện với số lƣợng lớn Allen ctv (1998) tìm thấy khác số lƣợng DNA đòi hỏi cho khuếch đại PCR thành công phù hợp với số lƣợng copy tế bào, DNA nhân (1 copy tế bào) DNA ty thể (103 – 104 tế bào) Do đó, chúng tơi nghĩ quy trình ly trích lơng chƣa đƣợc tối ƣu hố nên khơng thể kéo dài băng 655 bp gen giới tính 586 bp gen halothane LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K Ca2+ nồng độ mM, mM, 10 mM cho DNA với tỷ số OD khoảng 1,6 – 1,69 Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA gốc lơng bị ly trích dung dịch đệm 10 mM Ca2+ cho băng dài 370 bp - DNA từ gốc lơng bị (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh hàm lƣợng cao DNA từ lông ( OD = 1,2) - Mẫu gốc lông heo gốc lông bị khơng khác tỷ số OD hàm lƣợng DNA ly trích - DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh DNA từ dung dịch đệm khơng có DTT (1,58) - Nồng độ CTAB trình ly trích ảnh hƣởng đến độ tinh DNA - Sử dụng nồng độ BSA từ 0,0005 µg/µl đến 0,5 µg/µl phản ứng PCR không cải thiện đƣợc hiệu PCR dùng DNA từ mẫu lông - Quy trình ly trích với dung dịch đệm chứa proteinase K Ca2+ hiệu ly trích DNA với đoạn khuếch đại dƣới 400 bp Tóm lại, Ca2+ dung dịch đệm ly trích cải thiện tỷ số OD nhƣng cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp) gen giới tính khơng có sản phẩm PCR gen halothane 5.2 Đề nghị - Làm thêm thí nghiệm với nồng độ Ca2+ từ 10 – 40 mM để xác định nồng độ cho hiệu tối ƣu - Cần tìm chất có khả loại CTAB khỏi quy trình ly trích LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 26 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt Lê Thị Thu Phƣơng, 2004 Phát gen halothane, gen thụ thể estrogen mối liên quan hai gen đến suất sinh sản heo nái Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Văn Út, 2005 Xác định giới tính kỹ thuật Multiplex PCR giống bò Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam *Tài liệu Tiếng Anh Biorad, 2005 - D electrophoresis for proteomics: A method and product manual Dale J W., Schantz M V., 2002 From genes to genomes: Concepts and applications of DNA technology From genes to genomes Copy right John Wiley Sons, Ltd Eggling S., 2001 - 2003 Structual protein Clackamas Community College, Hal Bender http://dl.clackamas.cc.or.us/ch106 - 08/structural proteins.htm Galan M., Baltzinger C., Hewison A J M., Cosson J., 2003 Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method Trends in Ecology and Evolution 12: 223 – 227 Haase A., Retzel E F., Stakus K A., 1990 Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells Proc Natl Acad SC! USA 87,4971 – 4975 Hair handout, 2005 CHEM 107 http:// www.fbi.gov James N J., Mary V A., 2004 Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii) Zoo Biology 23:521– 531 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 27 10 McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005 Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair Forensic Science International.153 : 237 – 259 11 Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C , Lobie P E., 1998 In situ reverse transcription - polymerase chain reaction Applications for light and electron microscopy Biology of the Cell 90: 137 154 12 Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999 Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences Legal Med 1: 61 – 67 13 Rees J L., 2003 Genetics of hair and skin colour Annu Rev Genet 37: 67 – 90 14 Sake R K., Scharf S., Faloona F., Mullis K B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985 Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia Science 230,1350 – 1355 15 Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G I., 2000 Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay Nucleic Acids Research 28: 23 16 Schnabel R D., Ward T J., Derr J N., 2000 Validation of 15 microsatellites for parentage testing in North American bison, Bison bison and domestic cattle Animal Genetics 31: 360 – 366 17 Vigilant L., 1999 An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs Bio Chem 390 : 1329 – 1321 18 Wagner M, Bailey D.G.,1993 Structure of bovine and hair root-A scanning electron microscope investigation Superior systems service 13: 61 – 78 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 PHỤ LỤC * Hoá chất dùng đề tài - Hố chất ly trích DNA KCl 500 mM NaCl 20 mM Tris HCl pH 50 mM, 100 mM SDS 1% + Proteinase K 0,5 mg/ml + Phenol: chloroform: isoamy alcohol + TE buffer Tris HCl 25:24:1 1X 100 mM EDTA( pH 8) mM + Ethanol 70%; 95% + Tris base (pH 8) 2M + Sodium acetate 0,2 M; M + DTT 70 mM + CTAB 0,06%, 0,2% - Hoá chất phản ứng PCR PCR buffer 1X MgCl2 mM Mỗi dNTP 200 µM Mồi xuôi 0,5 µM Mồi ngƣợc 0,5 µM Taq DNA polymerase UI - Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR + Agarose 1,5% + TBE (Tris Borate EDTA) (pH = 8,3) X Tris base 89 mM Acid boric 89 mM Na2EDTA 2,5 mM LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 29 + Loading dye Bromophenol blue 0,3% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% + Ethidium bromide 10 mg/ml * Dụng cụ dùng đề tài - Pipetman loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl - Đầu tip tƣơng ứng với loại pipet man - Eppendorf loại 0,2 ml 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Dụng cụ kéo, kẹp, chày, cối * Thiết bị dùng đề tài - Máy Vortex - Máy ly tâm - Máy PCR - Bộ điện di - Máy chụp gel - Tủ ấm - Tủ trữ mẫu - Tủ trữ hoá chất - Microwave - Cân - Tủ sấy - Máy cất H2O, khử ion - Autoclave - Máy đo OD - Bình N2 lỏng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... đệm ly trích ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA (2) So sánh khả ly trích DNA từ gốc lơng bị (3) So sánh DNA ly trích từ lơng heo lơng bị (4) Khảo sát tác dụng DTT việc phân cắt keratin ly trích DNA. .. bp - DNA từ gốc lơng bị (tỷ số OD trung bình 1,76) có độ tinh hàm lƣợng cao DNA từ lông ( OD = 1,2) - Mẫu gốc lông heo gốc lông bị khơng khác tỷ số OD hàm lƣợng DNA ly trích - DNA ly trích từ dung... PCR từ mẫu sử dụng không sử dụng BSA 24 Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với nồng độ Ca2+ 18 Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD DNA ly trích từ gốc lơng lơng bị 19 Biểu đồ 4.3 Tỷ số