Đang tải... (xem toàn văn)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG o0o ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã 7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU SAM TRỒNG TẠI CÀ MAU BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG ………… o0o………… ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU SAM TRỒNG TẠI CÀ MAU BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TS THIỀU VĂN ĐƯỜNG SINH VIÊN THỰC HIỆN Họ tên: Nguyễn Anh Đầy MSSV: 1752130046 Lớp: ĐH Dược 12A Cần Thơ , 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG ………… o0o………… ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU SAM TRỒNG TẠI CÀ MAU BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN DNA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TS THIỀU VĂN ĐƯỜNG SINH VIÊN THỰC HIỆN Họ tên: Nguyễn Anh Đầy MSSV: 1752130046 Lớp: ĐH Dược 12A Cần Thơ , 2021 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực tập hồn thành tiểu luận Trường Đại học Tây Đô học tập nhiều kiến thức tích lũy nhiều điều bổ ích thời gian làm thực nghiệm Tôi vận dụng nhiều kiến thức lý thuyết vào q trình thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn thầy TS Thiều Văn Đường trực tiếp hướng dẫn làm thực nghiệm đóng góp ý kiến giúp tơi chỉnh sửa hồn thành đề tài tiểu luận Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Khoa Dược – Điều dưỡng Trường Đại học Tây Đơ Thầy Cơ phịng thí nghiệm hỗ trợ giúp đỡ khoảng thời gian làm thực nghiệm Để có kết hơm ngồi cố gắng thân, giúp đỡ thầy cịn có động viên, ủng hộ lớn người thân, gia đình Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, tạo cho thêm động lực ý chí hồn thành báo cáo tiểu luận Tôi xin chân thành cảm ơn! Cà Mau, ngày 12 tháng 10 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Anh Đầy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn TS Thiều Văn Đường Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Cà Mau, ngày 12 tháng 10 năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Anh Đầy TĨM TẮT TÍNH CẤP THIẾT Trong năm gần công nghệ phát triển vượt bật, nhu cầu sức khỏe người ngày cao, cần thêm nhiều thuốc từ dược liệu thiên nhiên nước ta liều dược liệu dể tìm hiệu chữa trị cao Trong có rau sam loại rau dân dã quen thuộc với người Việt Khơng chứa hàm lượng chất xơ, vitamin khống chất dồi dào, rau sam cịn có đặc tính dược lý đa dạng giúp điều trị chứng bệnh thường gặp nhiễm giun kim, giun đũa, đầy trướng bụng, bệnh trĩ, mề đay, mẩn ngứa, côn trùng cắn,… chuyên đề thực để khẳng định tên khoa học rau sam thị hình thái giải trình gen AND, thị phân tử vai trò Rau Sam chữa trị bệnh, bổ sung sức khỏe cho người PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài tiến hành dựa phương pháp nghiên cứu là: Phương pháp nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu tổng hợp tài liệu Phương pháp thị phân tử để xác định xác gen đặc trưng, (trình tự nucleotid gen ITS) Rau Sam theo phương pháp Sanger KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết thu thập thị hình thái : Thân, Lá, Rễ, Hoa, Quả, Hạ Hồng thiện quy trình chiết xuất tinh DAN PCR Kết tạo lập thị phân tử DNA Rau Sam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Rau sam loại rau dân dã quen thuộc với người Việt Không chứa hàm lượng chất xơ, vitamin khoáng chất dồi dào, rau sam cịn có đặc tính dược lý đa dạng giúp điều trị chứng bệnh thường gặp nhiễm giun kim, giun đũa, đầy trướng bụng, bệnh trĩ, mề đay, mẩn ngứa, côn trùng cắn,… Nghiên cứu khoa học cho thấy rau Sam có tác dụng ngăn chặn phát triển vi trùng lỵ thương hàn Dịch chiết rau Sam cồn etylic có hiệu rõ rệt trực khuẩn Coli, kiết lỵ thương hàn Những nhà khoa học Mỹ Úc cịn cho biết rau Sam có nhiều acid béo Omega-3 có tác dụng tốt việc ngăn ngừa bệnh tim mạch tăng cường sức miền dịch thể Chuyên đề thực để khẳng định tên khoa học rau sam thị hình thái giải trình gen AND, thị phân tử vai trò Rau Sam chữa trị bệnh, bổ sung sức khỏe cho người Vì lý đến thực đề tài “Xác Định Tên Khoa Học Của Cây Rau Sam Trồng Tại Cà Mau Bằng Chỉ Thị Hình Thái Và Giải Trình Tự Gen DNA” Đề tài hoàn thành đảm bảo mục tiêu xác lập thị phân tử làm công cụ xác định tiềm trở thành dược liệu rau sam Để hoàn thành mục tiêu đòi hỏi nghiên cứu phải thực mục tiêu cụ thể sau đây: - Khái quát hiểu biết Rau Sam - Sử dụng thị hình thái mơ tả xác đặc điểm thực vật học Rau Sam - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh DNA Rau Sam - Giải trình trình tự gen ITS Rau Sam làm thị phân tử 10 * TE pH (10 :0,1) + 600µl Tris.HCL M pH = + 12µl EDTA 0,5 M pH = + Thêm dH2O cho đủ V = 60 ml * RNase – 10mg RNase/10 ml H2O đun sôi 10-15 phút, giữ - 20 oC * Hỗn hợp Chloroform: isoamylalcohol (24:1) * Ethanol tuyệt đối ethanol 70% giữ - 20 oC 2 2 Kiểm tra độ tinh xác định nồng độ DNA Độ tinh DNA Rau Sam kiểm tra cách xác định O.D 260 nm O.D 280nm máy quang phổ kế Tỷ lệ O.D 260/O.D280 khoảng từ 1,6 - 1,8 DNA đủ độ tinh Tỷ lệ O.D260/O.D280 nhỏ giới hạn DNA khơng tinh mẫu cịn lẫn protein hay tạp chất Nồng độ DNA tính theo cơng thức: DNA = 50 độ pha loãng, cuvet mẫu đo ta cho µl mẫu Kiểm tra DNA điện di gel agarose - Chuẩn bị gel agarose Cân 1g agarose, đun sôi 100ml 1xTAE agarose tan hết Để nguội xuống 50 - 60 oC, cho thêm µl EtBr, lắc đều, đổ dung dịch agarose vào khay gel cài lược sẵn, để nguội, rút lược Đặt khay gel vào bể điện di cho 1xTAE ngập gel từ - mm Tra mẫu điện di: tra mẫu vào giếng điện di (chú ý thứ tự mẫu) Mẫu DNA trộn với thuốc nhuộm Bromophenol blue 0,25% nước cho đủ 10 µl (2:2:6) Cường độ dịng điện thời gian chạy điện di phụ thuộc vào mẫu điện di mục đích sử dụng Thường để thuốc nhuộm qua giếng mm Kiểm tra mẫu điện di máy soi DNA (tia UV) - Hóa chất: * 1xTAE pha từ dịch gốc 20xTAE: + 96,8 g Tris base + 22,84 ml glacial acetic acid + 40 ml EDTA 0.5 M Chỉnh pH = Acetic acid Thêm H2O khử trùng đủ lít * Thuốc nhuộm Bromophenol Blue 0,25% Bromophenol Blue 0,05 g 40% Saccharose nước g H2O khử trùng - - - - - - - - - - - Thêm H2O cho đủ 20 ml 29 2 Kỹ thuật phân tích DNA thị vi vệ tinh (SSR) Kỹ thuật thực theo phương pháp Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Khoa thực vật Thổ nhưỡng, thuộc trường ĐH Cơng nghệ Texas, Hịa Kỳ Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR Bảng Thành phần thứ tự phản ứng PCR Thành phần Nước cất lần khử ion, khử trùng 5xPCR Buffer (với dNTP, loại 10 µl + 10 µl BSA +450 µl dH2O) MgCl2 Mồi thuận (10 µM) Mồi nghịch (10 µM) TaqDNA polymerase (5units/µl) ADN khn (30 ng/µl) Tổng thể tích Thứ tự Thêm vào Thể tích (µl) X Nồng độ cuối * 1x(dNTP= 200 µl) 4 0,64 y 15 mM 0,2 µM 0,2 µM 0,3 1.5 Units 90 ng/20 µl 20 µl - Để làm phản ứng, Pha DNA khn (template) mẫu đồng 30ng/lµl - Kiểm tra mồi để làm phản ứng, với mồi tốt dùng 0,32µl (10µM/µl) cho phản ứng (tổng số 20µl) - Trình tự primer ITS ITS 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC- Thành phần thứ tự phản ứng PCR: - Sau làm xong phản ứng ta ly tâm 2000v/phút, cho mẫu lắng xuống máy ly tâm cân Khi tốc độ đạt 2000v/phút ta lấy - Tiến hành phản ứng PCR Mỗi phản ứng PCR chúng tơi thường chạy 30 chu kỳ Chường trình chạy phụ thuộc nhiệt độ ủ (annealing) mồi Thường nhiệt độ ủ 55 0, ta có chương trình cài đặt sau: Bảng Chương trình cài đặt bước 30 Các bước I II III IV Nhiệt độ (oC) 94o 95o 55o 72o 72o 4o Thời gian 5’ 1:30’’ 1:30’’ 1:30’’ 5’ Cho đến lấy Số chu kỳ 30 (Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) Trường hợp nhiệt độ ủ 60 oC hay 63 oC ta thay đổi nhiệt độ ủ 55 oC bước II thành 60 oC hay 63 oC 2 Phương pháp xử lý số liệu Phân tích phân ly di truyền Các số liệu phân tích phân ly di truyền tính trạng kháng rầy xử lý thống kê (Gomez and Gomez, 1984) theo phép thử “x2” Như đây, có lớp phân ly (m=2), ta có: X2 = Cịn trường hợp có lớp phân ly (m>2), ta có: X2 = Trong đó: i= 1, 2, …., m m số lớp phân ly Qi tần số quan sát thực tế lớp i Li tần số xuất lý thuyết lớp i Từ giá trị X2 tìm được, tra bảng thống kê để tìm giá trị P tương ứng Nếu P > 0,05 tỉ lệ phân ly thực nghiệm coi phù hợp với lý thuyết Tương dồng di truyền khoảng cách di truyền Phân tích mức tương đồng di truyền khoảng cách di truyền theo chương trình PopGene, theo cơng thức Nei (1972) [146] : I= D = - ln (I) Trong : I – mức tương đồng di truyền D – khoảng cách di truyền mẫu q12 – số alen đồng mẫu Q1 Q2 tổng số alen mẫu mẫu Phân tích liên kết Phân tích liên kết thị phân tử với locut gen kháng rầy nâu định vị locut gen kháng rầy nâu nhiễm sắc thể lúa tiến hành theo chương trình máy tính MapMarker 31 2 Giải trình tự DNA xác định gen ITS Kỹ thuật dựa phương pháp Sanger (Sanger et al., 1977) Mỗi loại dideoxynucleotid đánh dấu chất huỳnh quang có màu khác Nhờ oligonucleotid cúng chấm dứt dideoxxynucleotid có màu DNA giải trình tự cơng ty DNA Sequencing ServicesGeneral Order Information, Hàn Quốc máy đọc trình tự tự động 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT 2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết - Phương pháp thu thập thơng tin, phân tích, so sánh, tổng hợp - Phân loại thông tin nghiên cứu 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu tài liệu - Nội dung cần thu thập trình nghiên cứu tài liệu - Nguồn tài liệu: Bài báo, Hội thảo khoa học, Giáo trình Hóa sinh, Luận văn Luận án khoa học liên quan đến Húng chanh, trang Web liên quan - Phân tích tài liệu - Tổng hợp tài liệu 2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU - Tôn trọng đối tượng nghiên cứu - Các thông tin thu thập phải đảm bảo xác, có độ tin cậy cao - Kết nghiên cứu không làm ảnh hưởng đến hoạt động kinh doanh sản xuất quan nghiên cứu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ THU THẬP MẪU VÀ CHỈ THỊ HÌNH THÁI Mẫu … thu thập …… vị trí: - Kinh độ: … - Vĩ độ: …… Passifloraedulis Loài (species): … Chi (genus): … Họ (familia): … Bộ (ordo):… Lớp : Giới (regnum): Tên khác : 1.1 Thân Lá 3 Rễ Hoa 3.1.5 Quả Hạt Hình Tọa độ địa lý HỒN THIỆN QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT TINH SẠCH DNA VÀ PCR 3.2.1 Quy trình chiết xuất tinh DNA rút gọn 3.2.2 Quy trình thực phản ứng PCR rút gọn 3.2.2.1 Chuẩn bị phản ứng chuỗi PCR 3.2.2.2 Thành phần thứ tự phản ứng PCR: 3.2.2.3 Tiến hành phản ứng PCR 3.2.2.4 Kiểm tra độ tinh xác định nồng độ DNA 3 KẾT QUẢ TẠO LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CÂY RIỀNG NẾP 3.3.1 Kết chiết xuất tinh DNA 3.3.2 Kết giải trình tự gen DNA 3.3.3 Kết phân tích độ tương đồng NCBI MỘT SỐ KẾT QUẢ BỔ SUNG VAI TRÒ DƯỢC CHẤT CÂY …………… 33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu, tổng hợp tài liệu qua báo cáo khoa học khẳng định 4.1.1.Mẫu …… thu thập ……… vị trí: - Kinh độ: - Vĩ độ: Tên khoa học: Loài (species): Chi (genus): Họ (familia): Lớp: Giới (regnum): Plantae Hình Tọa độ địa lý Tên khác: Đặc điểm thị hình thái thu phù hợp với …… mô tả đề tài Thân Lá Rê Hoa Quả Hạt Kết luận: 4.1.2 Hồn thiện quy trình chiết xuất tinh DNA chu kỳ PCR …… 4.1.3 Kết chiết xuất tinh DNA … trình tự gen của 4.2 KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 Trương Thị Đẹp(2007), Thực Vật Dược, NXB Giáo Dục Hà Nội Tuệ Tĩnh Thiền Sư, Tuyển tập 3033 Cây Thuốc Đông Y Việt Nam Đỗ Tất Lợi (2015), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Vệt Tân, Xác Định Tên Khoa Học Của Cây Hương Nhu Trắng (Ocimum Gratissimum L) Tồng Tại Trà Vinh Bằng Chỉ Thị Hình Thái Và Giải Trình Tự DNA website 1.https://tailieu.vn/doc/bai-giang-chi-thi-phan-tu 286739.html https://tailieu.vn/doc/bai-giang-chi-thi-phan-tu 286739.html https://www.dieutri.vn/duocdiendongduoc/rau-sam-herba-portulacae https://www.dieutri.vn/caythuocchualy/cay-rau-sam https://tcmwiki.com/wiki/herba-portulacae 5.https://mangyte.vn/news-rau-sam-herba-portulacae-thuoc-dong-duoc-tri-dinh-nhot55592.html 6.https://vi.wikipedia.org/wiki/Rau_sam#L%E1%BB%8Bch_s%E1%BB%AD https://tailieumienphi.vn/doc/rau-sam-toan-cay-lgjwtq.html https://tailieu.vn/doc/cay-thuoc-vi-thuoc-dong-y-rau-sam-551559.html https://www.hatgionglamson.com/san-pham/hat-giong-rau-sam-262.html 10 http://uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=book/export/html/330 11 https://123docz.net/document/208002-buoc-dau-danh-gia-muc-do-da-dang-ditruyen-cua-quan-the-dieu-tai-tinh-ba-ria-vung-tau.htm 12 https://vi.wikipedia.org/wiki/Rau_sam 13 https://1001caythuoc.com/tim-hieu-ve-cay-rau-sam-va-cac-cach-dieu-tri-benh-tuthao-duoc-nay/ 14 https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-tren-can/rau-sam 15 https://tailieu.vn/doc/nhung-nghien-cuu-moi-ve-rau-sam-1031724.html 16 https://songkhoe.medplus.vn/loi-ich-cua-rau-sam/amp/ PHỤ LỤC Phụ lục A III Phụ lục Quy trình ly trích DNA - Tách chiết DNA: Nghiền 200馬l mẫu túp eppendorf máy nghiền 35 - Thêm 1ml dung dịch trích (EB) 50馬l SDS (10%) Ủ 65° 30’ (5’ đảo nhẹ) Li tâm 13.000rpm 10’ Chuyển phần (800µl) vào túp thêm lượng tương đương Isopropanol, ủ -20oC - Li tâm 13.000rpm 10’, hoà tan DNA 400 µl TE - Thêm 10µl Rnase (10mg/ml) ủ 37° 15’ - Thêm 400µl CTAB buffer ủ 65° 15’, đảo ngược ống túp để trộn - Thêm 800µl Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) trộn đều.Litâm 13.000rpm 5’ - Chuyển phần dung dịch qua túp 2.2 ml mới, thêm 1ml Ethanol 96% ủ nhiệt độ phòng 15’ - Li tâm 13.000rpm 10’, đổ bỏ phần rửa phần cặn với ethanol 70% 700µl.Li tâm lần để loại bỏ ethanol - Để vào máy li tâm chân khơng 45° 10’ - Hồ tan DNA 200µl TE 0.1 (Nguồn: Sổ tay thực hành SHPT Trần Nhân Dũng, NXB: ĐHCT, 2011) Phản ứng PCR Sau tinh DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau: ITS 1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4: 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’ Quá trình thực phản ứng PCR: Hóa chất H20 PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4) Polymerisation MgCl2 (25mM) dNTPS Primer F Primer R Taq DNA polymerase (5u/µL) DNA Tổng cộng Giai đoạn Tên giai đoạn Thể tích (µl) 34,5 3 1 0,5 50 Chu kỳ Biến tính 30 Bắt cặp 30 Kéo dài 30 36 Nhiệt độ (0C) 95 95 54 72 72 Thời gian phút 60 giây 50 giây 90 giây giây Sản phẩm PCR tinh giải trình tự hệ thống giải trình tự động Kết so sánh với sở liệu GenBank trang web NCBI công cụ BLASTN 37 Phụ lục B CÁC HÌNH ẢNH CÂY RAU SAM 38 XÁC NHẬN CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TP Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2021 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN TS THIỀU VĂN ĐƯỜNG 39 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM Họ Tên:… Nhận xét: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………… ĐIỂM KÝ TÊN 40 NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA GIẢNG VIÊN CHẤM Họ Tên:…………………………… …………………………………… Nhận xét: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………… ĐIỂM KÝ TÊN 41 .. .KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG ………… o0o………… ĐỀ CƯƠNG KHOA HỌC Mã:7720201 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY RAU SAM TRỒNG TẠI CÀ MAU BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI... trò Rau Sam chữa trị bệnh, bổ sung sức khỏe cho người Vì lý đến thực đề tài ? ?Xác Định Tên Khoa Học Của Cây Rau Sam Trồng Tại Cà Mau Bằng Chỉ Thị Hình Thái Và Giải Trình Tự Gen DNA” Đề. .. cắn,… chuyên đề thực để khẳng định tên khoa học rau sam thị hình thái giải trình gen AND, thị phân tử vai trò Rau Sam chữa trị bệnh, bổ sung sức khỏe cho người PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đề tài tiến