PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG mẫu THỨC ăn DÙNG NUÔI vỗ tôm sú bố mẹ (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian em học tập trường Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hồn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có hội học tập thêm kiến thức thực tế Chân thành cảm ơn anh Đào Bá Cường anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khố 14) nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu thu Bạc Liêu Cà Mau năm 2009 Xin cám ơn tập thể bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 động viên, giúp đỡ, trao đổi kiến thức suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp Khoa Thủy Sản Chân thành cảm ơn anh, chị môn Sinh học Bệnh thủy sản đặc biệt chị Trần Việt Tiên anh Hoàng Tuấn nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình suốt thời gian thực luận văn Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ hai chị động viên suốt thời gian học Đại học khoảng thời gian làm luận văn Xin chân thành cảm ơn chúc Quý thầy cô anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe thành công sống i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Kể từ xuất từ đầu năm chín mươi bệnh đốm trắng trở thành bệnh nguy hiểm hàng đầu nghề ni tơm tồn giới Tính chất nguy hiểm bệnh khơng gây chết diện rộng thới gian ngắn với phổ lồi cảm nhiễm rộng việc phát WSSV lồi có ý nghĩa việc phòng chống lan truyền mầm bệnh Vì đề tài: “Phát white spot syndrome virus (WSSV) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” thực nhằm phát thêm loài vật mẫn cảm đánh giá nhiễm WSSV lồi có khả đưa mầm bệnh vào hệ thống nuôi Việc phát WSSV mẫu thức ăn tươi sống thực với qui trình PCR Kimura et al.1996 (Trần Thị Phương Trang tối ưu tháng năm 2009) kít IQ2000 cơng ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan Việc khẳng định ảnh hưởng WSSV mẫu thứ ăn cấp đô mô, tế bào thực phương pháp mô học Thành phần loại thức ăn thu Bạc Liêu nhiều Cà Mau tỉ lệ nhiễm mẫu Cà Mau (59 %) cao Bạc Liêu (54 %) Kết PCR kít IQ2000 cho thấy mẫu nhiễm WSSV mức độ nhẹ Kết mô học số ốc mượn hồn cho thấy ảnh hưởng WSSV tế bào mơ liên kết dày Từ hồn tồn khẳng định nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống trại sản xuất giống thu từ Bạc Liêu Cà Mau ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ……………………………………………………………… i TÓM TẮT………………………………………………………………… …ii DANH SÁCH BẢNG……………………………………………………… v DANH SÁCH HÌNH………………………………………………………… vi PHẦN I: GIỚI THIỆU……………………………………………………… PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU…………………………………… 2.1.1 Sơ lược tình hình ni tơm giới…………………… …… …2 2.1.2 Ở Việt Nam……………………………… ………………………… ….2 2.2 Sơ lược bệnh đốm trắng……………………………………… …….….3 2.2.1 Dấu hiệu bệnh lý……………… …………………………………………3 2.2.2 Phổ loài cảm nhiễm………………………… ……………………………4 2.2.3 Phương thức lan truyền…………………………… ……………………5 2.2.4 Phương pháp chẩn đoán – phát bệnh 2.2.5 Cách phòng bệnh 2.2.6 Một số nghiên cứu phát WSSV ………………………………….7 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ……… ….9 3.1 Địa điểm thời gian thực hiện……………………………………….…….9 3.2 Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… ….9 3.2.1 Mẫu vật……………………………………………………………… … LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 3.2.2 Dụng cụ hóa chất………………………………………………… …….9 3.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… ……9 3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN dựa theo kit IQ2000 – WSSV công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan……………………………………………………………………… ……10 3.3.2 Phương pháp PCR phát WSSV (Kimura et al 1996)……………….11 3.3.3 Phương pháp PCR phát WSSV theo kit IQ2000–WSSV (công ty Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)…………………… 14 3.3.5 Phương pháp mô học…… ……………………………………… …… 15 3.3.6 Phương pháp phân tích xử lý thống kê ………………………… ……17 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống ni vỗ tôm sú bố mẹ hai tỉnh Bạc Liêu Cà Mau……………………………………………………… ……18 4.2 Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn…………………… 19 4.2.1 Sự nhiễm WSSV mẫu ốc mượn hồn………… ………………………19 4.2.2 Sự nhiễm WSSV mẫu mực…………………………………………….21 4.2.3 Sự nhiễm WSSV tôm tít………………… ………….…………… 22 4.2.4 Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSVIQ2000 ……………………………………………………………………… 23 4.2.5 Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn với phương pháp mô học 24 4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Bạc Liêu……………25 4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Cà Mau…………… 27 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………28 5.1 Kết luận…………………………………………………………… …… 28 5.2 Đề xuất…………………………………………………………………… 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 29 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi Kimura et al 1996 Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi gen nội chuẩn (Csiro, 2008) Bảng 3.3 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng bước Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước Bảng 4.1 Kết loại thức ăn tươi sống sử dụng trại sản xuất tôm sú giống Bạc Liêu Cà Mau Bảng phụ lục A: Câu hỏi điều tra thông tin trại giống Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng qui trình PCR Kimura et al (1996) tối ưu Trần Thị Phương Trang (2009) Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Các mẫu ốc thu từ trại sản xuất giống tôm sú Bạc Liêu Cà Mau Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực tơm tít Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trại sản xuất giống Bạc Liêu Hình 4.4 Mẫu tơm tít dùng cho tơm mẹ Bạc Liêu Hình 4.5 Kết điện di mẫu chạy PCR với kit IQ2000 Hình 4.6 Tế bào liên kết dày ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy ốc mượn hồn (H&E, 40X) Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thu từ Bạc Liêu vi LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung Đồng Bằng sơng Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng phát triển mạnh, ngành kinh tế mũi nhọn nước Trong cá tra, cá ba sa tơm sú đối tượng ni chiếm ưu ngành nuôi thủy sản nước Tuy nhiên năm qua với phát triển ạt, tự phát, thiếu quy hoạch thiếu nhận thức môi trường dịch bệnh người dân nên tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, gây thiệt hại không nhỏ cho người ni Đây ngun nhân làm cho nghề nuôi trồng thủy sản không ổn định thiếu bền vững Có nhiều bệnh gây tổn thất lớn cho nghề ni tơm nói chung cho tơm sú nói riêng biết đến bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus-YHV), bệnh còi (Monodon Baculovirus- MBV) đặc biệt bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus-WSSV) bệnh nguy hiểm gây tỉ lệ chết cao, lây lan nhanh đặc biệt phổ loài cảm nhiễm rộng Tất lồi tơm he bị cảm nhiễm loại virut này, lồi cua, cịng ao ni hay chí ấu trùng trùng thủy sinh mang mầm bệnh nguồn lây bệnh nguy hiểm Do việc nghiên cứu phổ lồi cảm nhiễm nhằm giúp kiểm sốt khống chế bệnh cần thiết mà công tác chữa trị không mang lại hiệu Vì đề tài “Phát white spot syndrome virus (WSSV) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ” thực Mục tiêu đề tài Tìm hiểu khả nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống dùng trại sản xuất giống tôm sú khu vực Cà Mau Bạc Liêu Nội dung đề tài - Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Cà Mau - Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Bạc Liêu LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.2.3 Sự nhiễm WSSV tơm tít Các lồi tơm tít thức ăn ưa thích tơm bố mẹ nhiên trại sử dụng loại tơm nghi khả nhiễm WSSV chúng Hình 4.4 Mẫu tơm tít dùng cho tơm mẹ Bạc Liêu Cả mẫu tơm tít thu từ trại sản xuất giống thuộc khu vực Bạc Liêu tất dương tính với WSSV Kết hình 4.2 (giếng 6, 7, 8) cho thấy WSSV diện mẫu tơm tít thu Bạc Liêu, phát với phương pháp PCR bước Kết tương đồng với kết nghiên cứu nhà khoa học Ấn Độ (Hossain et al 2000) Với phương pháp PCR bước, nhóm tác giả công bố diện WSSV nhiều loài khác (Metapenaeus dobsoni, Parapenaeopsis stylifera, Solenocera indica…) tơm tít (Squilla mantis) Bên cạnh kết nghiên cứu Lo et al (1996) loài giáp xác hoang dại đánh bắt từ tự nhiên (tôm sú tự nhiên, tôm he Nhật, tôm rằn, tôm thẻ đỏ) cho kết WSSV dương tính PCR bước Tuy số lượng mẫu tơm tít kiểm tra khơng nhiều tin vào khả tồn WSSV mẫu tôm 22 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.2.4 Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-IQ2000 Một số mẫu dương tính hai tỉnh Bac Liêu Cà Mau chọn để kiểm tra với kit WSSV-IQ2000 Kết cho thấy mẫu kiểm tra bị nhiễm WSSV với cường độ nhẹ (hình 4.5) Các mẫu vạch tương ứng 296 bp xuất vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp Theo nghiên cứu Chưng Thị Nghiễm (2009) mẫu cua tạp thu từ ao tôm Cà Mau phát nhiễm WSSV với qui trình kit WSSV-IQ2000 Hình 4.5 Kết điện di mẫu chạy PCR với kit IQ2000 Giếng M thang ADN Giếng mẫu ốc Cà Mau Giếng 2, mẫu ốc Bạc Liêu Giếng mẫu mực dương tính Bạc Liêu Kết góp phần khẳng định nhiễm WSSV mẫu nghiên cứu Tuy sản phẩm PCR sử dụng kít WSSV-IQ2000 cho vạch không rõ 23 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com sử dụng phương pháp Kimura et al 1996 qui trình đánh giá mức độ nhiễm mẫu 4.2.5 Xác định nhiễm WSSV mẫu thức ăn với phương pháp mô học Kết nghiên cứu mô học ốc mượn hồn cho dấu hiệu đặc trưng nhiễm WSSV Các tế bào mô liên kết xuất thể vùi WSSV với vùng sáng bao quanh (hình 4.6) Do lần mô ốc mượn hồn cắt thử theo qui trình tơm nên hình ảnh cịn chưa đẹp quan phát vùi WSSV khơng nhiều Hình 4.6 Tế bào liên kết ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X) Dấu mũi tên tế bào có nhân phì đại với thể vùi WSSV Dấu hiệu không khác so với dấu hiệu mô học tôm Lightner (1996) Lo et al (1997) Theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) xâm nhập vào thể tôm, WSSV tạo thể vùi nhân tế bào mang, biểu bì ruột, dày, biểu bì vỏ, quan lymphoid, tim, tuyến râu Cơ quan công WSSV ốc mượn hồn phát nghiên cứu tế bào liên kết dày chúng không công tế bào tuyến gan tụy (hình 4.7) Kết cần tìm hiểu thêm với số lượng mẫu nhiều 24 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy ốc mượn hồn (H&E, 40X) Từ kết mơ học tin WSSV hồn tồn có khả gây biến đổi mơ học tế bào liên kết dày ốc mượn hồn hay loài ốc mẫn cảm với WSSV tổn thương gây tương tự tôm 4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Bạc Liêu Ở khu vực Bạc Liêu, ba loại thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tơm tít) thu với số lượng loại khác Trong 1/5 mẫu mực cho kết dương tính với WSSV chiếm tỉ lệ 2,17 % tổng số mẫu kiểm tra Trong tôm tít kiểm tra mẫu tất dương tính chiếm 6,52 % Các mẫu chiếm đa số đợt kiểm tra mẫu ốc mượn hồn với tỉ lệ nhiễm WSSV 45,65 % Tỉ lệ nhiễm trại khơng giống nhau, có trại dương tính 5/5 mẫu kiểm tra (2 trại), có trại nhiễm mẫu (5 trại) Theo Lo et al (1996), kết phân tích PCR họ mười chân nhóm chân đốt hoang dại thu từ ao tơm tỉ lệ nhiễm WSSV 12,5 % Cùng với kết nghiên cứu Lo et al (1996) loài giáp xác đánh bắt từ tự nhiên cho kết dương tính với WSSVcủa mẫu khác Cụ thể tơm sú tự nhiên tỉ lệ nhiễm 33,78 %, tôm he Nhật 9,45 %, tôm rằn 1,35 % tôm thể đuôi đỏ 2,02 % Tỉ lệ nhiễm trung bình tơm tít chấp nhận so với lồi tơm thu từ tự nhiên 25 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Lo et al 1996 nghiên cứu phát việc nhiễm WSSV cua hại mà họ thu chiếm 15,62 % Tỉ lệ thấp so với tỉ lệ nhiễm ốc mượn hồn nghiên cứu kết luận phương pháp sử dụng nghiên cứu khác Nhưng điều khẳng định tồn mầm bệnh WSSV mẫu kiểm tra Tóm lại, tùy thuộc vào phương pháp số lượng mẫu thu mà tỉ lệ nhiễm mẫu khác Các mẫu kiểm tra đa số ốc mượn hồn nhóm chiếm tỉ lệ nhiễm cao (hình 4.8) Phần trăm mẫu nhiễm WSSV Bạc Liêu Mẫu mực 2,17% Mẫu tơm tích 6,52% Mẫu âm tính 45,66% Mẫu ốc 45,65% Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thu từ Bạc Liêu 26 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn Cà Mau Ở khu vực Cà Mau, ốc mượn hồn loại thức ăn sử dụng tổng số 18 trại thu tỉ lệ nhiễm WSSV 59,26 % (48/81 mẫu) tổng số mẫu phân tích kiểm tra PCR bước Tình hình nhiễm WSSV trại khác nhau, trại nhiễm toàn mẫu kiểm tra, trại có 1/5 2/5 mẫu nhiễm WSSV, trại nhiễm 4/5 mẫu kiểm tra hay hoàn toàn cho kết âm tính mẫu kiểm tra (4 trại) Theo S K Otta et al (1999) dùng kỉ thuật PCR phát WSSV loài giáp xác nuôi tự nhiên Ấn Độ Nghiên cứu tiến hành nhiều đối tượng khác (tôm, cua, artemia…), đối tượng biểu bệnh không biểu bệnh đốm trắng Trên mẫu cua Scylla serrata khơng có dấu hiệu bệnh, tỉ lệ nhiễm 15 % (3/20 mẫu cua khỏe), tôm mẹ dấu hiệu WSSV 3/3 mẫu, tơm mẹ có dấu hiệu WSSV 7/7 mẫu, artemia khỏe 1/1 mẫu Một số mẫu cua khác kiểm tra cho kết âm tính với WSSV Theo Chu-Fang Lo et al (1996), lồi trùng thủy sinh, họ mười chân, cua tạp, tôm tạp hại có kích thước nhỏ kết nghiên cứu nhóm tác giả sau: nhộng trùng thủy sinh 19,04 %, họ mười chân 9,52 %, tôm tạp 28,57 % cua tạp 11,9 % mẫu dương tính với PCR bước Dù mẫu thu ngẫu nhiên từ hai tỉnh khác (Bạc Liêu 15 trại Cà Mau 18 trại) kết dương tính với WSSV lại chiếm tỉ lệ gần (Bạc Liêu 54,34 % Cà Mau 59,26 %) Tóm lại, tỉ lệ nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống thu từ trại sản xuất giống tôm sú Cà Mau (59 %) cao Bạc Liêu (54 %) thành phần thức ăn có nguồn gốc thủy sản Bạc Liêu đa dạng Cà Mau 27 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - WSSV phát thức ăn tươi sống (ốc mượn hồn, mực, tơm tít) sử dụng ni vỗ tơm sú bố mẹ trại sản xuất tôm sú giống khu vực Bạc Liêu Cà Mau - Tỉ lệ nhiễm WSSV loại thức ăn tươi sống Bạc Liêu 54 % - Tỉ lệ nhiễm WSSV loại thức ăn tươi sống Cà Mau 59 % - Phát thể vùi WSSV tế bào mô liên kết ốc mượn hồn bị WSSV xâm nhập 5.2 Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu phát WSSV mẫu thức ăn tươi sống dùng trại sản xuất giống - Nghiên cứu tối ưu qui trình cắt mơ nhiều đối tượng khác để nghiên cứu sâu ảnh hưởng WSSV mức độ tế bào 28 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học Thủy sản Nhà xuất Nông Nghiệp C M Escobedo-Bonilla, V Alday-Sanz, M Wille, P Sorgeloos, M B Pensaert and H J Nauwynck, 2008 A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus Journal of Fish Diseases 31: 1-18 CSIRO, 2008 Phương pháp PCR phát ADN giáp xác mười chân theo OIE, sử dụng mồi CSIRO Hội thảo PCR phát WSSV, Việt Nam, trang 18 Chu- Fang Lo, Jiann-Horng Leu, Ching-Hui Ho, Chau-Huei Chen, Shao-En Peng, You-Tzung Chen, Chih-Ming Chou, Pei Yan Yeh, Chang-Jen Huang, Hsin-Yiu Chou, Chung-Hsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996b Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSSV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction Diseases of Aquatic Organisms 25: 133-141 Chu-Fang Lo, Ching-Hui Ho, Shao-En Peng, Chau-Huei Chen, Hui-Chen Hsu, Ya-Lin Chiu, Chen-Fang Chang, Kuan-Fu Liu, Mao-Sen Su, ChungHsiung Wang, Guang-Hsiung Kou, 1996a White spot syndrome baculovirus (WSSV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Diseases of Aquatic Organisms 27: 215-225 Chưng Thị Nghiễm, 2009 Ứng dụng phương pháp PCR – Genotyping nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú Luận văn tốt nghiệp đại học Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007 Bài giảng Nguyên lý kỹ thuật chẩn đoán bệnh Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội, 2004 Giáo trình Bệnh học thủy sản Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang 29 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Franklin Pérez, Filip A.M Volckaert, Jorge Calderón, 2005 Pathogenicity of white spot syndrome virus on postlarvae and juveniles of Penaeus (Litopenaeus) vannamei Aquaculture,205,586-591 10 Http://www.vasep.com.vn/vasep/dailynews./87abdd0d40924a7547257142 0323ea3/ADD567A73BB5E6B947257508004CF07E?OpenDocument&Start =6.8 11 Http://www.khoahocthuysan.org/modules.php?name=News&op=viewst& si=123 Ngày truy cập 01/01/2009 12 Http://thuysan.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=455&articleId=2243 Ngày truy cập 01/01/2009 13 Http://www.khuyennongvn.gov.vn/g-ttdh/ca-mau-xuat-hien-tinh-trang-tomthe-chan-trang-nhiem-benh-va-chet/view Cập nhật ngày 01/01/2009 14 Http://www.nongthon.net/apm/modules.php?name=News&file=article&sid =3436 Ngày truy cập 02/01/2009 15 Http://nhanong.net/?nn=view&action=showid&id=1343 Ngày truy cập 02/ 01/2009 16 Jeroen Witteveldt, Carolina C Cifuentes, Just M Vlak, and Marieălle C W van Hulten Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination, 2004 Journal of Virology, p 2057–2061 Vol 78, No 17 Lê Xuân Sinh, 2003 A Bio-economic Model of a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Vietnam Luận án tiến sĩ Kinh tế nông nghiệp- Đại học Sydney, Australia 18 Lightner D.V, 1996.A handbook of shrimp patholgy and diagnostic procedures for disease of cultured penaeid shrimp The world aquaculture society 30 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 19 Lo C F, Ho C H, Chen C H and Chui Y L, 1997 Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSSV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproduction organs In Dis Aquat Org 30: 53-72 20 Lê Như Nguyệt, 2004 Ứng dụng so sánh phương pháp phát virus đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon) kỹ thuật PCR Luận văn tốt nghiệp đại học 21 Lý Ngọc Hà, 2008 Tìm hiểu biến đổi vùng lặp lại thuộc ORF94 ORF125 WSSV (White spot syndrome virus) tôm nuôi Bạc Liêu Luận văn tốt nghiệp đại học 22 Md Shahadat Hossain, Anirban Chakraborty, Biju Joseph, S.K Otta, Indrani Karunasagar and Iddya Karunasagar, 2001 Detection of new hosts for white spot syndrome virus of shrimp using nested polymerase chain reaction Aquaculture 198: 1-11 23 Nguyễn Văn Hảo,2003 Tình hình dịch bệnh tơm sú ni giới Việt Nam- Viện NXNTTS II 24 Nguyễn Minh Hậu, 2002 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm WSSV MBV tôm sú (P monodon) giống tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học 25 Nguyễn Trường Quang, 2004 Khảo sát tình hình bệnh đốm trắng tôm sú (P monodon) tỉnh Sóc Trăng Luận văn tốt nghiệp đại học 26 Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003 Ứng dụng kỹ thuật mô bệnh học chẩn đốn bệnh đốm trắng tơm sú (P monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học 27 S.K Otta, Indrani Karunasagar, Iddya Karunasagar, 2003 Detection of monodon baculovirus and whitespot syndrome virus in apparently healthy Penaeus monodon postlarvae from India by polymerase chain reaction Aquacuture 220: 59-67 31 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 28 Syed Musthaq, R Sudhakaran, V.P Ishaq Ahmed, G Blasubramanian, 2006 Variability in the tadem repetitive DNA sequences of white spot syndrome virus (WSSV) genome and suitability of VP28 gene to detect different isolates of WSSV from India, 256, 34-41 29 Trần Thị Tuyết Hoa, 2006 Bài giảng Bệnh virút động vật thuỷ sản Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ 30 Trần Thị Phương Trang, 2009 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát WSSV mẫu tôm sú (Penaeus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học 31 Van Hulten C W Marielle, Rob W Goldbach and Just M Vlak (2000) Three functionally diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by gene duplication Journal of General Virology, 81, 25252529 32 Wongteerasupaya C, Pungchai P, Withyachumnarnkul B and Boonsaeng V, 2003 High variation in repetitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand Dis Aquat org 54: 253-257 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC A BẢNG CÂU HỎI ĐIỀU TRA THÔNG TIN TRẠI GIỐNG Số tt……… Tên trại……………………………………………… Ngày thu……………………………………………… Số điện thoại…………… địa chỉ…… ……………… Nguồn gốc thức ăn…………………………………… Cách bảo quản………………………………………… Cách xử lý……………………………………… Cách sử dụng………………………………………… Lượng……… , hoàn toàn……… hay phối hợp……… Số lần cho ăn……………… 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC B Bảng B.1 Thành phần hóa chất sử dụng qui trình PCR Kimura et al (1996) tối ưu Trần Thị Phương Trang (2009) Bước 1/(2): tổng thể tích 20µl Hóa chất Nồng độ Thể tích mẫu (µl) PCR buffer 1X MgCl2 1,5/(1) mM 1,2/(0,8) dNTP (10M mol) 200 µM 0,4 P1/(3) (mồi xuôi) 20 pmol P2/(4) (mồi ngược) 20 pmol Taq DNA 1,5 U 0,3 Nước cất tiệt trùng 10,1/(10,5) ADN (Mẫu) 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC C CÁCH PHA CÁC LOẠI DUNG DỊCH Bảng C.1 Dung dịch cố định Davidson/AFA Thành phần Thể tích (ml) Ethyl alcohol 95 % 330 Formalin 220 Acid acetic 115 Nước cất 335 Bảng C.2 Dung dịch nhuộm Haematoxylin Thành phần Thể tích/Khối lượng Nước cất đun sôi 2000 ml Haematoxylin 2g Sodium iodate 0.4 g Potassium aluminium sunfate 180 g Acid citric 2g Chloral hydrate 100 g 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng C.3 Dung dịch Eosin/Phloxine Thành phần Thể tích (ml) Stock Eosin (1 % Eosin Y nước) 100 Stock Phloxine (1 % Phloxine B nước 10 Cồn 95 % 780 Acid glacial acetic Dung dịch Gelatin Gelatin % Potassium dichromate % Trộn theo tỉ lệ : Cho dung dịch vào chậu nước ấm để tạo thành dung dịch 0,002 % cho chất 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... Vì đề tài ? ?Phát white spot syndrome virus (WSSV) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ? ?? thực Mục tiêu đề tài Tìm hiểu khả nhiễm WSSV mẫu thức ăn tươi sống dùng trại sản xuất giống tôm sú khu vực... HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY... white spot syndrome virus (WSSV) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ? ?? thực nhằm phát thêm loài vật mẫn cảm đánh giá nhiễm WSSV lồi có khả đưa mầm bệnh vào hệ thống nuôi Việc phát WSSV mẫu thức