Phân tích hàm lượng tetracyline trong mẫu thức ăn chăn nuôi

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG TETRACYLINE TRONG MẪU THỨC ĂN CHĂN NI Giáo viên hƣớng dẫn: TS Trần Đình Thắng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Hải Lớp: 47K - Công nghệ thực phẩm Vinh, tháng 01/2011 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực phịng thí nghiệm chun đề Hố hữu - khoa Hóa học - Trường Đại học Vinh, Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Mơi trường, Trường Đại học Vinh, phịng thí nghiệm Sắc ký - Cơng ty sắc kí Hải Đăng Thành phố Hồ Chí Minh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Đình Thắng - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Chu Thị Thanh Lâm - Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm Môi trường - Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm, phân tích kết Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cơ, cán tổ hóa Thực Phẩm, Khoa Hóa, cán kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Sắc ký - Cơng ty sắc kí Hải Đăng - Thành phố Hồ Chí Minh, gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Vinh, tháng 01 năm 2011 Sinh viên NGUYỄN THỊ NGỌC HẢI MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Lý chọn đề tài Error! Bookmark not defined Nhiệm vụ nghiên cứu Error! Bookmark not defined Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng kháng sinh kỹ thuật phân tích TC giới 1.1.1 Trên giới Error! Bookmark not defined 1.1.2 Ở Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2 Giới thiệu kháng sinh Error! Bookmark not defined 1.2.1 Khái niệm 13 1.2.2 Phân loại 13 1.3 Giới thiệu thức ăn chăn nuôi 13 1.3.1 Khái niệm Error! Bookmark not defined 1.3.2 Phân loai 1.3.3 Tác dụng chủ yếu kháng sinh thức ăn chăn nuôi 13 1.4 Tetracyclin Error! Bookmark not defined 1.4.1 giới thiệu tetracyclin Error! Bookmark not defined 1.4.2 Tính chất vật lý tetracyclin Error! Bookmark not defined 1.4.3 Tính chất hóa học tetracyclin Error! Bookmark not defined 1.4.4 Tác dụng tetracyclin người vật nuôiError! Bookmark not defined 1.4.5 Tác hại tetracyclin thức ăn chăn nuôiError! Bookmark not defined 1.5 Giới thiệu phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao(HPLC)Error! Bookmark not defin 1.5.1 Cơ sở lý thuyết Error! Bookmark not defined 1.5.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột Error! Bookmark not defined 1.5.3 Phân loại sắc ký ứng dụng Error! Bookmark not defined 1.5.4 Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ Error! Bookmark not defined 1.5.5 Hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined 1.5.5.1 Bình đựng dung mơi Error! Bookmark not defined 1.5.5.2 Bộ khử khí Degasse Error! Bookmark not defined 1.5.5.3 Bơm (Pump) Error! Bookmark not defined 1.5.5.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) Error! Bookmark not defined 1.5.5.5 Cột sắc ký Error! Bookmark not defined 1.5.5.6 Đầu dò (Detector): A Error! Bookmark not defined 1.5.5.7 In kết Error! Bookmark not defined 1.5.6 Chọn điều kiện sắc ký Error! Bookmark not defined 1.5.6.1 Lựa chọn pha tĩnh Error! Bookmark not defined 1.5.6.2 Lựa chọn pha động Error! Bookmark not defined 1.5.7 Tiến hành sắc ký Error! Bookmark not defined 1.5.7.1 Chuẩn bị dụng cụ máy móc Error! Bookmark not defined 1.5.7.2 Chuẩn bị dung môi pha động Error! Bookmark not defined 1.5.7.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC Error! Bookmark not defined 1.5.7.4 Cách đo HPLC Error! Bookmark not defined Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Phương pháp lấy mẫu Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp phân tích tetracyclin Error! Bookmark not defined Chƣơng THỰC NGHIỆM 36 3.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 36 3.1 Thiết bị 36 3.1.2 Dụng cụ 36 3.1.3 Hóa chất 36 3.2 Kỹ thuật thực nghiệm 36 3.2.1 Chuẩn bị hóa chất phân tích 36 3.2.2 Pha dung dịch chuẩn tetracyclin Error! Bookmark not defined 3.2.3 Xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.3 Tiến hành phân tích máy sắc lý HPLC Error! Bookmark not defined 3.4 Khảo sát đánh giá phương pháp 41 3.4.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp 41 3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp 42 3.4.3 Khảo sát độ lặp 42 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn TC 43 4.2 Đánh giá phương pháp Error! Bookmark not defined 4.2.1 Xác định độ thu hồi phương pháp Error! Bookmark not defined 4.2.2 Xác định độ lặp lại cưa phương pháp Error! Bookmark not defined 4.4 Xác định độ thu hồi phương pháp Error! Bookmark not defined Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận Error! Bookmark not defined 5.2 Kiến nghị Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích TC Error! Bookmark not defined Bảng 4.1 Diện tích peak TC tương ứng với nồng độ chuẩnError! Bookmark not def Bảng 4.2 kết phân tích hàm lượng TC thứ ăn chăn nuôiError! Bookmark not defin Bảng 4.3 Kết xác định độ lặp phương phápError! Bookmark not defined Bảng 4.4 kết xác định hiệu suất thu hồi phương phápError! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích peak TC vào nồng độ 43 Hình 4.2 Sắc ký đồ chạy chuẩn Tetracyclin nồng độ 6.3 ppmError! Bookmark not defined Hình 4.3 ắc ký đồ chạy chuẩn Tetracyclin nồng độ 12.6 ppmError! Bookmark not defined Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho gà Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho gà Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho heo Error! Bookmark not defined DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Quy trình xử lý mẫu phân tích Error! Bookmark not defined Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Bộ kit thử CAP nhanh Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Máy LC/MS/MS tứ cực Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Phổ kế tứ cực Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Nguyên tắc làm việc máy khối phổError! Bookmark not defined Hình 3.1 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc tỷ lệ diện tích peak CAP/CAP-d5 vào nồng độ CAP 43 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho heo Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho tôm Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thức ăn cho tơm Error! Bookmark not defined DANH MỤC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT TC: Tetracycline OTC: Oxytetracycline CTC: Chlotetracycline CODEX: Uỷ ban tiêu chuẩn hoá thực phẩm quốc tế FDA: Food and Drug Administrantion (Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ) WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) MIC: Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MBC: Minimal Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao HSTH: Hiệu suất thu hồi HSTHTB: Hiệu suất thu hồi trung bình LOD: Giới hạn phát LOQ: Giới hạn định lượng / giới hạn xác định MeOH: Metanol ACN: Acetonnitril ATVSTP: An toàn vệ sinh thực phẩm S/N: Speak Height/Noise tt/tt: thể tích/thể tích kl/tt: khối lượng/thể tích TCA: Axit trichloracetic LỜI MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhờ tiến vượt bậc khoa học kỹ thuật mà ngành công nghiệp sản xuất sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi ngày phong phú không ngừng phát triển Các chủng loại thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm chế biến sẵn thị trường đa dạng Ngoài thành phần cung cấp lượng protein, lipid, glucid, người ta cịn bổ sung chất khống, vitamin, kháng sinh chất tăng trọng giúp cho vật vừa lớn nhanh vừa có khả chống đỡ bệnh tật Những lợi ích thức ăn đóng gói sẵn dễ nhận biết buông lỏng quản lý chất lượng loại thức ăn chăn nuôi chạy theo lợi nhuận dẫn tới sai sót khó lường sản xuất, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, ảnh hưởng lớn tới sức khỏe người tiêu dùng Vấn đề hoá chất tồn dư sản phẩm chăn nuôi đặc biệt dư lượng kháng sinh có sản phẩm thịt gia súc, gia cầm nguy tiềm ẩn đe doạ tới sức khoẻ người, khơng gây độc hại cấp tính, chết người mà tích lũy dần thể gây ảnh hưởng bất lợi cho sức khoẻ An toàn thực phẩm sản phẩm chăn nuôi không đơn sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà cịn chổ sản phẩm không chứa chất gây ngộ tích lũy hay mãn tính hay trường diễn (hormon, kháng sinh, độc chất) Do để có sản phẩm an tồn đến tay người tiêu dùng phải thực tốt từ khâu sản xuất đến khâu giết mổ, vận chuyển, phân phối, bảo quản chế biến Việc kiểm soát lượng tồn dư kháng sinh thức ăn chăn nuôi để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng cần thiết Có nhiều phương pháp xác định tetracycline thực phẩm nói chung thức ăn chăn ni nói riêng, song với nhiều cách xử lý điều kiện thiết bị cho đối tượng mẫu khác áp dụng phòng thử nghiệm Bộ Y tế Bộ NN&PTNT Việc áp dụng kỹ thuật chung thống hệ thống phòng thử nghiệm CL-VSATTP ngành Y tế để xác định tetracycline thịt lợn, gà cần thiết Vì vậy, triển khai nghiên cứu “Kỹ thuật xác định dư lượng Tetracyclin thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu sau: Chuẩn hóa phương pháp xác định dư lượng tetracylin (TC, CTC, OTC) đạt độ tin cậy, xác cao theo TCVN Phân tích dư lượng Tetracylin số đối tượng thức ăn chăn nuôi Việt Nam với mục đích cung cấp thơng tin thực trạng tồn dư tetracycline thức ăn chăn nuôi cho nhà quản lý người tiêu dùng Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn này, có nhiệm vụ: - Nghiên cứu tính chất hố học, vật lý phương pháp định tính, định lượng tetracycline - Tách, chiết tetracycline mẫu thức ăn chăn nuôi - Định lượng tetracycline phương pháp HPLC-UV Đối tƣợng nghiên cứu Dư lượng tetracycline thức ăn chăn nuôi thủy sản Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng kháng sinh kỹ thuật phân tích Tetracycline giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi: Vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh thức ăn chăn nuôi, điều trị bệnh gia súc, gia cầm phổ biến coi tiến khoa học công nghệ áp dụng nông nghiệp, để chữa bệnh làm vật nuôi tăng trưởng nhanh, đáp ứng nhu cầu thịt ngày tăng cho gia tăng dân số giới Tuy nhiên việc tùy tiện sử dụng thuốc kháng sinh dẫn đến hậu lượng kháng sinh tồn dư thực phẩm gia súc, gia cầm vượt ngưỡng tối đa cho phép, người sử dụng loại thực phẩm thời gian dài bị biến đổi hệ vi khuẩn thể bị kháng thuốc gây nguy hại cho sức khỏe cộng đồng Ở Đan Mạch Thụy Điển chứng minh việc cấm sử dụng kháng sinh làm tăng thời gian nuôi vật nuôi trước giết mổ, giảm khoảng 20%, tăng lượng thức ăn tiêu thụ khoảng 2kg/con, tăng tỷ lệ chết từ 7-10% giảm 10% lợi nhuận nhà chăn nuôi.[22] Do vậy, chưa dám phủ nhận hiệu việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi Song, nguyên nhân gây sức đề kháng ngày mạnh vi khuẩn gây bệnh người lại việc sử dụng kháng sinh cách khơng khoa học việc phịng trị bệnh cho gia súc Tồn dư kháng sinh thực phẩm chăn nuôi dẫn đến làm tăng nguy nhiễm bệnh người thường xuyên sử dụng sản phẩm Xa nữa, tạo kháng thuốc dòng vi khuẩn gây bệnh động vật chúng có khả lan truyền sang người Kết người bị nhiễm bệnh làm cho khả chữa trị khó, lâu dài phức tạp Kỹ thuật phân tích tetracycline giới: [23],[20] Q trình hội nhập hóa thương mại hàng rào kỹ thuật châu lục, khu vực, nước xuất nhập thịt gia súc, gia cầm quy định giới 20 mL dung dịch [MeOH : axit citric / 30:70 vào phần cặn ống ly tâm đánh siêu âm 15 phút Sau đó, ly tâm 10 phút tốc độ 5500 vòng/phút Sau ly tâm xong dùng pipet paster hút lấy dịch vào bình cầu Mục đích việc nghiền siêu âm lần thứ nhằm lấy hết chất cần phân tích đồng thời làm tăng hiệu suất chiết Cơ dung dịch bình cầu máy cất quay chân không nhiệt độ 60oC cạn Sau rửa bình cầu mL dung dịch [MeOH : axit citric / 30:70 Ly tâm lần xong dùng pipet paster hút lấy dịch cho vào ống ly tâm Thêm 4ml dung dịch NH4OH – ACN 5%, ý vừa cho vừa lắc nhẹ quan sát phút Cô can dung dịch thu dịng khí nitơ Hịa tan cặn ống Hatch ml MEOH, vortex 20 giây Lọc dung dịch thu qua màng lọc Màng lọc dung môi 13mm - 0,45μm Thu dịch lọc vào vial dùng cho HPLC, tiêm vào máy Giai đoạn làm cột chiết pha rắn (SPE): Chuẩn bị SPE lên hút chân không Hoạt hóa SPE với 20ml Methanol 20ml nước cất Bỏ dịch chảy từ SPE Chuyển toàn dịch chiết vào SPE, rửa bình lần với mL dung dịch [MeOH : axit citric / 30:70 đưa tiếp vào SPE; tiếp tục lại rửa bình với 20ml nước cất cho vào SPE Sau hút chân không liên tục qua SPE khô cột Đưa ống ly tâm 50ml vào hứng dịch từ ống SPE Tiếp rửa giải Tetracyclin từ SPE 6ml Methanol oxalic axit, hút đến hết dịch chảy khỏi SPE hút chân không thêm 10 giây Định mức đến vạch nước cất Lọc dịch cuối trước bơm vào máy HPLC filer 0,45μm Trước bơm vào máy HPLC mẫu phải cho vào từ ống ly tâm vào ống nghiệm nhỏ đem ly tâm từ 3-5 phút để thu dịch tinh khiết nhất, đảm bảo điều kiện chạy máy 40 3.2.4 Tiến hành máy sắc ký HPLC Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18 (250x4,6 mm; m) cột bảo vệ - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Pha động: acetonitrile : H3PO4 = 20:80 - Nhiệt độ lò cột: nhiệt độ phịng - Bước sóng: 350 nm (Ghi chú: tốc độ dịng tỉ lệ pha động thay đổi tuỳ cột sử dụng) Điều kiện Detectơ: Detectơ DAD bước sóng 450 nm, quét phổ UV-Vis từ 350 ÷ 600 nm Loại detectơ cho phép ghi phổ hấp thụ UV-VIS Tetracylin tách sắc ký đồ Với trợ giúp máy tính, liệu phổ lưu trữ sau đem so sánh với phổ hấp thụ chất chuẩn, nhờ cho phép khẳng định phần cấu trúc lycopen đánh giá độ pic 3.4 Khảo sát đánh giá phƣơng pháp 3.4.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp Giới hạn phát định nghĩa nồng độ nhỏ chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp lần tín hiệu đường Đây thông số đặc trưng cho độ nhạy phương pháp LOD = tín hiệu chiều cao pic/nhiễu đường ≥ Cách xác định: - Thêm vào mẫu hàm lượng chất phân tích để có nồng độ Co, cụ thể thêm 0.5 ml TC chuẩn có nồng độ 0.1ppm, 0.5ppm, 1ppm Tách chiết, làm định mức với thể tích pha động phân tích mẫu thật - Xác đinh tỷ lệ S/N: Phân tích mẫu trắng (là mẫu xác định khơng có TC) mẫu khơng thêm chuẩn - Lấy sắc ký đồ đo S/N 41 - LOD tính theo cơng thức: LOD =  Co T Với T = S/N Giới hạn định lượng (LOQ) (limit of quantitation) nồng độ nhỏ đo phương pháp, nồng độ tối thiểu chất mẫu xác định mà thiết bị đo với RSD% quy định nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường (S/N = 10) LOQ tính theo cơng thức: LOQ = 10LOD 3.4.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp tiến hành phân tích mẫu theo quy trình với phương pháp thêm chuẩn Mẫu 1: mẫu không thêm chuẩn (mẫu khơng phát có tồn dư TC) Mẫu 2, 3, 4: mẫu có thêm chuẩn 3.4.3 Khảo sát độ lặp - Độ lặp lại dùng để đánh giá định lượng độ phân tán kết Đại lượng đặc trưng cho độ gần giá trị trung bình hai hay nhiều phép đo nhận điều kiện giống - Đánh giá độ lặp dựa độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) 42 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn TC Dãy chuẩn kháng sinh khảo sát có nồng độ sau: 0,05;0,1; 0,25; 0,5; 1,0 (ppm) Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic Nồng độ Diện tích peak 0 0.1 8706 0.25 21025 0.5 42543 87658 Bảng 4.1: Diện tích peak TC tương ứng với nồng độ chuẩn Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng TC sau: 100000 y = 87576x - 410.94 R2 = 0.9997 80000 60000 Series1 40000 Linear (Series1) 20000 -20000 0.5 1.5 Hình 4.1 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích peak TC vào nồng độ TC 43 Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = 87576x – 410.94 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 = 0,9997 Từ giá trị diện tích peak đo ta tính hàm lượng x (mg/L) - Sau ta tính hàm lượng TC (mg/ml) có mẫu tính theo cơng thức: C Trong đó: Co  V m C : nồng độ TC có mẫu tính mg/Kg Co : nồng độ TC dịch chiết tính từ đường chuẩn, tính theo mg/L m : khối lượng mẫu lấy để phân tích (g) Mẫu Co (mg/l) 10120785 10120786 10120787 Diện tích M (g) C (mg/kg) 5.0192 KPH 3.7644 327374 5.0088 1.50 7.5397 642224 5.0098 3.01 peak Bảng 4.2: kết phân tích hàm lượng TC thứ ăn chăn nuôi Sau chạy dãy chuẩn từ kết thực nghiệm mẫu trắng có chiều cao peak trung bình mẫu trắng ? Ta xem ? nhiễu đường (N) Để xác định LOD LOQ phương pháp, tiến hành phân tích lần lặp lại mẫu thức ăn chăn nuôi thêm chuẩn 0.4 ppm; 0.6 ppm; 0.8 ppm Sau kết thu từ phương pháp thêm chuẩn: Xác định LOD Từ công thức: LOD =  Co T với T = S/N Do ta tính tốn giới hạn định lượng phương pháp 0.1ppm Xác định LOQ 44 Từ công thức: LOQ = 10LOD Như giới hạn xác định phương pháp LOQ = 0.333ppm 4.2 đánh giá phƣơng pháp 4.2.1 Xác định độ lặp lại phương pháp Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV% (RSD) Thực phân tích g mẫu tiến hành phân tích lặp lại lần điều kiện Kết phân tích lần lặp lại độ lặp lại phương pháp nêu bảng 4.3 Độ lặp lại phương pháp đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Dựa vào nồng độ tương ứng tính kết trung bình tính độ lệch chuẩn hệ số biến thiên theo công thức đây: TT Khối lƣợng (g) Hàm lƣợng TC (ppm) 5.006 1.50 5.0038 1.52 5.0042 1.46 Bảng 4.3: Kết xác định độ lặp phương pháp Giá trị trung bình hàm lượng TC là: Xtb = n  x = 1.493 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x n 1 i  xtb ) n 1 45 = 0.0306 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 0.0306 S  100 =  100 = 2.0496 % xtb 1.493 Trong đó: Xi nồng độ tetracycline lần chạy thứ i Xtb nồng độ trung bình n lần chạy n số lần chạy lặp lại Nhận xét: Kết tính tốn cho thấy, phương pháp có lặp lại cao cho độ tốt đáp ứng yêu cầu định lượng 4.2.2 Xác định độ thu hồi phương pháp Hiệu suất thu hồi xác định theo công thức sau: Cmẫu - Cblank  m  100% H= Cspike Trong đó: Cmẫu: Hàm lượng TC có mẫu có thêm chuẩn (mg/kg) Cblank: Hàm lượng TC có mẫu khơng thêm chuẩn(mg /kg) Cspike: Hàm lượng chuẩn TC cho vào mẫu (µg) m: Lượng cân mẫu thử (g) Độ thu hồi phương pháp xác định cách tiến hành phân tích lần lặp lại mẫu tiến hành tách chiết theo quy trình xử lý mẫu theo quy trình với nồng độ thêm chuẩn 1.4 ppm: - Mẫu 1: Mẫu 10120786 tách chiết theo quy trình chuẩn bị mẫu khơng thêm chuẩn - Mẫu 2: Thêm 1.4 ml chuẩn TC 0.1 µg/ml - Mẫu 3: Thêm 1.4 ml chuẩn TC 0.1 µg/ml - Mẫu 4: Thêm 1.4 ml chuẩn TC 0.1µg/ml Qua thí nghiệm ta thu kết bảng sau : Diện mẫu m Cmẫu tích peak 46 Cspike H% 5.0013 1.50 327374 5.0024 1.5276 328963 0.1 98.6 5.0089 1.5278 329875 0.1 99.5 5.0032 1.5279 331021 0.1 99.7 Bảng 4.4 kết xác định hiệu suất thu hồi phương pháp Từ bảng kết ta có giá trị trung bình H% là: xtb = n  x = 99.2 % n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x n 1 i  xtb ) n 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = = 0.59 0.59  100 S  100 = = 0.596% xtb 99.2 Qua kết phân tích tính tốn cho thấy, hiệu suất thu hồi cao, tỷ lệ % trung bình tìm thấy chất phân tích TC 99.2%, đáp ứng yêu cầu phân tích Hình 4.2 : Sắc đồ dung dịch chuẩn Tetracyclin nồng độ 6.3 ppm 47 Hình 4.2 : Sắc đồ dung dịch chuẩn Tetracyclin nồng độ 12.6 ppm Hình 4.3: Sắc đồ mẫu thức ăn cho gà 48 Hình 4.4: Sắc đồ mẫu thức ăn cho gà Hình 4.5: Sắc đồ mẫu thức ăn cho heo 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết phân tích cho thấy mẫu thức ăn chăn ni phát thấy mẫu có dư lượng TC: mẫu 10120786: 1.50 mg/kg Mẫu 10120787 3.01 mg/kg Giới hạn phát phương pháp LOD = 0.1ppm Giới hạn định lượng phương pháp LOQ = 0.3333ppm Độ lặp lại TC mẫu thức ăn chăn nuôi với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 2.0496 % Độ thu hồi trung bình TC mẫu thức ăn chăn nuôi 99.2% 5.2 Kiến nghị Vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm phổ biến coi tiến khoa học công nghệ áp dụng nông nghiệp, để chữa bệnh làm vật nuôi tăng trưởng nhanh, đáp ứng nhu cầu thịt ngày tăng cho gia tăng dân số giới Tuy nhiên việc tùy tiện sử dụng thuốc kháng sinh dẫn đến hậu lượng kháng sinh tồn dư thực phẩm gia súc, gia cầm vượt ngưỡng tối đa cho phép, người sử dụng loại thực phẩm thời gian dài bị biến đổi hệ vi khuẩn thể bị kháng thuốc gây nguy hại cho sức khỏe cộng đồng Cần phải tăng cường kiểm sốt chất lượng vệ sinh an tồn thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm lưu hành thị trường sở sản xuất, cung cấp thức ăn chăn ni gia súc gia cầm Cần có nghiên cứu, khảo sát diện rộng lượng tồn dư tetracyline sản phẩm thực phẩm gia súc, gia cầm kể thức ăn qua trình chế biến phương pháp khác để có lời khuyên thiết thực cho cộng đồng bảo vệ người tiêu dùng Để thay kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi người ta áp dụng nhiều biện pháp: Nên sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic vitamin) để thay kháng sinh sản phẩm thịt gia súc, gia cầm Một số kết nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chế phẩm không làm ảnh hưởng đáng kể đến tăng trọng, tiêu tốn thức 50 ăn/kg thịt, cịn có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn bệnh ống tiêu hóa vừa tăng cường hệ thống miễn dịch ruột Ngoài ra, giá thành sản phẩm thấp so với việc dùng kháng sinh mà lại cịn tránh tồn dư kháng sinh thịt Nên sử dụng enzyme vào thức ăn đường công nghệ vi sinh (cellulase, xylanase, mannanase…) với mục đích phân giải polysaccharid cấu tạo vách tế bào thực vật, tạo điều kiện cho enzyme nội sinh (protease, amylase, lipase tiết từ ống tiêu hóa) tiếp cận với chất hữu bên tế bào chất làm tăng tỷ lệ tiêu hóa hấp thu thức ăn, từ giúp thể vật có thêm chất dinh dưỡng để tăng suất sản phẩm tăng cường sức khỏe để chống bệnh Nên sử dụng axit hữu vào thức ăn axit lactic, formic… để hạ thấp pH dịch dày dịch ruột, không ăn mịn niêm mạc ống tiêu hóa (có loại axit hữu cịn bảo vệ kích thích phát triển niêm mạc ruột, axit butyric) 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Viện chăn nuôi quốc gia, 2001 “Thành phần giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc, gia cầm Việt Nam” NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Quốc Việt Sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm Viện chăn ni - Bộ Nơng nghiệp phát triển nơng thơn Hồng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc Cơ sở hóa học phân tích Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Lê Đức Ngoan người khác(2004) Giáo trình thức ăn gia súc Trường Đại học Nông lâm Huế Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm, Đào Thị Vui, Lê Phan Tuấn Dược lý học, tập Trường Đại học Dược Hà Nội Trần Đức Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Nguyễn Văn Thục Hóa dược, tập Trường Đại học Dược Hà Nội Phan Đình Châu, Nguyễn Việt Hương, Từ Minh Koóng, Đỗ Hữu Nghị Kĩ thuật sản xuất dược phẩm, tập Trường Đại học Dược Hà Nội Viện chăn nuôi quốc gia, 2001 “Thành phần giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc, gia cầm Việt Nam” NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lã Văn Kính cộng (2007) “Nghiên cứu sản xuất thịt lợn an toàn chất lượng cao” thuộc chương trình “Nghiên cứu ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để tổ chức sản xuất quản lý nơng sản thực phẩm an tồn chất lượng cao” Viện khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam 10 Thái Duy Thìn, Võ Thị Nhị Hà, Nguyễn Hải Nam, Đào Thị Kim Oanh, Nguyễn Tường Vy Thực tập hóa dược Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Đào Huyên Vấn đề sử dụng kháng sinh chăn ni, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Chăn ni số 6, (2002), 23-27 12 Dương Thanh Liêm Hậu việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi, Đặc san khoa học kỹ thuật Thức ăn chăn nuôi số 2(3), 2004, 1-5 52 13 Lã Văn Kính An toàn thức ăn gia súc để an toàn thực phẩm, Đặc san khoa học kỹ thuật Thức ăn chăn nuôi số 1(6), 2005, 6-9 14 Vũ Duy Giảng Các biện pháp thay kháng sinh thức ăn chăn nuôi Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 15 Phạm Luân (1999) Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao Đại học quốc gia Hà Nội 16 Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985) Các phương pháp sắc ký Nhà xuất khoa học kỹ thuật 17 Nguyễn Quốc Ân Sử dụng kháng sinh chăn nuôi thú y Việt Nam Cục Thú y Tiếng Anh 18 Katia De Wasch, Lieve Okerman, Siska Croubels, Hubert De Brabander, Jan Van Hoof and Patrick De Backer (1998) Detection of residues of tetracycline antibiotics in pork and chicken meat: correlation between results of screening and confirmatory tests The Analyst, 123, 2737 – 2741 19 Li-Feng Wang, Jing-Dong Peng, Li-Min Liu (2008) A reversed-phase high performance liquid chromatography coupled with resonance Rayleigh scattering detection for the determination of four tetracycline antibiotics The analytica chimica acta, 630, 101–106 20 J Zhou et al, Jinhui Zhou, Xiaofeng Xue, Yi Li, Jinzhen Zhang, Fang Chen, Liming Wu, Lanzhen Chen, Jing Zhao (2009) Multiresidue determination of tetracycline antibiotics in propolis by using HPLC-UV detection with ultrasonicassisted extraction and two-step solid phase extraction the Food Chemistry, 115, 1074–1080 21 Seamus O’ Connor, Diana S Aga (2007) Analysis of tetracycline antibiotics in soil: Advances in extraction, clean-up, and quantification the Trends in Analytical Chemistr, Vol 26, No 6, 456 – 465 22 C.G.Smyrniotakis, Helen A Archontaki, (2007) “ C18 columns for the simultaneous determination of oxytetracycline and its related subsatances by 53 reversed-phase high performance liquid chromatography and UV detection” the Journal of Pharmaceutical and biomedial analysis, 43, 506 – 514 23 Hamide SENYUVA, Tuncel OZDEN, Deniz Yurtsever SARICA (2000) “ HighPerformance Liquid Chromatographic Determination of Oxytetracycline Residue in Cured Meat Products” The Turk J Chem, 24 395 - 400 Các trang website 24 http://www.cvg.ca 25 http://www.sciencedirect.com 26 http://www.agilent.com/chem 27 http://tusach.thuvienkhoahoc.com 28 http://www.hoahocvietnam.com 29 http://www.hoahoc.org 30 http://www.chemvn.net 31 http://www.webchannuoi.com/showthread 32 http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn 33 http://www.vcn.vnn.vn 34 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung 35.http://www.minhdung.com.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=8 07:khang-sinh-trong-thc-n-chn-nuoi&catid=50:tt-thu-y-thuy-san&Itemid=60 Ngày truy cập 21/10/2010 54 ... từ thức ăn gia súc Chuẩn bị mẫu thức ăn chăn nuôi nghiền mịn, đồng cân xác cân phân tích sau cho vào ống ly tâm dung tích 50ml: Cân mẫu: Mẫu thức ăn cho gà ký hiệu 10120785 : 5.006 g Mẫu thức ăn. .. Sắc đồ mẫu thức ăn cho gà 48 Hình 4.4: Sắc đồ mẫu thức ăn cho gà Hình 4.5: Sắc đồ mẫu thức ăn cho heo 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết phân tích cho thấy mẫu thức ăn chăn nuôi phát... 46,7% với gà thịt) 60,3% mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt, 70,3% mẫu thức ăn chăn nuôi gà thịt phát có số loại kháng sinh thuộc nhóm Tetracycline.[2] Kết phân tích năm 2007 mẫu thủy sản ni lấy ao