KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN đoán VIRUS GUMBORO

KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: DH06SH SEMINAR KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trần Lâm Thanh MSSV: 06126131 Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi gà nghề sản xuất truyền thống lâu đời chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn ni lợn) tồn ngành chăn ni Việt Nam Hằng năm, cung cấp khoảng 350-450 ngàn thịt 2,5-3,5 tỷ trứng Tuy nhiên, chăn nuôi gà nuớc ta cịn tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, lạc hậu, suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hố cịn nhỏ bé Bình qn sản lượng thịt xẻ, trứng/nguời đạt 4,5 5,4kg/nguời/năm 35 trứng/nguời/năm Trong vài thập kỷ qua, công tác chọn giống cải thiện cách đáng kể thành tích sản xuất, chăn ni gà như: tăng trưởng nhanh hơn, hiệu sử dụng thức ăn cao hơn, khả sản xuất thịt tốt hơn, tỷ lệ thịt ngực cao tăng nhanh suất sản xuất không với việc tăng khả miễn dịch, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh rối loạn chuyển hóa nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết tăng cao Trong đó, kể đến Infectious bursal disease virus (IBDV), lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả miễn dịch gà Nhiều báo cáo khoa học cho biết: gà giai đọan từ 1-12 tuần tuổi, rõ giai đọan 3-6 tuần tuổi có khả mắc bệnh Gà nhỏ tuần tuổi mắc bệnh không biểu triệu chứng làm gà suy giảm miễn dịch Tỷ lệ mắc bệnh 100%, tỷ lệ chết từ 10-50% cao kết hợp với bệnh khác Do tính chất gây bệnh đặc trưng virus lây lan nhanh khơng thể kiểm sốt hóa chất hay phương thuốc mà khắc phục biện pháp phịng trừ Vì thiệt hại IBDV gây đáng kể chăn nuôi gà nước lớn giới nói chung Việt Nam nói riêng Cùng với phát triền vượt bậc công nghệ sinh học, kỹ thuật phân tử chẩn đóan bệnh ngày giúp ta chẩn đóan nhanh, sớm cách xác nhiều bệnh virus Khởi phát từ vấn đề nêu trên, giới hạn seminar em xin thực nội dung “ Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus Gumboro” TP HCM, Tháng 10/2009 Nguyễn Trần Lâm Thanh NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương TỔNG QUAN II.1 Giới thiệu tổng quát bệnh Gumboro: II.1.1 Bệnh Gumboro gì? Infectious bursal disease (IBD) bệnh dễ lây lan đàn gà loại virus gây bệnh truyền nhiễm Infectious bursal disease virus(IBDV) Đặc trưng bệnh làm suy giảm hệ thống miễn dịch gà tỷ lệ tử vong thường từ 3-6 tuần tuổi Bệnh Cosgrove phát lần vào năm 1962 Gumboro, vùng Delaware Hoa Kỳ Đó trung tâm kinh tế quan trọng ngành cơng nghiệp gia cầm tồn giới Đến năm 1970 Hitchner đề nghị lấy tên thức cho bệnh Infectious bursal disease (IBD) hay gọi bệnh Gumboro virus gây bệnh Infectious bursal disease virus (IBDV) Trong năm gần đây, nhiều chủng độc IBDV (vvIBDV) phát hiện, chúng nguyên nhân gây chết đồng loạt gà, bệnh xuất châu Âu, châu Mỹ Latinh, Đông Nam Á, Châu Phi Trung Đông II.1.2 Hệ thống miễn dịch gia cầm: Đây hệ thống phức tạp, hoàn thiện chức cấu trúc, phân bố khắp thể, bao gồm quan, yếu tố tế bào yếu tố dịch thể Cũng động vật có vú, lực miễn dịch gia cầm phát triển thông qua hệ thống lympho Cơ quan hệ miễn dịch chia thành quan lympho sơ cấp thứ cấp + Túi Fabricius (viết tắt túi F) tuyến ức quan lympho sơ cấp tiền lympho bào phát triển thành lympho bào miễn dịch + Những tổ chức lympho thứ cấp lách, tủy xương, tuyến Harderian, tuyến thông (pineal gland) mô lympho gắn với bề mặt niêm mạc niêm mạc khí quản, niêm mạc ruột cụm biệt hóa tế bào lympho thuộc quan khác Các tổ chức lympho đặt vị trí quan trọng để kháng nguyên vi khuẩn bệnh vào thể qua da hay qua bề mặt niêm mạc bị tóm gọn bị tiêu diệt NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Sự phát triển hệ thống miễn dịch xảy chủ yếu q trình phát triển phơi Các quan miễn dịch globulin miễn dịch thành thục quan miễn dịch bị chi phối nhiều yếu tố, yếu tố di truyền, thức ăn yếu tố quan trọng II.1.3 Vai trò túi Fabricius hệ thống miễn dịch gia cầm: II.1.3.1 Cấu tạo: Túi Fabricius tổ chức lympho dạng túi, nằm liền sát lổ huyệt gia cầm Túi cấu tạo từ biểu mơ có nếp gấp, bao gồm khoảng 12.000 nang lympho Trọng lượng túi thay đổi tùy theo tuổi Về mặt cấu tạo vi thể, nang lympho gồm phần riêng biệt nhau: phần vỏ phần tủy + Phần vỏ: chứa số lượng lớn lymphocytes, lymphoblaste thời kỳ gián phân, đại thực bào, hệ thống mạch máu bao gồm động - tĩnh mạch nhỏ, mao mạch + Phần tủy: chứa lymphocyte, đại thực bào, bạch cầu tế bào mầm II.1.3.2 Sự phát triển: Sau giai đoạn phát triển phôi, gà nở, túi Fabricius tiếp tục phát triển tận tuần tuổi thứ hay tuần tuổi thứ 12 tùy theo giống, giới tính điều kiện chăn ni, sau túi bắt đầu thối hóa Quan sát vi thể thối hóa túi Fabricius từ tuần tuổi thứ 24, người ta ghi nhận số dấu hiệu đặc trưng sau: + Lớp biểu mô teo lại tróc + Các nếp gấp dần + Phần tủy thối hóa xuất nang + Sự phát triển mô liên kết khung + Sự xâm nhập heterophile, macrophage vùng hoại tử Sự tiến hóa túi Fabricius kiểm soát hormone quan khác với hiệu ứng kích thích kềm hãm Bệnh tật số yếu tố khác từ bên ngồi ảnh hưởng đến tiến hóa túi II.1.3.3 Vai trò túi Fabricius miễn nhiễm: Từ tế bào nguồn có bên túi Fabricius, giai đọan phát triển phôi (khoảng từ ngày thứ đến 15) tế bào tự dị biệt tác động trình tiếp xúc với tế bào lưới biểu mô diện chất chiết xuất polypeptide túi Fabricius, hình thành nên NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐỐN VIRUS GUMBORO tế bào có mang kháng thể ( IgM - ngày thứ 12, IgG - ngày thứ 14, IgA ngày thứ 16) Những tế bào miễn dịch di chuyển khỏi túi Fabricius suốt thời kỳ phát triển sau phôi cuối thời gian để đến quan ngoại vi ( lách, ruột….) II.1.4 Infectious bursal disease virus (IBDV) IBDV có cấu trúc mạch đơi RNA dạng cuộn trịn, thuộc lồi Avibirnavirus họ Birnaviridae IBDV có dạng khối, nhiều góc cạnh, kích thước 55-65nm, virus dạng trần, khơng có vỏ bọc ngồi IBDV có dạng serotypes khác biệt , có serotype nguyên nhân gây bệnh cho gia cầm Có lọai kháng nguyên phụ IBDV serotype phát phản ứng trung hòa ống nghiệm Những virus thuộc loại kháng nguyên phụ thường gọi biến thể, chúng nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao gà khỏang 60-100% Với phát triển vượt bậc sinh học phân tử phản ứng phiên mã ngược chuỗi polypedtide (RT-PCR) kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình đa hình (RFLP), trở thành khả để phát vvIBDV, để phân biệt chủng IBDV, sử dụng thông tin nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus Bộ gen IBDV chứa mạch: mạch A mạch B, bao bọc vỏ capsid Lớp capsid hợp thành 32 capsomer Mỗi capsomer tạo loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 VP5 (Viral Protein-VP) + Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 VP1 protein có hoạt tính enzym RNA- polymerase Enzym xúc tác q trình tổng họp RNA virus + Mạch A lớn (3.2kb) bao gồm cấu trúc gen tổng hợp protein Cấu trúc thứ khung đọc mở đa gen ( poly-cistronic open reading frame) mã hóa cho “tiền protein” có phân tử lượng 110 kDa mà trình phân cắt thành protein cấu trúc có tên gọi VP2, VP3, VP4 Ngồi ra, mạch A cịn mã hóa cho protein khác có tên VP5 Đây protein có trọng lượng phân tử bé (17kDa) phát gần đây, có chức q trình điều hịa chép tổng hợp protein Bằng phương pháp miễn dịch học phương pháp gây bệnh động vật thí nghiệm, VP2 chứng minh protein kháng ngun bảo vệ vật chủ kích thích tạo kháng thể, đồng thời yếu tố độc lực IBDV Sự biến đổi acid amin VP2 nguyên tắc dẫn đến thay đổi định tính kháng nguyên khả gây NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO bệnh virus Tuy nhiên có vùng hẹp cấu trúc VP2 gọi ”vùng siêu biến đổi”, chịu trách nhiệm đặc biệt tính kháng nguyên kích thích thể tạo kháng thể tham gia phản ứng trung hòa virus Sự khác trình tự nu gen quy định tổng hợp VP2, hay cụ thể khác vùng siêu biến đổi nên vùng chọn làm đích để so sánh, chẩn đốn, phân tích đặc tính kháng nguyên gây miễn dịch chủng IBDV VP3 kích thích thể sản sinh kháng thể kết tủa mà IBDV nhóm thuộc serotypes kích thích sản sinh Vì vậy, VP3 dễ cho phản ứng kết tủa chéo, có tác dụng nhận biết IBDV đơn phân biệt sơ với virus khác Do VP3 sử dụng làm kháng nguyên kết tủa để phân biệt IBDV với virus khác Trong VP2 dùng để phân biệt chủng tính độc lực chủng IBDV VP4 có chức protease cắt rời tiền protein tạo nên protein độc lập VP5 khơng có vai trị điều hịa tổng hợp ARN mà cịn có vai trị tiến triển gây bệnh số thực nghiệm chứng minh: virus thiếu thành phần hay khiếm khuyết thành phần VP5 có khả phần hay hồn tồn tính gây bệnh IBDV có sức đề kháng hoàn toàn với Ether, Chloroforn, đề kháng với Formalin Chloramin Virus có sức chịu nhiệt tốt, sống sót sau xử lý nhiệt nhiệt độ 56OC 5h nhiệt độ 37 OC hàng ngày, khử trùng nhiệt tốt virus cách đun sơi Các loại hóa chất thuốc sát trùng phải nồng độ cao (1% trở lên) có khả tác dụng Chỉ có hóa chất chứa ion Clo Iod tự hợp chất Chloramin, Iodine Formalin nồng độ cao (1% trở lên) tiêu diệt chúng II.1.5 Những đặc điểm bệnh Gumboro: II.1.5.1 Nguồn bệnh: Theo Benton (1967) virus tồn từ 52-122 ngày ô chuồng trước xảy dịch bệnh Trong phân, nước, chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, chất thải, chất bẩn IBDV giữ nguyên đặc tính gây nhiễm gây bệnh II.1.5.2 Phương thức truyền lây: Bệnh lây gián tiếp qua trứng, qua khơng khí, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi nhiễm mầm bệnh NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Bệnh lây lan trực tiếp gà mang mầm bệnh gà khỏe tiếp xúc II.1.5.3 Cơ chế lây bệnh IBDV: Virus công vào tế bào lympho đặc biệt tế bào lympho B Đối với gà khoảng 2-8 tuần tuổi có hoạt động túi Fabricius cao có khả mắc bệnh cao Đối với gà tám tuần tuổi có khả kháng lại khơng có biểu lâm sàng, trừ bị nhiễm chủng độc lực cao Sau xâm nhiễm, virus phá hủy nang lympho túi Fabricius tế bào lympho B thứ cấp GALT, CALT, BALT, tuyến Harderian,….bệnh cấp tính dẫn đến tử vong tượng “necrotizing”của virus mô chủ II.1.5.4 Triệu chứng: Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày Sau IBDV xâm nhập vào túi Fabracius gà có biểu hiện: + Đàn gà uống nhiều nước, sào xạc có tiếng động lạ hay có người bước vào chuồng + Cơ vùng hậu mơn co bóp nhanh, mạnh, gà có phản xạ muốn ngồi khơng thực được, gà có biểu giật lùi + Sau gà sốt cao, uống nhiều nước dẫn đến rối loạn tiêu hoá, gà tiêu chảy mạnh, viêm hoại tử ruột + Phân gà trắng lỗng, lúc đầu có màu trắng ngà sau chuyển sang vàng trắng, trắng nhớt lẫn máu + Bệnh tiến triển nhanh sau 6-8 kể từ ốm đầu tiên, đàn gà thay đổi mặt thể trạng, chúng trở nên xơ xác, xù lông, run rẩy, yếu dần chết Gà bắt đầu chết từ ngày thứ sau phát bệnh, tỉ lệ chết tăng nhanh, sau - ngày ngưng, cịn sống sót khỏi bệnh Tỉ lệ chết thường thấp, điều kiện chăn ni tỉ lệ chết lên đến 30% cao Hình: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lơng NGUYỄN TRẦN LÂM THANH Hình: Gà tiêu chảy phân loãng trắng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.1.5.5 Bệnh tích: Xác chết khơ, lơng xơ xác, chân khô Túi Fabricius giai đầu sưng to, xung quanh túi có thủy thũng mạnh đặc biệt vùng cuống túi tiếp giáp với trực tràng, túi chuyển từ màu vàng sáng sang trắng đục, túi dễ cấu, dễ bục, nếp múi khế sưng to không rõ nét, nhiều trường hợp túi xuất huyết dạng lấm đinh ghim kéo dài thành vật niêm mạc túi Điển hình xung xuất huyết hệ cơ, xung huyết lột da, khô nhanh có màu thẫm Nếu xuất huyết, lột da quan sát thấy có dạng vệt xuất huyết, có chạy dài thành tia xuyên suốt chiều dài sợi Ngoài lách sưng nhẹ, thận sưng căng bệnh tích thận khơng coi điển hình Một điều cần ý cá biệt có trường hợp thấy xuất huyết dày tuyến nên dễ nhầm với bệnh gà rù Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 1/3 trọng lượng ban đầu Hình: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm Hình: Cơ đùi xuất huyết thành vệt NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Hình: Xuất huyết niêm mạc dày tuyến (chổ tiếp giáp mề tiền mề) II.1.5.6 Phòng bệnh: Chủ yếu dùng vaccin phòng bệnh Gumboro (tiêm cho gà lúc tuần tuổi, cần tiêm phòng cho đàn gà bố mẹ để tạo miễn dịch thụ động cho gà ngày đầu nở), loại bỏ gà có triệu chứng lâm sàng sau chủng vaccin để loại bỏ mầm bệnh Vệ sinh chuồng trại sẽ, vệ sinh thức ăn, nước uống tránh nhiễm mầm bệnh Tiến hành ủ phân để tiêu diệt mầm bệnh Định kỳ tuần sát trùng chuồng trại Trong q trình ni cung cấp thêm sản phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, vitamin, chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng bệnh, chống stress… II.1.5.7 Điều trị: Bệnh virus gây khơng có thuốc đặc hiệu để điều trị, đàn gà phát bệnh biện pháp chủ yếu để giảm tỉ lệ chết tăng cường sức đề kháng việc nuôi dưỡng, quản lý, chăm sóc, cung cấp đầy đủ chất điện giải, vitamin Ỉ Điều trị bệnh Gumboro phải theo ngun tắc: hạ sốt + giải độc + trợ lực + chống xuất huyết + loại trừ bội nhiễm vi khuẩn gây bệnh khác Vì thấy gà chết chủ yếu do: + Sốt cao + Ngộ độc urat thận bị tổn thương + Bội nhiễm loại vi khuẩn khác + Mất nước tiêu chảy nặng Hiệu điều trị bệnh cao hay thấp tùy thuộc vào thời điểm mà phát bệnh, phát sớm việc điều trị mang lại hiệu cao NGUYỄN TRẦN LÂM THANH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Mặt khác, đàn gà mắc bệnh, việc dùng kháng sinh để điều trị làm bệnh trở nên trầm trọng tăng tỉ lệ chết Khi gà bệnh cần cho uống đường glucose số loại thuốc hỗ trợ đề kháng như: Vime C Electrolyte, Vimeperos, Vimix Plus, Vimevit Electrolyte, Aminovit, Vitaral… II.2 Enzym - Linked Immunosorbent Assay ( ELISA): ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) – xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym, kỹ thuật sinh hóa hữu ích mạnh việc xác định việc diện định lượng mức ng/ml, pg/ml chất có dung dịch như: huyết thanh, tinh dịch, nước tiểu, dịch huyền phù nuôi cấy Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học sống bệnh học nói chung II.2.1 Nguyên lý chung ELISA: Sử dụng enzym để phát gắn kết đặc hiệu kháng nguyên ( Antigen-Ag) kháng thể (Antibody-Ab) Enzym chuyển chất khơng màu thành sản phẩm có màu, nhờ ta thấy liên kết Ag-Ab Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay khơng có mặt lượng Ag mẫu nghiên cứu II.2.2 Một số ứng dụng ELISA: Xác định nồng độ Ab huyết thanh; Kiểm tra có mặt Ag Phát yếu tố có khả gây dị ứng thực phẩm Xác định hoạt tính hợp chất sinh học … II.2.3 Các phương pháp ELISA: Có phương pháp gồm: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA sandwich Tất kiểu sử dụng xét nhiệm gọi ELISA cạnh tranh (competition ELISA) hay ELISA kềm hãm (inhibition ELISA) NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.2.3.1 ELISA trực tiếp: gồm bước chính: Kháng nguyên pha loãng dung dịch đệm (thường carbonate/bicarbonate pH cao 9.6 hay dung dịch PBS trung tính), bổ sung dung dịch vào pha rắn ( dung chị đệm khơng chứa protein cạnh tranh với kháng nguyên mục tiêu để gắn vào pha rắn) Kháng nguyên bám thụ động vào bề mặt pha rắn trình ủ Tuy nhiệt độ, thời gian ủ khơng quan trọng, việc chuẩn hóa điều kiện cần thiết, chẳng hạn ta nên ủ 37oC Sau ủ, ta tiến hành rửa để loại bỏ kháng nguyên không hấp thụ vào bề mặt rắn Kháng thể có gắn enzym bổ sung trực tiếp vào vị trí kháng nguyên bề mặt rắn Các kháng thể pha loãng dung dịch đệm chứa số chất ức chế hấp thu thụ động protein, cho phép gắn kết miễn dịch Sau ủ, kháng thể gắn vào kháng ngun Rửa lần để loại bỏ kháng thể khơng bám, để cịn lại đĩa phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn enzym Bổ sung chất phù hợp cho enzym gắn vào kháng thể Điều giúp hổ trợ cho phản ứng xúc tác tạo màu enzym Cuối màu dung dịch xác định qua máy quang phổ trắc quang ( spectrophotometer), đọc bước sóng phù hợp Ưu điểm phương pháp: đơn giản Nhược điểm phương pháp: độ đặc hiệu bị giới hạn thơng thường kháng ngun có epitop mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitop Tốn công: phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.2.3.2 ELISA gián tiếp: bước tương tự ELISA trực tiếp Sau kháng nguyên hấp phụ bề mặt vật rắn rửa bỏ phần không hấp phụ, kháng thể không đánh dấu bổ sung vào Sau ủ, rửa bỏ kháng thể không bám vào kháng nguyên Bổ sung kháng thể thứ có gắn enzym để kháng lại kháng thể thứ (kháng thể pha lỗng dung dịch đệm khóa) Tiến hành ủ, rửa bỏ kháng thể không bám Cuối bổ sung chất cho enzym để tiến hành phản ứng tạo màu, đọc kết Ưu điểm phương pháp: kháng thể có gắn enzym nên dùng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên tiện lợi, kinh tế, dễ thương mại hóa Nhược điểm phương pháp: độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng II.2.3.3 ELISA sandwich: Trong phương pháp kháng nguyên kẹp kháng thể vừa phát pha rắn hoạt động kháng thể gắn enzym Kháng thể gắn vào pha rắn gọi “kháng thể bắt giữ” (capture antibody), kháng thể lại gọi “kháng thể phát hiện” (antibody detector) Với cách sử dụng lúc kháng thể để phát kháng nguyên làm tăng tính xác xét nghiệm Các hệ thống sandwich khác tùy thuộc vào nguồn kháng thể mà ta sử dụng Có cách: sandwich trực tiếp sandwich gián tiếp U ELISA sandwich trực tiếp: Kháng thể gắn thụ động vào pha rắn Các kháng thể gắn vào kháng nguyên.( kháng nguyên pha lỗng dung dịch đệm khóa để tránh gắn không chuyên biệt vào pha rắn dung dịch đệm khóa khơng chứa kỳ thành phần kháng nguyên gắn kết vào kháng thể bắt giữ) Kháng thể thứ thêm vào chúng có gắn kết với enzym Cơ chất thêm vào để xúc tác phản ứng tạo màu cho enzym NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Kết đọc máy quang phổ trắc quang (spectrophotometer) U ELISA sandwich gián tiếp: Tương tự trực tiếp có điểm khác quan trọng là: kháng thể thứ thêm vào không gắn với enzym để phát phức hợp kháng nguyên - kháng thể ta phải sử dụng kháng thể khác kháng lại kháng thể thứ có gắn enzym thêm vào sau Việc tiến hành ELISA sandwich gián tiếp có nhiều ưu điểm hơn, vừa mang ưu điểm ELISA sandwich, vừa mang ưu điểm ELISA gián tiếp II.2.3.4 ELISA cạnh tranh-ức chế: Sự diện kháng nguyên (hay kháng thể) phát định lượng mẫu chưa biết cách xác định khả cạnh tranh kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu kháng nguyên (hay kháng thể) có đánh dấu để gắn vào kháng thể (hay kháng nguyên) gắn vào giếng trước Đầu tiên đường chuẩn thiết lập để xác định lượng kháng nguyên (hay kháng thể) mẫu chưa biết cách so sánh với đường chuẩn thiết lập sẵn hệ thống Đường chuẩn cho thấy khả cạnh tranh gắn kháng nguyên (hay kháng thể) đánh dấu không đánh dấu vào kháng thể (hay kháng nguyên) cố định giếng bổ sung lượng kháng nguyên (hay kháng thể) có đánh dấu với lượng khác biết trước nồng độ kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu Nếu nồng độ kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu thấp phần lớn vị trí kháng thể (hay kháng nguyên) giếng bị kháng thể đánh dấu gắn vào, ngược lại Dựa vào mối quan hệ ta thiết lập đường cong biểu diễn mối quan hệ tín hiệu hay % gắn kháng nguyên (hay kháng thể) đánh dấu với nồng độ kháng nguyên (hay kháng thê) không đánh dấu II.3 Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus Gumboro: ELISA kỹ thuật nhạy đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (0,1ng / ml) So với kỹ thuật miễn dịch khác kỹ thuật vừa rẻ tiền lại an tồn mà đảm bảo độ xác cao ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm… NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Trong giới hạn seminar giới thiệu kỹ thuật Indirect ELISA qua phần nhỏ: Một nghiên cứu “ Dùng ELISA phát IBDV tỷ lệ pha loãng khác huyết thanh” Department of Animal Biotechnology, Madras Veterinary College, Tamil Nadu Veterinary and Animal Sciences University, Tamil Nadu, India Sử dụng kit thương mại thị trường (FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease Antibody ELISA kit ) để phát kháng thể kháng lại IBDV Bộ kit công ty Guildhay Ltd, England II.3.1 ELISA phát IBDV tỷ lệ pha loãng khác huyết II.3.1.1 Nuôi cấy virus: IBDV phân lập từ Tamil Nadu - vùng đất Ấn Độ sử dụng nghiên cứu Chúng nhân lên tế bào Vero, sau tách qua ly tâm theo gradian nồng độ sucrose tinh khiết 30% hay 60% Các IBDV tinh khiết sử dụng kháng nguyên ủ đĩa ELISA II.3.1.2 Sự tinh chế kháng nguyên: Các kháng nguyên IBDV tinh chế cách sử dụng phương pháp SNYDER cộng Những tế bào Vero bị nhiễm nuôi cấy lơ lửng (culture supernatant), chúng lọc qua ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút 20phút 4oC ( Sigma, Germany), để loại bỏ mãnh vỡ tế bào Những chất lơ lững loại bỏ qua ly tâm 35.000 vòng/phút 3h30 phút 4oC (Beckman Ti 70 rotor, USA) Các pellet virus tái huyền phù (resuspended) phần mười dung dịch đệm gốc TNE (0,01 mol / L Tris HCl, 0,1 mol / L mol NaCl 0,00 / L EDTA, pH 8,3) Dung dịch huyền phù ly tâm lại lần với 10.000 vòng/phút 10 phút oC để loại bỏ mãnh vỡ tế bào Dung dịch huyền phù thu thập chạy gián đoạn gradiant sucrose 30% 60% Sau ly 35.000 vịng / phút 3h30 oC (Beckman Ti 60 rotor) Sau ly tâm, chúng tách thành lớp: sucrose 30% 60%, sau thu nhận pha loãng với dung dịch đệm TNE theo tỷ lệ 1:5, lưu giữ -70 oC nồng độ protein định lượng 7mg/ml NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm: + Kháng ngun pha lỗng theo tỷ lệ 1:75 với dung dịch đệm cacbonat bicarbonate pH=9,6 100 µL dịch virus pha lỗng bổ sung cho giếng + Đĩa ủ qua đêm oC để kháng nguyên bám vào bề mặt đĩa Các giếng rửa lần với dung dịch PBST + Kháng nguyên bám vào giếng cố định cách sử dụng dung dịch BSA 2% + 100µL dung dịch đệm khóa (blocking solution) PBST-BSA bổ sung vào giếng, ủ 37oC vòng sau giếng rửa lại ba lần với dung dịch PBST + Mẫu huyết pha loãng theo tỷ lệ 1:100 với dung dịch PBS tiếp tục pha loãng hai lần để đạt tỷ lệ pha lõang liên tiếp, đạt tỷ lệ 1:12800 dừng Từ dung dịch huyết pha lỗng trên, hút 100µL cho vào giếng để chúng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên có sẵn giếng + Đĩa ủ 37 oC 1h, rửa lại ba lần với dung dịch PBST + Bổ sung 100µL dung dịch pha loãng theo tỷ lệ 1:3000 kháng thể thỏ kháng kháng thể gà IgG HRP pha dung dịch PBS + Ủ 1h 30 oC, giếng rửa lần với dung dịch PBST + Thêm 100µL chất tạo màu ( dung dịch ABTS với H2O2) + Ủ 37 oC phút + Phản ứng ngừng lại cách thêm vào 50µL dung dịch SDS 5% cuối đọc kết bước sóng 405nm Để giảm sai khác đĩa, đường chuẩn huyết thiết lập cách sử dụng tỷ lệ mẫu mẫu dương tính (S/P ratio) chúng tính sau Sample OD - Negative OD () S/P ratio = Positive OD - Negative OD Nếu tỷ lệ S/P > 0, mẫu kiểm tra có chứa kháng thể kháng IBDV Và qua kết nghiên này, người ta đưa phương trình hồi quy xác định nồng độ kháng thể mẫu: log 10X= 0.0958 * (log10 S/P ratio) + 3.5936 NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.3.2 FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease Antibody ELISA kit II.3.2.1 Bộ kit sử dụng để: Ước lượng thời gian thích hợp cho tiêm phịng Giám sát phản ứng sau tiêm vaccin Xác nhận tình trạng bệnh II.3.2.2 Đề nghị cách lấy mẫu xét nghiệm: Theo hướng dẫn, cần 1% mẫu đủ cho tiêm phòng giám sát dịch bệnh Trong thực tế, IBD, cần có từ 20-50 gia cầm trại đủ để tiến hành thí nghiệm kiểm tra II.3.2.3 Thành phần kit :dành cho kit có đĩa 96 giếng đĩa 96 giếng, giếng có phủ sẵn kháng nguyên IBD Mẫu đối chứng dương với kháng thể kháng IBDV dung dịch đệm phosphate có protein ổn định ProClin 0.063% (500µl) (ProClin chất kháng vi sinh vật không ngăn cản việc gắn kết kháng thể) Mẫu đối chứng âm huyết gà bệnh dung dịch đệm phosphate có protein ổn định ProClin 0.063% (500µl) Kháng thể thứ cấp kháng kháng thể gà thu nhận từ lừa đánh dấu enzyme alkaline phosphastase dung dịch đệm Tris với thuốc nhuộm trơ có màu xanh Sodium Azide (NaN3) 0.1% (11ml) Cơ chất tạo màu phản ứng bao gồm phenolphthalein monophosphate coenzyme dung dịch đệm diethanolamine (11ml) Dung dịch dừng phản ứng NaOH dung dịch đệm diethanolamine (11ml) Dung dịch đệm rửa: đệm phosphate với ProClin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha 1000ml dung dịch rửa Dung dịch pha loãng mẩu: đệm phosphate, protein ổn dịnh Proclin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha 500 ml dung dịch pha lỗng II.3.2.4 Mơ tả thí nghiệm: Bộ kit cung cấp phương pháp test nhanh chóng, đơn giản nhạy để phát kháng thể IBDV huyết lòng đỏ trứng gà Một đĩa phủ sẵn với kháng nguyên tinh khiết virus Mẫu huyết pha loãng ủ giếng, nơi mà kháng thể gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Các phần từ dư thừa, không gắn kết đặc hiệu rửa bỏ loại khỏi giếng Một kháng thể thứ cấp kháng kháng thể gà thu từ lừa đánh dấu enzyme alkaline phosphastase thêm vào giếng để gắn kết đặc hiệu với kháng thể gà Sau giếng rửa thêm lần để loại bỏ thành phần không gắn kết Cơ chất tạo màu PMP bổ sung vào giếng Cường độ màu có liên quan trực tiếp đến số luợng kháng thể có mẫu huyết Hình: Sơ đồ hóa tiến trình thí nghiệm II.3.2.5 Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị mẫu Mẫu huyết cần giữ tươi tốt lưu trữ 4oC (có thể bảo quản lên đến ngày) -20 oC bảo quản lâu Tiến hành pha lỗng mẫu thí nghiệm theo tỷ kệ 1:500 dung dịch đệm pha loãng cách thêm từ 2.5 – μl mẫu huyết hoàn nguyên cho vào tube nhựa 5ml Đảo ngược nhẹ nhàng lần để trộn Ngồi ra, bước sử dụng đĩa để pha lỗng dùng tối thiểu 5μL mẫu Các bước thí nghiệm: + Ðánh dấu vị trí mẫu đối chứng + Bổ sung 50µl huyết vào giếng, ủ 37 oC 30ph + Các thành phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu rửa bỏ loại khỏi giếng dung dịch đệm rửa (300µl/giếng) + Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp có gắn với enzym + Ủ 37 oC 30ph + Tiến hành rửa thành phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu dung dịch đệm rửa (300µl/giếng) NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐỐN VIRUS GUMBORO + Thêm 50µl chất tạo màu phản ứng, lắc + Ủ 37 oC 15ph Dung dịch chuyển thành màu hồng nhạt + Thêm 50µl dung dịch kết thúc phản ứng, lắc + Tiến hành đọc kết máy Microtitre Plate Reader buớc sóng 550nm vịng 15ph sau thêm dung dịch dừng phản ứng Kết thí nghiệm có giá trị khi: Độ hấp thu đối chứng âm < 0.2 Độ hấp thu đối chứng dương > 0.6 Và để tính tốn kết tỷ lệ S/P (tỷ lệ mẫu mẫu dương tính) đề nghị sử dụng ( theo công thức (  )) Và trường hợp nhà sản xuất đưa công thức hồi quy để tính nồng độ kháng thể mẫu sau: log10X = 0.557 * ( log10 S/P ) + 3.6845 Æ X = 10^[ 0.557 * ( log10 S/P) + 3.6845] Tỷ lệ S/P lý giải theo bảng sau: Tỷ lệ S/P 0.017 Mức IBV – 500 > 501 Tình trang tạo kháng thể Có thể chủng ngừa Quá cao để tiêm phòng NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương KẾT LUẬN Bệnh Gumboro bệnh cấp tính gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV - Infectious bursal disease virus) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả miễn dịch gà Lứa tuổi gà mắc bệnh cao – tuần tuổi, gà nhỏ mắc bệnh thể tiềm ẩn, không biểu triệu chứng ảnh hưởng lớn làm ức chế q trình sinh miễn dịch Đây bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại lớn cho chăn nuôi gà, kể gà ni cơng nghiệp gà ni thả vườn tồn giới Việt Nam Do đặc điểm phức tạp bệnh nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, địi hỏi nhiều dụng cụ, trang thiết bị đại thực Ngày với phát triển nhanh chóng hỗ trợ đắc lực công nghệ sinh học đặc biệt sinh học phân tử với kỹ thuật chẩn đoán ELISA tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiën cứu, chẩn đốn phịng trừ bệnh NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO TÀI LIỆU THAM KHẢO Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y – Nguyễn Ngọc Hải – NXB Nông Nghiệp Công Nghệ Sinh Học Trên Người Động Vật – Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc – NXB Giáo Dục The ELISA Guidebook ( Second edition ) – John R.Crowther www.poultryhub.org/index.php/Infectious_bursal_disease_(or_Gumboro) http://www.isapoultry.com/downloads/1/200711_infectious_bursal_disease.pdf http://en.wikipedia.org/wiki/Infectious_bursal_disease 7.www.informaworld.com/smpp/section?content=a727478229&fulltext=713 240928 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3015105 www.hrcak.srce.hr/file/38236 10.http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/GDH_/ V094.20060703.pdf 11 http://www.hytest.fi/data_sheets/newsletters/Poultry%20Diseases.pdf 12 http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&t=1393 13 http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&t=1393 14 http://cnts.hua.edu.vn NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO MỤC LỤC Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 2: TỔNG QUAN II.1 Giới thiệu tổng quát bệnh Gumboro II.1.1 Bệnh Gumboro II.1.2 Hệ thống miễn dịch gia cầm II.1.3 Vai trò túi Fabricius hệ thống miễn dịch gia cầm .6 II.1.3.1 Cấu tạo II.1.3.2 Sự phát triển II.1.3.3 Vai trò túi Fabricius miễn nhiễm .6 II.1.4 Infectious bursal disease virus (IBDV) .7 II.1.5 Những đặc điểm bệnh Gumboro II.1.5.1 Nguồn bệnh .8 II.1.5.2 Phương thức truyền lây II.1.5.3 Cơ chế lây bệnh IBDV II.1.5.4 Triệu chứng II.1.5.5 Bệnh tích .10 II.1.5.6 Phòng bệnh 11 II.1.5.7 Điều trị 11 II.2 Enzym - Linked Immunosorbent Assay ( ELISA) 12 II.2.1 Nguyên lý chung ELISA 12 II.2.2 Một số ứng dụng ELISA 12 II.2.3 Các phương pháp ELISA 12 II.2.3.1 ELISA trực tiếp 13 II.2.3.2 ELISA gián tiếp 14 II.2.3.3 ELISA sandwich .14 II.2.3.4 ELISA cạnh tranh-ức chế .15 II.3 Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus Gumboro 15 II.3.1 ELISA phát IBDV tỷ lệ pha loãng khác .16 huyết II.3.1.1 Nuôi cấy virus 16 II.3.1.2 Sự tinh chế kháng nguyên 16 II.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm 17 II.3.2 FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease 17 Antibody ELISA kit II.3.2.1 Bộ kit sử dụng để 18 II.3.2.2 Đề nghị cách lấy mẫu xét nghiệm 18 NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.3.2.3 Thành phần kit 18 II.3.2.4 Mơ tả thí nghiệm 18 II.3.2.5 Tiến hành thí nghiệm 19 Chương 3: KẾT LUẬN 21 Tài liệu tham khảo NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... đánh dấu II.3 Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus Gumboro: ELISA kỹ thuật nhạy đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (0,1ng / ml) So với kỹ thuật miễn dịch khác kỹ thuật vừa... luanvanchat@agmail.com KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương KẾT LUẬN Bệnh Gumboro bệnh cấp tính gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV - Infectious bursal disease virus) phá huỷ túi Fabracius,... học, kỹ thuật phân tử chẩn đóan bệnh ngày giúp ta chẩn đóan nhanh, sớm cách xác nhiều bệnh virus Khởi phát từ vấn đề nêu trên, giới hạn seminar em xin thực nội dung “ Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus