Phát triển kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh do Echinococcus ở quy mô phòng xét nghiệm

Bài viết Phát triển kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán bệnh do Echinococcus ở quy mô phòng xét nghiệm trình bày việc phát triển bộ kít và đánh giá kỹ thuật LAMP để phát hiện Echinococcus, hướng tới phát triển thành bộ kít dùng cho chẩn đoán nhanh từ các mẫu bệnh phẩm.

Tạp chí y dợc học quân số - 2022 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DO ECHINOCOCCUS Ở QUY MƠ PHỊNG XÉT NGHIỆM Nguyn Thu Hương1, Nguyn Th Anh Vân1, Nguyn Phương Thoa1 Phí Th Hương Liên1, Nguyn Minh Toàn1, Nguyn Ngc Hương Ly2 Đng Anh Sơn3, Nguyn Th Hương Bình4 TĨM TẮT Mc tiêu: Hồn thiện quy trình kỹ thuật phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhiễm Echinococcus người Việt Nam (ECHO-LAMP) Đi tưng phương pháp: Các hoạt động thực nghiệm phịng thí nghiệm gồm: 1) Thiết kế sinh phẩm dựa nguyên lý phản ứng LAMP để chẩn đoán trường hợp nhiễm Echinococcus, 2) Khảo sát khả phát trường hợp nhiễm Echinococcus sinh phẩm chế tạo Kt qu: Bộ sinh phẩm LAMP chẩn đốn Echinococcus có khả phát trường hợp nhiễm lâm sàng Bộ sản phẩm khuếch đại LAMP chế tạo gồm thành phần, đó, cặp mồi thiết kế có kích thước 228bp, chứng dương tạo Kít có nồng độ 100 ng/µL Phản ứng LAMP chế tạo có nồng độ MG 0,004% MgSO4 mM, phản ứng khuếch đại gen mồi 63 C 60 phút, ngưỡng -8 phát Kít 10 ng/µL tương đương với 2,82 x 10 gen/µL Khả phát ca nhiễm Echinococcus sinh phẩm với độ nhạy 93% độ đặc hiệu 98% Kt lun: Bộ kít LAMP chế tạo thực phịng thí nghiệm mà không cần trang thiết bị đặc biệt phù hợp với việc phát tác nhân gây bệnh lây truyền từ động vật sang người * Từ khóa: Echinococcus; Gen 18SrRNA; LAMP Development of LAMP Technique in the Detection of Human Echinococcosis at the Laboratory Scale Summary Objectives: To perfect the technical process in developing the Echinococcus diagnostic kit and evaluate the sensitivity and specificity of the biological kit in the laboratory Subjects and methods: The study was carried out on the experimental activities in the laboratory, including 1) Designing a biological kit based on the LAMP reaction principle to diagnose Echinococcus infections, 2) Surveying the ability of the preparation kit to detect human Echinococcus infections Results: The performance of the Echinococcus-LAMP test (ECHO-LAMP) was found to be stable includes components In which the designed primer pair was 228 bp in size, Trường Đại học Y tế Công cộng Trường PTTH Chuyên Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Bệnh viện Đa khoa Vinmec Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương Ngưi phn hi: Nguyn Thu Hương (nth14@huph.edu.vn) Ngày nhn bài: 19/11/2021 Ngày đưc chp nhn đăng: 16/12/2021 36 Tạp chí y dợc học quân số - 2022 the positive control was created with the kit with a concentration of 100 ng/µL The fabricated LAMP reaction has MG concentration of 0.004% and MgSO4 mM, primer gene detection -8 reaction at 63 C for 60 minutes, the detection threshold of the kit is 10 ng/µL corresponding to 2.82x10 gene copies/µL The sensitivity and specificity were high above 95% for humane Echinococcus Conclusion: The developed ECHO-LAMP test does not require a cold chain or a sophisticated laboratory It holds promise for use as a routine simple molecular tool for point-of-care Echinococcosis diagnosis in zoonotic endemic diseases areas * Keywords: Human Echinococcus; Gen 18S rRNA; LAMP ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nang nước (hydatid disease) hay gọi bệnh hydatidosis Echinococcosis bệnh nhiễm ký sinh trùng lây truyền từ chó sang người Người nhiễm bệnh nuốt trứng sán thức ăn, nước uống đất bị ô nhiễm, sau tiếp xúc trực tiếp với động vật Trên giới, có triệu người bị nhiễm Echinococcus với tỷ lệ tử vong sau phẫu thuật 2,2% khoảng 6,5% tái phát sau can thiệp [6] Việc chẩn đoán bệnh chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm miễn dịch phát kháng nguyên kháng thể lưu hành máu Tuy nhiên, triệu chứng lâm sàng thường không đặc hiệu, thời gian ủ bệnh dài có biểu bệnh vào giai đoạn muộn khó điều trị Việc phát nhanh Echinococcus để có biện pháp điều trị hiệu quan trọng Hiện nay, kỹ thuật xét nghiệm Echinococcus chủ yếu dựa vào xét nghiệm tìm nang ấu trùng sán thể Xét nghiệm xem phương pháp chuẩn vàng chẩn đoán xác định ca bệnh Một số kỹ thuật sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm gồm kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp, nhuộm soi mô bệnh học, kỹ thuật miễn dịch phát kháng nguyên, kháng thể [4, 7, 8, 9, 10] Tuy nhiên, xét nghiệm huyết học xét nghiệm hữu ích giai đoạn người nhiễm sán trường hợp bệnh mạn tính khơng tìm thấy trứng phân Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào loại test, có tượng dương tính kéo dài phản ứng chéo lồi, khó triển khai thực địa Xét nghiệm sinh học phân tử PCR, Real-time PCR hay giải trình tự phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, song địi hỏi phải có trang thiết bị đại kỹ thuật viên có trình độ đào tạo cao Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP nghiên cứu phát triển Công ty Eiken Chemical (Nhật Bản) phương pháp nhân gen đẳng nhiệt ứng dụng nhiều Kết phản ứng LAMP quan sát trực tiếp mắt thường, thời gian xét nghiệm nhanh (khoảng 45 - 60 phút), xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu Trên giới Việt Nam chưa có nghiên cứu cơng bố để ứng dụng kỹ thuật LAMP vào chẩn đoán nhiễm Echinococcus Trong nghiên cứu này, phát triển kít đánh giá kỹ thuật LAMP để phát Echinococcus, hướng tới phát triển thành kít dùng cho chẩn đốn nhanh từ mẫu bệnh phẩm 37 T¹p chí y dợc học quân số - 2022 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Mẫu chứng chuẩn: Sán nang Echinococcus định loại hình thái khẳng định kỹ thuật PCR - Mẫu nghiên cứu: Mẫu thu thập từ phòng khám chuyên ngành Viện Sốt rét - Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương lưu trữ Khoa Sinh học phân tử; mẫu huyết người không nhiễm Echinococcus số ký sinh trùng khác thu từ xã Mai Trung, huyện Bắc Giang - Hóa chất dùng cho LAMP Bst DNA polymerase mua Hãng New England Biolabs, Mỹ Kit tách chiết ADN từ mẫu mô, mẫu phân Hãng Qiagen, Đức Các trình tự mồi thiết kế đặt tổng hợp Hãng IDT, Mỹ * Thời gian địa điểm nghiên cứu: - Thời gian: tháng 01/2021 - 9/2021 - Địa điểm: Phòng Xét nghiệm Sinh học phân tử Trường Đại học Y tế Công cộng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Phương pháp nghiên cứu * Cỡ mẫu chọn mẫu: - Mẫu chuẩn sử dụng cho thiết kế đánh giá hoạt động mồi LAMP: + Mẫu chuẩn dương để chuẩn kỹ thuật: 03 mẫu giai đoạn (ấu trùng sán trưởng thành) thu linh trưởng chó Bộ mơn Ký sinh trùng, Học viện Nông nghiệp cung cấp Các mẫu thẩm định loài qPCR trước đưa vào nghiên cứu, mẫu tiến hành xét nghiệm lặp lại lần 38 + Mẫu chứng âm: Ấu trùng trưởng thành: Giun chó mèo, sán gan lớn Fasciola, Giun móc/mỏ, Teania solium, Strongyloides stercoralis nước cất khử ion - Mẫu sử dụng cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kít ECHO-LAMP: + Mẫu dùng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu sinh phẩm: Mẫu lựa chọn có chủ đích thực với quy mơ nhỏ phịng thí nghiệm dựa vào lượng mẫu dương tính tập hợp mẫu lâm sàng thử nghiệm với giả định tỷ lệ nhiễm (P) 5% Độ nhạy đặc hiệu mong đợi kít ECHO-LAMP khoảng 95%, sai số ước tính hai xác suất 5% với độ tin cậy (giá trị α = 0,05) 95% Số mẫu cần có để ước tính độ nhạy độ đặc hiệu xác định công thức hai tỷ lệ Tính nse = 3,46 làm trịn mẫu dương tính nsp = 76,83 làm trịn 77 mẫu âm tính Trên thực tế, nghiên cứu mẫu huyết dương tính lưu trữ phịng thí nghiệm (1 mẫu thu linh trưởng mẫu bệnh nhân) 88 mẫu âm tính thu từ người khoẻ mạnh, khẳng định âm tính loại ký sinh trùng ELISA PCR - Mẫu sử dụng đánh giá phản ứng chéo loại giun sán 19 mẫu, Toxocara sp (8 mẫu), ấu trùng sán lợn (2 mẫu); sán gan lớn Fasciola (5 mẫu), sán gan nhỏ (2 mẫu), giun Strongyloides stercoralis (2 mẫu) Các mẫu thẩm định qPCR - Mẫu sử dụng cho xác định ngưỡng phát kít ECHO-LAMP: T¹p chÝ y dợc học quân số - 2022 Trờn vựng trình tự bảo tồn gen 18s rRNA sán dây Echinococcus sp có kích thước 596 bp chèn vào vector pUC19 nhân dòng Sản phẩm thu plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA đặc trưng cho sán dây Echinococcus sp có kích thước 3282 bp Lượng plasmid thu hồi µg hịa tan 50 µL nước cất để thu nồng độ 100 ng/µL - Mẫu DNA phân tích: DNA tổng số phân tách từ sán trưởng thành mẫu bệnh phẩm thu từ bệnh nhân tách chiết DNA micro kit QIAamp DNA stool mini kit Qiagen (Germany) Quy trình tách chiết thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - Thiết kế mồi: Mồi cho phản ứng LAMP thiết kế vùng gen đặc hiệu cao Cox1 theo nghiên cứu trước công bố giới (2,3) Phần mềm chuyên dụng thiết kế mồi cho phản ứng LAMP sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (https://primerexplorer.jp/e/) Các trình tự gen 18s rRNA lồi sán dây Echinococcus sp ngân hàng liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) tải sử dụng phần mềm MEGA với tính chức Clustal W để gióng trình tự bảo tồn gen Echinococcus spp Kết thu đoạn trình tự bảo tồn cho Echinococcus spp có kích thước 596 bp sản phẩm sau phản ứng LAMP cặp mồi F3-B3 có kích thước theo lý thuyết 228bp < 280 bp Bảng 1: Trình tự mồi LAMP thiết kế vùng gen 18s rRNA phát Echinococcus sp Tên mồi Vị trí 5’ Vị trí 3’ Chiều dài (nu) Tm o ( C) Tỷ lệ GC Trình tự mồi F3 283 303 21 56,60 0,38 AGAGGGTTTAAACCAGACATT B3 489 510 22 57,89 0,41 CTTCGAACCTCTAACTTTCGTT FIP 45 GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCAGGTCTAGCATGGAATAACACT BIP 50 TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGACCTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC F2 316 336 21 56,79 0,43 GGTCTAGCATGGAATAACACT F1c 373 396 24 63,00 0,46 GCCCCCGTTTGTTCCTATTAATCA B2 464 488 25 57,47 0,32 CTTGATTAATGAAAACATTCTTGGC B1c 408 432 25 60,49 0,40 TACGTTAGAGGTGAAATTCTTGGAC LB 437 457 21 64,14 0,57 GCGAGACGTCCTACTGCGAAA - Khảo sát tối ưu hóa phản ứng ECHO-LAMP: Các thông số cần khảo sát tối ưu hóa phản ứng LAMP nồng độ Mg2+, nhiệt độ hoạt động mồi, thời gian phản ứng, chất thị màu dùng để quan sát phát sản phẩm LAMP độ nhạy (ngưỡng phát hiện) hệ mồi thiết kế sở kết chế tạo kít LAMP chẩn đốn số loài ký sinh trùng đề tài cấp Nhà nước KC10/10.16-20 MgSO4 khảo sát nồng độ 4, mM Phản ứng LAMP thực dải nhiệt độ từ 60 - 65oC, 39 Tạp chí y dợc học quân số - 2022 sử dụng chất thỉ màu MG với nồng độ 0,012, 0,008, 0,004 0,001% [5] Thời gian thực phản ứng LAMP khảo sát 40 60 phút Tiêu chí đánh giá lựa chọn thông số dựa vào việc quan sát sản phẩm LAMP gel agarose 2% chuyển màu dung dịch ống mẫu âm dương sau phản ứng Đọc kết quan sát tổng số 12 lần xét nghiệm thông qua lặp lại lần, với mẫu chứng đánh giá kỹ thuật viên quan sát độc lập thời điểm xét nghiệm - Độ nhạy (Se) độ đặc hiệu (Sp) ECHO-LAMP: Bộ mẫu dùng đánh giá Se Sp kít LAMP chẩn đốn Echinococcus mẫu dương tính lưu phịng thí nghiệm mẫu thu thực địa Tất mẫu xét nghiệm khẳng định qPCR trước thử nghiệm Hiện chưa có kít LAMP chẩn đốn Echinococcus thương mại hóa Do vậy, chúng tơi sử dụng kít có điều kiện phản ứng mồi công bố Salant CS, 2012 [12] để so sánh với kít ECHO-LAMP chế tạo trình tự đích, sau biến nạp vào E coli DH5α, theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm - Kỹ thuật giải trình tự máy giải trình tự tự động 3500 * Phương pháp phân tích xử lý số liệu: - Phân tích số liệu phần mềm kèm với máy phần mềm tin sinh: AB7500 version 2.06, Primer Explorer v.5, Primer Blast, Mega - Tính độ nhạy, độ đặc hiệu, hệ số tương đồng Kappa phần mềm Medcalc * Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thông qua Hội đồng Đạo đức NCYSH Trường Đại học Y tế Công cộng theo Quyết định số 191/2021/YTCC-HD3, ngày 26/4/ 2021 Những quy định đạo đức nghiên cứu thực nghiêm túc suốt trình nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chế tạo Kít LAMP chẩn đốn Echinococcus * Khảo sát khả hoạt động mồi LAMP: Se = Số mẫu dương thật/(số mẫu dương thật + số mẫu âm giả) x 100% Sp = Số mẫu âm thật/(số mẫu âm thật + số mẫu dương giả) x 100% * Các kỹ thuật khác sử dụng nghiên cứu: - Thu thập bảo quản mẫu theo quy trình thu mẫu - Xử lý mẫu tách chiết DNA theo phương pháp tủa cồn - Kỹ thuật qPCR xác định Echinococcus - Phương pháp tạo dịng: Trình tự DNA đích cần tạo dịng chuyển vào plasmid tạo dịng Plasmid tái tổ hợp mang đoạn 40 Hình 1: Sản phẩm LAMP sử dụng mồi tự thiết k c hiu cho Echinococcus sp Tạp chí y dợc häc qu©n sù sè - 2022 Để đánh giá khả hoạt động mồi thiết kế, kết điện di gel agarose 2% cho thấy, sản phẩm sau phản ứng (cột 1-8) mẫu dương chuẩn có dạng dải băng dài tương đương thang chuẩn DNA (M), hình ảnh đặc trưng sản phẩm LAMP Bảng 2: Kết hoạt động cặp mồi đặc hiệu Echinococcus sp ADN Mồi F3-B3 Sán dây nhỏ chó Echinococcus sp + Giun móc/mỏ - Giun đũa chó mèo Toxocara - Sán gan lớn Fasciola - Sán dây Teania solium - Giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis - Nước cất khử ion - Bảng cho thấy khả hoạt động cặp mồi thiết kế phát mẫu tách ADN Echinococcus sp, không phản ứng với mẫu ADN tách từ giun chó mèo, sán gan lớn Fasciola, giun móc/mỏ, Teania solium, Strongyloides stercoralis nước cất khử ion * Kết khảo sát chất thị màu cho phản ứng LAMP: Bảng 3: Kết quan sát chất thị màu MG nồng độ khác Nồng độ MG Mẫu 0,001% 0,004% 0,008% 0,012% Màu xanh lam % Dương tính % Âm tính 36 100 36 100 Chứng dương 36 100 Chứng âm 36 100 Chứng dương 36 100 Chứng âm 27 75 25 Chứng dương 36 100 100 Chứng âm 31 86,1 13,8 Có Khơng Chứng dương Chng õm 41 Tạp chí y dợc học quân sù sè - 2022 A B Hình 2: Phản ứng màu mẫu chứng dương âm A Hình ảnh ống trước phản ứng; B Hình ảnh màu ống sau phản ứng: Mẫu dương có màu xanh nhạt, mẫu âm không màu Các nồng độ MG khảo sát 0,012%, 0,008%, 0,004% 0,001% Kết biểu diễn bảng 1, hình 2, cho thấy nồng độ MG 0,004% nồng độ tối ưu phân biệt mẫu dương tính âm tính * Kết khảo sát thời gian thực phản ứng: Hình 3: Sản phẩm LAMP sau thời gian phản ứng 40 phút (Làn - 16) 60 phút (Làn - 8) Khảo sát thời gian tối thiểu thực phản ứng LAMP 40 60 phút, thành phần phản ứng: DNA khuôn, mồi, đệm phản ứng, nồng độ Mg2+ mM điều kiện khác giữ nguyên đồng nhất, thay đổi thời gian thực phản ứng Do mong muốn giảm thiểu thời gian phản ứng nên nghiên cứu này, không tiến hành thực nghiệm khoảng thời gian dài 60 phút Kết cho thấy thời gian tối thiểu để khuếch đại DNA phản ứng LAMP 60 phút 42 T¹p chÝ y dợc học quân số - 2022 * Kho sát ngưỡng phát kít LAMP: Bảng 4: Kết khảo sát ngưỡng phát mồi LAMP Nồng độ (ng/µl) Kết Lần Lần Lần 10 -6 (+) (+) (+) 10 -7 (+) (+) (+) 10 -8 (+) (+) (+) 10 -9 (-) (-) (-) 10 -10 (-) (-) (-) 10 -11 (-) (-) (-) Neg1 (-) (-) (-) Neg2 (-) (-) (-) Kết cho thấy, ngưỡng phát sơ cấp Kít 10-8 ng/µL tương ứng với 2,82 x 10o Thử nghiệm LOD95% mồi 2,12 x 10o số gen/µL (95%CI: 1,71 x 10o gen/µL đến 2,89 x10o gen/µL) Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kít phịng thí nghiệm Bảng 5: Kết so sánh kít ECHO-LAMP so với qPCR ECHO-LAMP chế tạo qPCR Tổng Dương tính Âm tính Dương tính 29 30 Âm tính 148 150 31 149 180 Tổng số Pse = (29/(29+2))*100% = 93,55%, Psp = (148/(148+1)) * 100% = 99,33% Po = 0,983 Pe = 0,719 Kappa = 0,94 Bảng 6: Kết so sánh kít ECHO-LAMP so kít LAMP mồi Salant CS ECHO-LAMP chế tạo LAMP-Salant CS, 2012 Tổng Dương tính Âm tính Dương tính 29 30 Âm tính 49 51 31 50 81 Tổng số Pse = (29/(29+2))*100% = 93,55%, Psp = (49/(49+1)) * 100% = 98,00% Po = 0,963 Pe = 0,530 Kappa = 0,921 43 T¹p chÝ y dợc học quân số - 2022 BN LUN Tiêu chuẩn vàng cho việc phát trường hợp nhiễm Echinococcus sp người theo truyền thống dựa việc phát hình thể ký sinh trùng trưởng thành đường tiêu hóa và/hoặc có nang dạng bọc nước mô, tạng đặc thể Các phương pháp phát ký sinh trùng thường không tốn công, phát tốt chất thủ thuật can thiệp xâm lấn gây tổn thương khó hồi phục người Hơn nữa, phương pháp kiểm tra đơn giản kính hiển vi quang học dựa vào hình thể ký sinh trùng khơng thể phân biệt hình thái tất loại trứng, nang ấu trùng loài thuộc họ Taenida [6] Ngồi ra, test chẩn đốn Echinococcosis khơng có sẵn thị trường Phương pháp PCR có sẵn chi phí cao trang thiết bị, hố chất, người - để hồn thành q trình khuếch đại DNA điện di phân tích gel agarose Do đó, u cầu đối kít chẩn đốn đơn giản hơn, rẻ độ nhạy, độ đặc hiệu cao phương pháp phát sàng lọc hàng loạt cần thiết, đặc biệt khu vực dịch tễ có tần suất đồng nhiễm Echinococcus với loài sán dây khác (Zoonotic Taeniid) Phương pháp LAMP thực nhanh vòng chưa đến điều kiện đẳng nhiệt cách sử dụng thiết bị ổn nhiệt đơn giản, chẳng hạn nồi cách thủy máy gia nhiệt khối Không cần gel agarose điện di để đánh giá trực quan kết thử nghiệm [6, 7, 8] Các kết quan sát sau phản ứng kiểm tra đánh giá trực quan cách 44 thêm màu xanh MG vào hỗn hợp khuếch phân biệt phản ứng LAMP dương tính với phản ứng âm tính * Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ECHO-LAMP: - Nhiệt độ phản ứng LAMP: Nhiệt độ gắn mồi (Ta) yếu tố quan trọng hàng đầu, định tính xác hiệu khuếch đại kỹ thuật PCR kỹ thuật khác phát triển từ PCR Một đặc trưng LAMP khuếch đại DNA hiệu điều kiện đẳng nhiệt, nhiệt độ phù hợp cho phản ứng dao động từ 50 - 68oC Trên sở này, tiến hành khảo sát nhiệt độ khoảng 60 - 65oC Kết điện di sản phẩm LAMP cho thấy, nhiệt độ 63oC sản phẩm khuếch đại đạt hiệu suất cao Nhiệt độ 63oC đánh giá tạo điều kiện ủ mồi tăng cường khả chịu đựng chất ức chế thường tìm thấy mẫu chẩn đoán bệnh - Nồng độ MgSO4: Nồng độ MgSO4 ảnh hưởng đến hiệu tính đặc hiệu phản ứng PCR Trong dung dịch đệm, quan trọng ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm-melting temperature) DNA mạch đơi, tạo phức chất tan với dNTPs để hình thành chất mà enzyme polymerase nhận ra, điều cần thiết cho trình liên kết dNTPs Trong phản ứng LAMP, nồng độ MgSO4 thích hợp thường nằm khoảng - 10 mM Sau khảo sát, nhận thấy rằng, MgSO4 nồng độ mM khơng có sản phẩm khuếch đại, MgSO4 nồng độ mM cho sản phẩm không ổn định, hiệu sut khụng cao, Tạp chí y dợc học quân sè - 2022 MgSO4 nồng độ mM cho sản phẩm LAMP với hiệu suất khuếch đại cao ổn định Do vậy, chọn MgSO4 mM nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP Chất thị màu sử dụng để đọc kết LAMP: Có nhiều nghiên cứu chứng minh kỹ thuật LAMP kỹ thuật có độ đặc hiệu cao, độ nhạy, thời gian phản ứng ngắn cho phép phát sản phẩm khuếch đại trực quan đơn giản cách quan sát độ đục, thuốc nhuộm huỳnh quang thuốc nhuộm thị pH Gần đây, chất thị màu MG sử dụng thành công chất thị nhạy với pH để phát sản phẩm LAMP Sự thay đổi màu sắc MG (dạng cation) phụ thuộc vào pH dung dịch (pH10: khơng màu) Bước sóng hấp thụ cho MG 621 nm Trong xét nghiệm LAMP-MG, mẫu dương tính âm tính dễ dàng phân biệt mắt thường màu xanh nhạt không màu, tương ứng (Hình 3) Việc bổ sung MG vào đệm LAMP trước tiến hành phản ứng không ảnh hưởng đến hoạt động Bst DNA polymerase, đồng thời loại bỏ nguy tạp nhiễm mẫu Ưu điểm xét nghiệm LAMP-MG cải thiện khắc phục hạn chế từ phát LAMP khác đề cập Các nồng độ MG khảo sát 0,012%, 0,008%, 0,004% 0,001% Kết cho thấy, có đồng người quan sát họ kết luận nồng độ MG 0,004% nồng độ tối ưu phân biệt mẫu dương tính âm tính Nghiên cứu phát triển kít ECHOLAMP chúng tơi có tiềm lớn nước phát triển, nơi bệnh lây truyền lưu hành khan trang thiết bị, chuyên gia kỹ thuật Kỹ thuật LAMP thiết lập thực thí điểm điểm kính hiển vi thực địa, cộng đồng cho chẩn đoán sốt rét, sán gan lớn, sán gan nhỏ thuộc đề tài cấp Nhà nước KC10/10 16-20 [3] * Ngưỡng phát kỹ thuật LAMP: Nhóm nghiên cứu Viện Sốt rét Ký sinh trùng Côn trùng Trung ương phát triển kít LAMP với mồi tự thiết kế dãy nồng độ pha loãng ADN tổng số, tách chiết từ mẫu mô sán gan lớn trưởng thành cho thấy ngưỡng phát đạt 10 - ng [1], hay với Plasmodium falciparum 10 - ng P vivax 10 - ng [5] Trong nghiên cứu này, ngưỡng phát kỹ thuật LAMP phát ca nhiễm Echinococcus sp 10 - ng/phản ứng, tương đương với 0,294 sao/ phản ứng Ngưỡng phát tương đương, chí tốt so với nghiên cứu khác tác giả giới với ngưỡng phát từ 10 - [11] đến 10 - ng [10] Đồng thời, kỹ thuật LAMP cho kết tốt với khả phát ngưỡng thấp tiến hành mẫu giả định * Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kit ECHO-LAMP: Khi so sánh độ nhạy độ đặc hiệu ECHO-LAMP chế tạo với kít LAMP có cặp mồi thiết kế Salant CS, 2012 [9] có độ nhạy 93,55%, độ đặc hiệu 98,00% với phù hợp cao (Kappa = 0,92 > 0,8) Kết độ nhạy độ đặc hiệu so với qPCR kít ECHO-LAMP có độ nhạy 93,55%, độ đặc hiu 99,33% v s phự 45 Tạp chí y dợc häc qu©n sù sè - 2022 hợp cao (Kappa = 0,94 > 0,8) Như vậy, kit ECHO-LAMP nghiên cứu có phù hợp cao với phương pháp PCR đối sánh Kết góp phần củng cố thêm liệu hiệu LAMP chẩn đoán nhiễm Echinococcus đạt mức tương đồng cao phương pháp PCR [3] Tác giả Xing-Wei Ni CS (2014), nghiên cứu phát triển LAMP áp dụng vào chẩn đốn nhiễm Echinococcus chó Trung Quốc dùng phương pháp Real-time PCR làm phương pháp tham chiếu độ nhạy LAMP so với PCR thông thường, xét nghiệm LAMP cung cấp độ đặc hiệu 88,8% độ nhạy 100% [13] Agathe Nkouawa CS năm 2010, so sánh khả chẩn đoán LAMP với multiplex PCR để phát phân biệt loài Taenia mẫu phân bệnh nhân nhiễm sán dây Phương pháp LAMP dương tính giả, cho thấy độ nhạy cao (88,4%) so với multiplex PCR (37,2%) [14] Do đó, phương pháp LAMP có giá trị cao chẩn đốn phân tử bệnh sán dây người Nghiên cứu có số hạn chế chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng LAMP cho chẩn đoán Echicoccosis người thực phịng thí nghiệm nên chưa đánh giá đầy đủ tính ổn định sinh phẩm Ở nghiên cứu này, mạnh dạn so sánh với kỹ thuật qPCR, kít ECHO-LAMP số liệu bước đầu cho thấy hiệu khả quan chẩn đoán bệnh Echinococcus người Tuy nhiên, để ứng dụng lâm sàng, cần thử nghiệm so sánh với cỡ mẫu lớn hơn, hướng đến ứng dụng rộng rãi cộng đồng 46 KẾT LUẬN Bộ mồi thiết kế nghiên cứu hoạt động tốt, có tính đặc hiệu cao với Echinococcus khơng có bắt cặp chéo với loài sán khác Phản ứng LAMP chế tạo có nồng độ MG 0,004% MgSO4 mM, phản ứng khuếch đại gen mồi 63oC 60 phút Kết phản ứng sau sử dụng sinh phẩm ECHO-LAMP chế tạo quan sát mắt thường sau bổ sung chất thị màu MG Ngưỡng phát kít 10-8 ng/µL tương ứng với 2,82 x 100 gen/ µL Bộ kít ECHO-LAMP chế tạo có độ nhạy độ đặc hiệu cao (trên 93% 98%) Bộ kít cho phép ứng dụng kỹ thuật LAMP thuận tiện hơn, khả xác tương đương kỹ thuật PCR khác có triển vọng thể triển khai sở y tế địa phương TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Nguyễn Thị Hương Bình, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Thu Huyền, Trần Văn Hải, Trần Thanh Dương Phát triển kỹ thuật LAMP phát sán gan lớn Fasciola spp Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2020; 62(7):23-28 Nguyễn Thị Hương Bình Báo cáo Tổng kết nhiệm vụ khoa học thường quy: Ứng dụng phát triển kỹ thuật LAMP để định loại P falciparum P.vivax phịng thí nghiệm, năm 2015 Trần Thanh Dương CS Nghiên cứu chế tạo kít LAMP chẩn đốn ký sinh trùng sốt rét, sán gan lớn, sán gan nhỏ, giun lươn đường ruột thực địa”, mã số KC.10.16/16-20 Bộ Khoa học Cơng nghệ https://most.gov.vn/vn/tin-tuc/18760/thong-tinve-ket-qua-thuc-hien-nhiem-vu-cap-quoc-gia- T¹p chÝ y dợc học quân số - 2022 nghien-cuu-che-tao-bo-kit-lamp-chan-doanky-sinh-trung-sot-ret san-la-gan-.aspx cập nhật ngày 13/11/2020 Anh Đào Nguyễn Thị, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Lê Thị Hiên Ứng dụng kỹ thuật LAMP để phát Listeria monocytogenes thực phẩm Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 2012; 16(3):27-32 Hong Ngoc NT, Huong Binh NT, Hong NV, Thang ND, Huong NT, et al In-house validation of a lamp Kít for diagnosis of Plasmodium, Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax in Vietnam Glob J Infect Dis Clin Res 2020; 6(1):048-053 DOI: https://doi.org/10.17352/2455-5363.000035 Mcmanus DP, Zhang W, Li J, et al Echinococcosis Lancet 2003; 362:12951304 Aboelhadida M., Khaled M El-D., Tokuma Y., et al Molecular characterization of Echinococcus granulosus in Egyptian donkeys Veterinary Parasitology 2013; 193:292-296 Adwan G., Kamel A., Sami B., Sameh A., Molecular characterization of Echinococcus granulosus isolated from sheep in Palestine Experimental Parasitology 2013; 134:195-199 Ali TI Ibrahim OEm, Al-sultan II Hydatid hepatic-broncho-pleural (hepato-pulmonary) fistula caused by Echinococcosis granulosa: A zoonotic case report Malaysian Journal of Veterinary Research 2018; 9:91-97 10 Avcioglu H., Esin G., Ibrahim B., et al First Molecular Characterization of Echinococcus multilocularis in Turkey Vector-borne and zoonotic diseases 2016; 20(20) Mary Ann Liebert, Inc Doi: 10.1089/vbz 2016 1983 11 Cruz M.L., Perez A., Domínguez M., et al Assessment of the sensitivity and specificity of serological (IFAT) and molecular (direct‐PCR) techniques for diagnosis of leishmaniasis in lagomorphs using a Bayesian approach Veterinary Medicine and Science 2016; 2(3):211-220 12 Harold Salant, Ibrahim Abbasi, and Joseph Hamburger The development of a loop-mediated isothermal amplification method (LAMP) for Echinococcus granulosis coprodetection Am J Trop Med Hyg 2012; 87(5):883-887 doi:10.4269/ajtmh 2012.12-0184 13 Xing-Wei Ni, Donald P McManus et al A comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with other surveillance tools for echinococcus granulosus diagnosis in canine definitive hosts PLUS ONE Published: July 9, 2014 https://doi.org/10.1371/journal pone.0100877 14 Agathe Nkouawa, Yasuhito Sako, et al., Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method using fecal specimens for differential detection of taenia species from humans Journal of Clinical Microbiology, Sept 2010; 3350-3352Vol 48, No 900951137 doi:10.1128/JCM.00697-10 Copyright © 2010, American Society for Microbiology All Rights Reserved 47 ... sán thể Xét nghiệm xem phương pháp chuẩn vàng chẩn đoán xác định ca bệnh Một số kỹ thuật sử dụng phổ biến phòng xét nghiệm gồm kỹ thuật xét nghiệm trực tiếp, nhuộm soi mô bệnh học, kỹ thuật miễn... ủ bệnh dài có biểu bệnh vào giai đoạn muộn khó điều trị Việc phát nhanh Echinococcus để có biện pháp điều trị hiệu quan trọng Hiện nay, kỹ thuật xét nghiệm Echinococcus chủ yếu dựa vào xét nghiệm. .. thời gian xét nghiệm nhanh (khoảng 45 - 60 phút), xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu Trên giới Việt Nam chưa có nghiên cứu cơng bố để ứng dụng kỹ thuật LAMP vào chẩn đoán nhiễm Echinococcus Trong nghiên