KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TIẾM NĂNG KÝ SINH, GÃY BỆNH VÀ GÀY CHÉT SÂU CÙA TUYẾN TRÙNG Oscheius tipulae ĐUỌC PHÂN LẬP TÙ ĐẤT RÙNG TRỒNG KEO TẠI TỈNH QUẢNG NAM Lê Thọ Sơn1-*, Bùi Thị Mai Hương1, Nguyễn Thị Hồng Gấm1 TÓM TẮT Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematode (EPN)) sống môi trường đất tự nhiên Chúng CÓ khả ký sinh gây bệnh, phát triển thể sâu giết chết sâu Dựa vào tính chất đối kháng í inh học này, hai giống EPN (Steinemema Heterorhabditis) ứng dụng đé tiêu diệt sâu hại cày trồng rộng rãi, nhiên có hạn chế hiệu kim hãm sâu hại trồng vi chủng khơng phù họp với điều kiện đồng ruộng sâu cần tiêu diệt Trong nghiên cứu này, 90 mẫu đất thu trực tiếp từ khu rừng trồng Keo tỉnh Quảng Nam Sử dụng mẫu đất thu được, phân lặp 19 chủng tuyến trùng dựa vào DNA barcode phân loại 11 chủng thuộc loài Oscheius tipulae Thử nghiêm khả giết chết sâu gạo (Zophobas moriò) sâu sáp {Galleria mellonellà) chủng o tipulae CFB237 cho thấy, chủng có khả gây chết sâu gạo sâu sáp khoảng thài gian 24 giờ, có nghĩa có tiềm làm EPN Vi vậy, o tipulae CFB237 10 chủng tuyến trùng khác cần nghiên cứu thêm để phát triển công cụ hạn chế sâu hại trồng tương lai Từ khoá: DNA barcode, Oscheius tipulae, sâu gạo, sâu sáp, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ĐẶT VẦN ĐỂ Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) tồn đất Trong chu trình phát triển vịng đời, ấu trùng EPN tim kiếi‘m ký sinh gây bệnh ấu trùng côn trùng (sâu) nầim mặt đất, chúng sinh trưởng, phát triển sinh sản hệ sau thể sâu Au trùng EPN sinh thoát khỏi xác sâu tìm kiếm ahững sâu đất để tiếp tục quay vịng c•hu kỳ sống Trong q trinh ký sinh EPN, vi khuẩn cộng sinh (Photorhabditis và/hoặc Xenorhabdus) thoát khỏi EPN phát triển thành dạng vi k: luẩn gây độc sâu, góp phần giết: chết sâu khoảng thời gian 24 [1] Trong môi trường đất, EPNs định hướng dịch chuyển tới noi có sâu qua nhận diện “chất tổn thương” do> rễ tiết bị sâu công tim thấy chủ yếu thuộc [2], Những EPN ■ hai giống: Steinemema Heterorhabditis đất canh tác trồng nhiều nước châu Á, tiếp đến châu Phi, Trụng Mỹ châu Âu [3] Một số EPN thuộc giống chác phân bố khu vực hẹp hon Oscheius (O carolinensisva o oniricì) [4], [5], Trường Đại học Lâm nghiệp Email: sonlt@vnuf.ed r.vn Metarhabditis raina [6] Từ thập niên 1990 người bắt đầu ứng dụng EPN (Steinemema Heterorhabditis) để tiêu diệt sâu gây hại trồng [7], [8] Vì EPN thương mại hoá rộng rãi nhiều nước phát triển Theo thống kê thập kỷ 20, trung bình lượng tiền sử dụng vào việc giảm thiểu sâu hại vụ mùa 1,064 tỷ USD/năm, EPN tăng tói 15.825 triệu USD [9], Thích nghi sinh thái chủng EPN khác vi hiệu EPN đạt mức cao, thấp khơng có hiệu áp dụng EPN phân lập từ khu vực khơng thích họp sai đối tượng sâu cần tiêu diệt [10] Vì việc phân lập EPN cần thiết để đưa nhiều khả lựa chọn ứng dụng vào hạn chế sâu hại Tại Việt Nam, số chủng EPN thuộc hai giống Steinernema Heterorhabditis tìm thấy [11] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đề cập EPN Oscheius tipulae Oscheius tipulae phát đất nhiều nơi thê giói, nhiên, loài chưa quan tâm EPN [12] có vai trị “sinh vật ăn xác thối” [4], ngoại trừ chủng Oscheius tipulae Brazil EPN có khả ký sinh gây bệnh giết chết sâu [6], Trong đó, lồi họ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN nông thôn - KỲ - THÁNG 6/2022 35 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ hàng o chongmingensis “tuyến trùng ăn xác thối” [13] Điều cho thấy khả làm EPN tính chất riêng chủng (dưới lồi) khơng phải giống (trên lồi), Oscheius Vì nghiên cứu tập trung trả lịi câu hỏi: Có thể phân lập Oscheius tipulae từ mẫu đất Việt Nam khơng? Oscheius tipulae EPN hay không? VẬT UỆU VA PHUONG PHÁP NGHIÊN cuu 2.1 Thu thập mẫu đất Tại địa điểm cụ thể khu vực rừng trồng Keo lai Keo tràm chưa khai thác có độ tuổi khoảng đến năm huyện Nam Giang, huyện Phước Son, tỉnh Quảng Nam (15°33’25” B, 108o02’12” Đ), lấy mẫu đất khoảng 300 mg tầng đất có độ sâu khoảng 10 - 15 cm (vào tháng năm 2017) Mỗi mẫu đất đại điện cho địa điểm khu vực nhỏ rừng trồng Mầu đất cho vào túi nhựa riêng, giữ mẫu túi mát (khoảng 20 25°C) đưa phịng thí nghiệm Trường Đại học Lâm nghiệp tuần Quá trình phân lập (thường gọi “bẫy”) EPN thực theo quy trinh có kết họp vói quy Bước Bước I / Sâu gạo Cốc nhựa 2.2 Tách chủng tuyến trùng Hình Các bước phân lập EPN 2.3 Thí nghiệm gây chết sâu Tuyến trùng thu nhận từ xác trùng hỗn họp nhiều loài tuyến trùng khác Chuẩn bị đĩa agar 5,5%, dùng pipet hút tuyến trùng trưởng thành mang trứng nhỏ lên bề mặt đĩa agar Để yên - phút, tuyến trùng di chuyển tách rời khắp bề mặt đĩa agar Tiếp tục thao tác kính hiển vi (40X), sử dụng que gắp nhỏ để nhặt cá thể tuyến trùng trưởng thành bỏ vào đĩa có 1/2 sâu gạo Sau - ngày nuôi nhiệt độ phịng (25°C), phát triển thành chủng EPN riêng biệt độc lập 36 trinh thành cơng [14] có điều chỉnh Phân lập tóm tắt qua bước sau: 1) Bỏ sâu gạo sống khoẻ mạnh (superworm, Zophobas moriỏ) [15] vào hộp nhựa dung tích 500 mL; 2) Đất bóp vụn, trộn đổ tới 1/2 hộp Phun nước khử trùng lên mặt đất hộp đến độ vừa đủ độ ẩm (có nước đọng chút thành đáy hộp), đậy nắp hộp đặt hộp mẫu vào noi bóng tối ngày; 3) Những mẫu sâu chết gắp sau bổ sung thêm sâu sống khác cho lần bẫy phòng lần bẫy không thành công Các sâu chết ủ mảnh giấy lọc (2x4 cm) đĩa petri nhỏ (6 cm), tất đĩa nhỏ đặt đĩa petri lớn (10 cm), bổ sung mL nước khử trùng vào đĩa lớn đậy nắp lại Cặp đĩa ủ nhiệt độ phòng 25°c Sau - ngày, tuyến trùng EPN sinh số lượng lớn hệ sau giai đoạn ấu trùng chúng bò đĩa lớn; 4) Dùng pipett hút chuyển mL dung dịch có chúra tuyến trùng EPN đĩa petri lớn sang đĩa ni có sâu gạo chết đặt mảnh giấy lọc, đậy nắp đĩa ủ đĩa 25°c khoảng tói ngày, EPN sinh hệ tuyến trùng (Hình 1) Thí nghiệm thực dựa vào quy trinh phổ biến [15] có điều chỉnh: lần thi nghiệm thiết lập loại đĩa petri (10 cm) có đặt sẵn giấy lọc Đĩa đối chứng khô: sâu sáp ấu trùng Bướm sáp {Galleria melỉonellầ) sâu gạo để chung vào đĩa Đĩa đối chứng + nước: giống vói đĩa đối chứng khơ có bổ sung mL nước Đĩa thứ giống với đĩa đối chứng khô bổ sung mL EPN Tất loại đĩa đậy nắp ủ nhiệt độ phòng 25°c Sau 24 giờ, quan sát tinh trạng sống chết sâu đĩa Xác sâu chết NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nịng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ đĩa thí nghiệm gắp rửa sạch, đặt giấy lọc đĩa petri khác bổ sung mL nước, ủ Trong chuỗi thí nghiệm này, 19 số 90 túi mẫu đất có pH 4,5 dùng để phân lập tuyến sâu chết nhiệt độ phòng khoảng - ngày để quan sát khả có khơng có xuất tuyến trùng nước đĩa Thí nghiệm lặp lại lần dòng o tipulae CFB2Ĩ7 2.4 Chuẩn bị dung dịch chứa mẫu DNA tuyến trùng phản ứng PCR 20 pl dung dịch lysis buffer có bổ sung Proteinase K, tiếp đến, đến cá thể tuyến trùng/chủng gắp chuyển vào ống PCR 200 pl Ống PCR làm lạnh nitơ lỏng 10 phút, sau ủ mẫu 60°C 95°c 10 phút máy PCR cặp mồi sử dụng FwD2A (5-CAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3') va FwD3B (5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'), khuếch đại trình tự 28S rDNA [5] trùng EPN Đã thu 19 chủng tuyến trùng từ 19 mẫu đất không thu chủng khác từ 71 túi mẫu đất cịn lại tuyến trùng phát triển thành chủng riêng biệt điều kiện thí nghiệm khơng thấy xuất tuyến trùng Để xác định thành phần loài dựa vào DNA barcode cho chủng thu được, kỹ thuật PCR có sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho tuyến trùng nói chung tuyến trùng EPN áp dụng Bảy chủng tuyến trùng không xác định thành phần lồi vi sản phẩm PCR khơng đạt chất lượng (mẫu số 6, 7, 8, 10, 15,17 19; hình 2) khơng đề cập phần cịn lại nghiên cứu Tuy nhiên, chúng chủng có tính chất EPN cần có nghiên cứu sâu hon 11 chủng có sản phẩm PCR tốt (mẫu số - 5, 9, 11 - 14, 16 18; hình 2) KÉT QUẢ NGHIÊN cuu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Phân lập phân loại tuyến trùng từ đất rừng trồng Keo iữa 11 chủng EPN dưa vào NCBI Bảng Sự so sánh mức độ dạng tnnh Chủng tuyến trùng _Ấ)ài Độ dài trình tự 28S rDNA (nucleotide) CFB236 Os cheius ti, Dulae 603 99 98,67 0,0 ON256408 607 602 602 604 609 604 602 600 605 605 99 98 99 98 98 98 99 99 98 98 97,01 98,66 98,67 98,50 97,01 98,83 98,50 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ON256415 ON256413 ON256410 ON256406 ON256412 ON256416 ON256411 ON256414 ON256407 ON256409 CFB237 CFB238 CFB239 CFB240 CFB241 CFB242 CFB243 CFB244 CFB245 CFB246 Ghi chú: Dấu - - - - - - - - - - Độ dài so sánh (%) Độ tương đồng (%) Chỉ số E Mã số NCBI * 98,49 98,83 98,83 'loài Oscheius tipulae * National Center for Biology Information Hình Sản phẩm PCR với cặp mồi D2A D3B (Dãy số tò đến 19 số thứ tự chủng tuyến trùng) Phân tích trình tự DNA sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi A2D D3B cho tháy 11 chung tuyến trùng thuộc loài Oscheius tipulae 11 chủng o tipulae có độ tưong đồng trinh tự DNA 28S rDNA 97,01% 98,83% (Hình bảng 1) Kích thước đặc điểm hình thái quan sát sơ cho thấy 11 chủng khơng có khác biệt đáng kể (Hình 4) Vì vậy, 11 chủng gần gũi nhau, vài chủng phổ biến rộng rãi khu vực lấy mẫu NÒNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 6/2022 37 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 3.2 Khả gây chết sâu sáp sâu gạo tuyến trùng o tipulae Hai thí nghiệm gây chết sâu thực để tìm hiểu khả gây chết sâu tuyến trùng o tipulae CFB237 Cả hai loài sâu (sâu gạo sâu sáp) chết vịng 24 bắt gặp tuyến trùng o tipulae Thế hệ tuyến trùng sau xuất từ xác sâu chết khoảng thời gian đến ngày ON2564M ON256416 0.005 Hình Quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào khác biệt nucleotide trình tự 28S rDNA 1OC'Ị1ÍÌ Hình Cá thể tuyến trùng o tipulae CFBb237 trưởng thành ngày thứ Kết nghiên cứu cho thấy, chủng o tipulae CFB237 có khả tiêu diệt sâu, tức có tính chất EPN Đây có chủng EPN mói thuộc lồi o tipulae phát Việt Nam Trước chủng loài o tipulae Brazil chứng minh EPN [51 Vì kết nghiên cứu cho thấy có chủng o tipulae có tính chất EPN 10 chủng lại nghiên cứu phân lập điều kiện tự nhiên gần gũi (độ tưong đồng trình tự 28S rDNA > 97,01%) với o tipuỉae CFB237 Vì vậy, chúng có tiềm EPN Bảng Khả gây chết sâu sáp sâu gạo tuyến trùng o tipulae CFB237 Thí nghiệm 24 sau bổ sung Thời gian xuất EPNs Sâu thử nghiệm đối chứng EPNs sau chết từ xác sâu Thí nghiệm lần Đĩa thí nghiệm Sâu gạo Chết ngày (n=l)‘ Sâu sap Chết ngày Đối chứng + nước * Sâu gạo Sống Bỏ qua (n=l) Sâu sáp Sống Bỏ qua Đối chứng khô8 Sâu gạo Sống Bỏ qua (n=l) Sâu sáp Sống Bỏ qua Thí nghiệm lần Đia thí nghiệm Sâu gạo Chết ngày (n=l)‘ ' Sâu sáp Chết ngày Đối chứng + nước * Sâu gạo Chết Bỏ qua (n=l) Sâu sáp Sống Bỏ qua Đối chứng khô8 Sâu gạo Sống Bỏ qua (n=l) Sâu sáp Sống Bỏ qua Ghi chú: *n sô đĩa thínghiệm * sâu gạo sâu sáp để chung vói đĩa bổ sung mL nước vô trùng $1 sâu gạo sâu sáp để chung đĩa khô Lưu trư lạnh sâu Lưu trữ chủng EPN việc quan trọng không dễ EPN Tất 11 chủng o tipulae giai đoạn L1/L2 sau 42 ngày ống trữ mẫu (1,5 mL dung dịch 2,25% (v/v) glycerol) -20°C sống 40% đến 50%, nhiên khoảng 99% chết tích trữ 4,5% glycerol 38 Lưu trữ mẫu EPN việc bắt buộc để sử dụng làm nhân nhanh thời gian Đối với lồi thuộc giống Steinemema Heterorhabditis ni điều kiện nhiệt độ > o°c đến 23°c cách cấy chuyển theo định kỳ hàng tháng [16] Chúng lưu trữ siêu lạnh khả 100% cá thể bị chết xảy sau NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 6/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ khoảng thời gian hàng năm lưu trữ [17], Sử dụng phương pháp phức tạp tạo hạt “Calcium alginate” cho Steinernema trì EPN lâu (6 tháng) [18], 'ất phương pháp yêu cầu tái nuôi cấy theo định kỳ từ hàng tháng EPN lưu nitơ lỏng (-196°C) kéo dài số năm ( năm) an toàn [19] Trong nghiên cứu này, 11 chủng o tipulae dung dịch 2,25% glycerol lưu trữ thành công tủ lạnh sâu (- 20°C) Có thể mơi trường điều kiện lưu trữ cần phải thử nghiệm điều kiện khác, ví dụ nitơ lỏng, để đạt thời gian lưu trữ dài KẾT LUẬN 90 mẫu đất lấy 90 vị trí khác tỉnh Quảng Nam, phân lập nuôi cấy tri 19 chủng phân lập theo quy trình phân lập EPN 19 mẫu đất riêng biệt 11 chủng xác định tipulae, chúng sống 42 ngày vói tỷ lệ sống khoảng 40% đến 50% nhiệt độ -20°C Chủng o tipulae CFB237 có khả tiêu diệt sâu vịng 24 có tiềtn làm EPN hiệu LOI CÁM 0N Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển Khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã sô 106.06-2019.27cho TS Lê Thọ Son TÀILIỆII THAM KHẢO Dillman, A R„ Sternberg, p w (2012) Entomopathogenic nematodes Curr Biol 22 (11): p R430-1 Bhat, A H., Chaubey, A K., Askary, T H (2020) Global distìibution of entomopathogenic and Heterorhabditis nematodes, Steiner nema Egyptian Journal ofBitiologic 2020 (30: 31) Blanco-Perez, R., Bueno-Pallero, F A., Neto, L., Campos-Herrera, R (2017) Reproductive efficiency of entomopathogenic nematodes as scavengers Are they able to fight for insect’s cadavers? J Invertebr Pathol 148: p 1-9 Andrea Torres-Barragan, Alonso Suazo, Wayne G Buhler, Cardoza, Y J (2011) Studies on the entomopathogenncity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis Biological Control 59 (2011): p I de Brida, A L, Rosa, J M., Oliveira, c M., Castro, B M., Serrao,, J E., Zanuncio, J c., Leite, L G., Wilcken, s R (2017) Entomopathogenic nematodes in agricultural areas in Brazil Sci Rep 7: p 45254 Zhang, X., Li, L., Kesner, L, Robert, c A M (2021) Chemical host-seeking cues of entomopathogenic nematodes Curr Opin Insect Sci 44: p 72 - 81 Chang, D z., Serra, L., Lu, D., Mortazavi, A., Dillman, A R (2019) A core set of venom proteins is released by entomopathogenic nematodes in the genus Steinernema PLoS Pathog 15 (5): p el007626 Koppenhofer, A M., Shapiro-Ilan, D L, Hiltpold, I (2020) Entomopathogenic nematodes in sustainable food production Frontiers in sustainable food systems (Article 125) Lacey, L A., Georgis, R (2012) Entomopathogenic nematodes for control of insect pests above and below ground with comments on commercial production JNematol 44 (2): p 218-25 10 Hiltpold, L, Baroni, M., Toepfer, s., Kuhlmann, u., Turlings, T c (2010) Selection of entomopathogenic nematodes for enhanced responsiveness to a volatile root signal helps to control a major root pest J Exp Biol 213 (Pt 14): p 2417-23 11 K.L Phan, L T., M Moens (2005) Pathogenic potential of six isolates of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinemematidae) from Vietnam BioControl 12 Nishikori, K., Setiamarga, D H E., Tanji, T., Kuroda, E., Shiraishi, H., Ohashi-Kobayashi, A (2018) A new microsporidium Percutemincola moriokae gen nov., sp nov from Oscheius tipulae: A novel model of microsporidia-nematode associations Parasitology 145 (14): p 1853-1864 13 Zhang, K, Baiocchi, T., Lu, D., Chang, D z., Dillman, A R (2019) Differentiating between scavengers and entomopathogenic nematodes: Which is Oscheius chongmingensis? J Invertebr Pathol 167: p 107245 14 Selcuk Hazir, H K K., s Patricia Stock, Nevin Keskin (2003) Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) for Biological Control of Soil Pests Turk J Biol 27 (2003): p 22 NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 39 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 15 Alonso, V., Nasrolahi, s., Dillman, A R (2018) Host-Specific Activation of Entomopathogenic Nematode Infective Juveniles Insects (2) 16 Grewal, p s (2000) Anhydrobiotic potential and long-term storage of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinemematidae) Int J Parasitol 30 (9): p 995-1000 17 Lewis, E E., Shapiro-Ilan, D I (2002) Host cadavers protect entomopathogenic nematodes during freezing J Invertebr Pathol 81 (1): p 25-32 18 Songbi Chen, I G (2005) A novel method for long-term storage of the entomopathogenic nematode Steinemema feltiae at room temperature Biological Control 19 Curran, J., Gilbert, c., Butler, K (1992) Routine Cryopreservation of Isolates of Steinernema and Heterorhabditis spp J Nematol 24 (2): p 26970 POTENTIAL ENTOMOPATHOGENICITY OF NEMATODE Oscheỉus tipulaelSữUIĨKŨ FROM SOIL IN THE ACACIA PLANTATIONS IN QUANG NAM PROVINCE Le Tho Son, Bui Thi Mai Huong, Nguyen Thi Hong Gam Summary Entomopathogenic nematodes (EPNs) are insect parasites and survive in soil They are parasitic to pests, develop in, and kill them As known for the biological completion against pests, two EPN genera (Steinemema and Heterorhabditis) have been used to protect crops and plants from the soil pests However, the results are not always as expected One of the failures is that EPNs implemented could not develop in unfavorable field conditions and find low-specific target pests Therefore, it is required to find more EPNs as possible and the appropriate implementations for them In this research, we sampled the soils from 90 sites within the Acacia woods in Quang Nam province We used the soils to isolate 19 EPN strains and 11 of them were determined as Oscheius tipulae with the nematode DNA barcode We conducted virulence assays for one o tipulae strain and found that it could kill superworms (Zophobas morid) and waxworms (.Galleria mellonelld) within 24 hours, suggesting the tested o tipulae may be an EPN o tipulae CFB237 and the other 10 o tipulae strains need to study more to confirm them as EPNs for protecting crops and plants in the future Keywords: DNA barcode, entomopathogenic nematode, Oscheius tipulae, superworm, waxworm Người phản biện: TS Đào Ngọc Quang Ngày nhận bài: 15/4/2022 Ngày thông qua phản biện: 16/5/2022 Ngày duyệt đăng: 23/5/2022 40 NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 ... nghiệm gây chết sâu thực để tìm hiểu khả gây chết sâu tuyến trùng o tipulae CFB237 Cả hai loài sâu (sâu gạo sâu sáp) chết vịng 24 bắt gặp tuyến trùng o tipulae Thế hệ tuyến trùng sau xuất từ xác sâu. .. quy Bước Bước I / Sâu gạo Cốc nhựa 2.2 Tách chủng tuyến trùng Hình Các bước phân lập EPN 2.3 Thí nghiệm gây chết sâu Tuyến trùng thu nhận từ xác trùng hỗn họp nhiều loài tuyến trùng khác Chuẩn... cứu sâu hon 11 chủng có sản phẩm PCR tốt (mẫu số - 5, 9, 11 - 14, 16 18; hình 2) KÉT QUẢ NGHIÊN cuu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Phân lập phân loại tuyến trùng từ đất rừng trồng Keo iữa 11 chủng EPN dưa vào