Ảnh hưởng của dịch trích hạt dưa lưới (Cucumis melo L.) lên sự ức chế hình thành và làm tan tinh thể calcium oxalate gây bệnh sỏi thận trong điều kiện in vitro

Bài viết Ảnh hưởng của dịch trích hạt dưa lưới (Cucumis melo L.) lên sự ức chế hình thành và làm tan tinh thể calcium oxalate gây bệnh sỏi thận trong điều kiện in vitro tiến hành đánh giá khả năng ức chế và làm tan tinh thể Calcium oxlate gây bệnh sỏi thận của cao chiết Ethanol từ hạt cây dưa lưới được trồng tại An Giang; góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất các sản phẩm có khả năng hỗ trợ và điều trị bệnh; đồng thời góp phần tận dụng phụ phế phẩm nông nghiệp và góp phần giảm thải ô nhiễm môi trường.

ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH TRÍCH HẠT DƯA LƯỚI (CUCUMIS MELO L.) LÊN SỰ ỨC CHẾ HÌNH THÀNH VÀ LÀM TAN TINH THỂ CALCIUM OXALATE GÂY BỆNH SỎI THẬN TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Thị Ái Lan1, Nguyễn Phạm Tuấn2 Trường Đại học Trà Vinh Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Tóm tắt Nghiên cứu sử dụng dịch trích hạt dưa lưới thực để đánh giá khả ức chế tinh thể tan tinh thể Calcium oxalate (CaC₂O₄) điều kiện in vitro Mẫu hạt dưa lưới ly trích phương pháp ngâm dầm với Ethanol 80 % để tạo cao chiết Phần trăm ức chế hạt nhân, phát triển ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate cao chiết hạt dưa lưới xác định phương pháp đo quang phổ bước sóng 620 nm; 214 nm 620 nm Hiệu làm tan tinh thể Calcium oxalate cao chiết hạt dưa lưới xác định phương pháp chuẩn độ Kết nghiên cứu cho thấy, độ ẩm mẫu đạt 13,76 % hiệu suất cao chiết đạt 12,39 % Cao chiết hạt dưa lưới có diện hợp chất Flavonoid, Alkaloid, Saponin, Terpenoid, Tanin Phenol Cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế hình thành hạt nhân, phát triển ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate với giá trị IC50 1,68 mg/mL; 0,79 mg/mL 1,47 mg/mL Cao chiết nồng độ 60 mg/mL, hiệu làm tan tinh thể Calcium oxalate đạt 91,89 % Từ khóa: Calcium oxalate; Dưa lưới; Hạt nhân; Ngưng tụ; Phát triển; Làm tan; Sỏi thận Abstract Effects of Cucumis melo L seed extract on the inhibition of calcium oxalate crystal formation and dissolution in nephrolithiasis under in vitro conditions A study on using Cucumis melo seed extract to inhibit the formation and dissolution of Calcium oxalate (CaC₂O₄) was conducted in vitro The plant samples were extracted from maceration method with 80 % of Ethanol The inhibitory percentage of nucleation, growth and aggregation of Calcium oxalate crystallization was determined by spectrophotometer at 620 nm, 214 nm Efficiencies in the dissolution of the Calcium oxalate crystals of C melo seed extract was determined by titration method The results showed that moisture and the yield of seed extract were 13.76 % and 12.39 % The extract of C melo seed had the presence of bioactive compounds such as Alkaloid, Flavonoid, Saponin, Terpenoid, Tannin and Phenol The extract C melo seed had the ability to inhibit nucleation, growth and aggregation of Calcium oxalate crystallisation and IC50 value of extract was 1.68 mg/mL, 0.79 mg/mL, and 1.47 mg/mL, respectively At 60 mg/mL of extract, C melo seed extract have the ability to dissolution of the Calcium oxalate crystals reach 91,98 % Keywords: Aggregation; Dissolution; Calcium oxalate; Growth; Kidney stone; Nucleation; Cucumis melo Đặt vấn đề Trên giới có khoảng 12 % dân số gặp vấn đề sỏi thận Tinh thể Calcium oxalate thành phần 60 % trường hợp sỏi thận người tồn 02 dạng Calcium oxalate monohydrate (COM) Calcium oxalate dihydrate (COD) Bệnh nhân bị sỏi thận thường đau đớn gặp trường hợp sỏi lớn chúng di chuyển từ bể thận xuống niệu quản, bàng quang, gây tổn thương đường tiết niệu người bệnh Có nhiều phương pháp sử dụng để điều trị sỏi thận khác tùy thuộc vào thành phần, vị trí, kích thước sỏi thận 122 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững yếu tố sức khỏe người bệnh Sỏi có kích thước nhỏ, thể người thải ngồi mà khơng ảnh hưởng đến sức khỏe Ngược lại, sỏi có kích thước lớn làm tắc nghẽn đường tiết niệu gây đau cho bệnh nhân Ngoài ra, biện pháp y khoa có hiệu việc điều trị sỏi Calcium oxlate (CaC₂O₄) có nguy tái phát 50 % nhiều tác dụng phụ tổn thương mạch máu thận xung quanh,… [1] Sử dụng dược liệu điều trị sỏi thận vửa đơn giản, tác dụng phụ mà cịn tiết kiệm chi phí biện pháp nhận quan tâm nghiên cứu nhà khoa học Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 70 % dân số toàn cầu sử dụng dược liệu địa để chữa bệnh liên quan đến sỏi thận Nhiều nghiên cứu đánh giá hiệu ức chế hình thành tinh thể Calcium oxalate gây bệnh sỏi thận dược liệu dựa 03 chế ức chế hình thành, phát triển ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate công bố ý dĩ, sung lâm vồ, thân bùm sụm [2],… Bên cạnh đó, nghiên cứu đánh giá hiệu làm tan tinh thể Calcium oxalate gây bệnh sỏi thận dược liệu thực vỏ lựu, bùm sụm, râu mèo, rau sam cải củ,… [1] Cây dưa lưới (Cucumis melo) loại ăn trái nhận quan tâm người tiêu dùng năm trở lại Trong đó, vỏ hạt dưa lưới sau chế biến nguồn phụ phẩm tiềm cho trình nghiên cứu, cần quan tâm khai thác Để có kết nghiên cứu xác có đánh giá hiệu dược liệu điều trị sỏi thận, bên cạnh việc đánh giá 03 chế ức chế hình thành, phát triển ngưng tụ tinh thể Calcium oxalate, việc nghiên cứu đánh giá khả làm tan tinh thể Calcium oxlate cần thiết làm tiền đề cho nghiên cứu in vivo tiền lâm sàng Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá khả ức chế làm tan tinh thể Calcium oxlate gây bệnh sỏi thận cao chiết Ethanol từ hạt dưa lưới trồng An Giang; góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho trình sản xuất sản phẩm có khả hỗ trợ điều trị bệnh; đồng thời góp phần tận dụng phụ phế phẩm nơng nghiệp góp phần giảm thải nhiễm mơi trường Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu: dưa lưới giống Đế đặc mặt (Hạt giống An Tâm) Địa điểm: Trồng nhà lưới Trung tâm Cơng nghệ sinh học tỉnh An Giang Hóa chất thiết bị: máy đo quang phổ, máy đông khô chân không, Na₂C₂O₄ (Sigma, Mỹ), Tris HCl (Merck, Mỹ), NaCl (Merck, Mỹ), CaCl2 (Merck, Mỹ),… Hóa chất thiết bị cần thiết khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tạo cao chiết từ hạt dưa lưới Giống Đế đặc mặt trồng nhà lưới Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang thu hoạch sau 90 ngày Trái dưa lưới tiến hành tách phần thịt hạt dưa lưới, hạt sấy khô điều kiện 50 0C 72 nghiền thành bột mịn 200 g mẫu bột hạt dưa lưới ngâm dầm với Ethanol 80 %, với tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:10 (w/v), nhiệt độ phòng, 72 để mơi trường tối để tránh q trình oxy hóa Sau đó, hỗn hợp lọc qua giấy lọc Whatman có đường kính 0,45 µm, tiến hành thu dịch lọc bỏ phần cặn Phần dịch lọc sau cô quay chân không để đuổi dung môi đông khô máy đông khô để thu cao chiết hạt dưa lưới bảo quản điều kiện nhiệt độ -20 0C thực nghiên cứu Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 123 2.2.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết hạt dưa lưới Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học theo phương pháp Yadav cộng [3] 2.2.3 Khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới theo phương pháp Saha cộng [4] Phatak cộng [5] Dung dịch Calcium chloride nồng độ mM Natri oxalate nồng độ 50 mM dung dịch đệm gồm Tris 0,05 M NaCl 0,15 M điều kiện pH = 6,5 Phản ứng cho 950 µL CaCl2 trộn với 100 µL cao chiết nồng độ khác mẫu đối chứng (nước cất) Quá trình tạo hạt nhân sỏi CaC₂O₄ bắt đầu hỗn hợp phản ứng với 950 µL Na₂C₂O₄ Lắc hỗn hợp - phút Sự tạo thành tinh thể CaC₂O₄ % Ức chế = (C-S)/C x 100 Trong đó: C: OD mẫu đối chứng; S: OD mẫu có cao chiết Chất chuẩn sử dụng để so sánh chất Natri citrate đánh giá dựa vào IC50 Bảng Định tính hợp chất cao chiết Ethanol hạt dưa lưới Hợp chất Alkaloid (Mayer) Flavonoid Saponin (Foam) Thực nghiệm mL dịch trích + vài giọt TT Mayer mL dịch trích + mL Pb (OAc)4 10 % mL dịch trích + mL H2O→ đun nóng Steroid (Salkowski) mL dịch trích + mL CHCl3 + mL H2SO4 đậm đặc Tannin phenol (Braymer) Terpenoid Hiện tượng Kết tủa màu nâu Xuất màu vàng Xuất bọt Xuất vòng đỏ nâu lớp 0,5 mL dịch trích + 10 mL H2O + - giọt FeCl3 0,1 % Kết tủa xanh dương đen mL dịch trích + mL (CH3CO)2O + - giọt H2SO4 Xuất màu đỏ đậm đậm đặc 2.2.4 Khả ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Khả ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới thực theo phương pháp Chaudhary cộng [6] Phản ứng mL CaCl2 mM mL Na₂C₂O₄ mM vào 1,5 mL dung dịch đệm chứa NaCl (90 mM) Tris HCl (10 mM), điều kiện pH = 7,2 Sau đó, thêm vào hỗn hợp 30 µL tinh thể CaC₂O₄ (1,5 mg/mL) chuẩn bị dung dịch đệm CH3COONa 50 mM (pH = 5,7) Phản ứng CaCl2 Na₂C₂O₄ với tinh thể hạt nhân dẫn tới phân bố CaC₂O₄ bề mặt tinh thể Phản ứng CaCl2 Na₂C₂O₄ 10 phút, thêm 0,5 mL cao chiết thêm vào đo bước sóng λ = 214 nm Đo giá trị OD phút lần vẽ đồ thị tính hệ số góc Thực tương tự với Natri nitrate % Ức chế = (C-S)/C x 100 Trong đó: C: Hệ số góc chất ức chế; S: Hệ số góc chất đối chứng 2.2.5 Hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới thực theo phương pháp Saha cộng [4] Trộn hỗn hợp gồm CaCl2 Na₂C₂O₄ nồng độ 124 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 50 mM, ủ điều kiện nhiệt độ 60 0C nhằm tinh thể cân ổn định làm mát 37 C qua đêm, ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút 10 phút, thu phần cặn, bỏ phần dịch, ta thu tinh thể CaC₂O₄ bảo quản tinh thể nhiệt độ 0C Khả ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ theo Saha cộng [4] Tinh thể CaC₂O₄ hòa tan dung dịch đệm gồm Tris 0,05 M CaCl2 0,15 M chuẩn bị pH = 6,5, nhiệt độ 37 0C nồng độ cuối mg/mL Thêm 500 µL nước cất đo độ hấp thu λ = 620 nm vào khoảng thời gian 30, 60, 90, 180 360 phút Ức chế ngưng tụ = (1-Si/Sc) x 100 Trong đó: Si: Hệ số góc chất ức chế; Sc: Hệ số góc chất đối chứng 2.2.6 Khả làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới phương pháp chuẩn độ Khả làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới phương pháp chuẩn độ, theo phương pháp Saso cộng [7] Chuẩn bị sỏi CaC₂O₄ dạng viên, trộn với 500 µL Na₂C₂O₄ 0,1 M, điều kiện pH = (ở 25 0C) 500 µL CaCl2 0,1 M vào ống Eppendoft (1,5 mL), tinh thể CaC₂O₄ cho phản ứng 30 phút điều kiện nhiệt độ phịng, Sau đó, ống ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút loại bỏ phần dịch, thu phần cặn Kế tiếp, ống rửa mL nước cất, Vortex hỗn hợp ly tâm lần giống mô tả Cuối cùng, loại bỏ phần dịch sấy ống tủ sấy 70 0C 03 cân khối lượng ống tubes lần để tính khối lượng sỏi tinh thể Màng bán thấm vỏ trứng gà nằm phần vỏ Calcium bên phần dung dịch bên Vỏ trứng loại bỏ cách ngâm dung dịch HCl M qua đêm, để loại bỏ Calcium Sau đó, rửa sản phẩm với nước cất cẩn thận đục lỗ nhỏ phần đỉnh vỏ để loại bỏ phần dung dịch bên Rửa với nước cất ngâm dung dịch Ammonia điều kiện ẩm, rửa với nước cất Trữ lạnh 0C pH = - 7,4 Cân 20 mg tinh thể CaC₂O₄ 100 mg cao chiết (hoặc Natri citrate), đặt tất vào màng bán thấm ngâm vào bình tam giác chứa 100 mL dung dịch đệm Tris 0,1 M Một nhóm đối chứng âm gồm 20 mg tinh thể CaC₂O₄ gói màng bán thấm, ủ bình tam giác 37 0C - Sau đó, chuyển tồn dung dịch màng bán thấm vào ống nghiệm, thêm mL dung dịch H2SO4 N chuẩn độ KMnO4 0,01 N màu hồng nhạt không đổi xuất Theo Zarrow [8], mL dung dịch KMnO4 0,01 N tương đương với 0,2 mg Calcium lại dung dịch Phần trăm tan tinh thể CaC₂O₄ tính theo cơng thức tính % tinh thể tan (M1-M2)/M1 x 100% Trong đó: M1: Khối lượng tinh thể ban đầu; M2: Khối lượng tinh thể sau làm tan 2.2.7 Phân tích hàm lượng Phenolic Flavonoid cao chiết hạt dưa lưới Hàm lượng Flavonoid tổng theo Pieme [9]: 0,1 mL Quercetin, thêm vào 0,3 mL nước cất, 0,03 mL NaNO2 % Ủ phút 25 0C, thêm 0,03 mL AlCl3 10 % Ủ thêm phút, sau cho thêm 0,2 mL NaOH mM Thêm nước cất để tổng thể tích mL Đo bước sóng 510 nm Hàm lượng Flavonoid tổng xác định theo công thức: Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 125 C = c x V/m Trong đó: C: Hàm lượng Flavonoid tổng (mg Quercetin/g chiết xuất); c: Giá trị x từ đường chuẩn với Quercetin (mg/mL); V: Thể tích dịch chiết (mL); m: Khối lượng cao chiết có V (g) Hàm lượng Phenolic tổng theo Yadav Agarwala [10]: mL dung dịch Gallic acid vào 2,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 10 % phản ứng phút; thêm tiếp vào mL dung dịch Na2CO3 % Sau 45 phút phản ứng nhiệt độ phịng, độ hấp thụ bước sóng 765 nm Hàm lượng Phenolic tổng tính theo cơng thức: P = a × V/m Trong đó: P: Hàm lượng Phenolic tổng (mg Gallic acid/g cao chiết); a: Giá trị x từ đường chuẩn (mg/mL); V: Thể tích dung dịch cao chiết (mL); m: Khối lượng cao chiết thể tích V (g) 2.3 Phương pháp thống kê Số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Excel 2010 thống kê phần mềm Statgraphics plus 16 Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số Kết thảo luận 3.1 Kết tạo cao chiết hạt dưa lưới Để đánh giá hiệu phương pháp trích cao, người ta thường dựa hiệu suất trích cao Hiệu suất trích cao phản ánh tối ưu việc kết hợp điều kiện khác phương pháp ly trích Quy trình trích cao thực với hạt dưa lưới 3.000 g (tươi), độ ẩm hạt dưa lưới 13,76 % hiệu suất chiết cao đạt 12,39 % (Bảng 2) Bảng Kết chiết cao Ethanol hạt dưa lưới định tính hoạt chất có hoạt tính sinh học cao chiết hạt dưa lưới Chỉ tiêu theo dõi Khối lượng mẫu tươi (g) Độ ẩm (%) Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cao khô (g) Hiệu suất chiết (%) Cao chiết hạt dưa lưới 3.000 13,76 ± 0,22 200 24,78 ± 0,13 12,39 ± 0,09 Chỉ tiêu Alkaloid Flavonoid Saponin Terpenoid Tannin Phenol Steroid Cao chiết + + + + + + Ghi chú: “+”: dương tính; “-” âm tính 3.2 Định tính hợp chất có hoạt tính sinh học cao chiết hạt dưa lưới Cao chiết hạt dưa lưới có diện hợp chất Alkaloid, Terpenoid, Saponin, Flavonoid, Tanin Phenol (Bảng 2) Kết nghiên cứu tương tự Olubunmi cộng [11] tiến hành định tính hợp chất sinh học có hạt dưa lưới 126 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 3.3 Hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Sự hình thành sỏi gồm 03 bước quan trọng hình thành hạt nhân (Nucleation), phát triển (Growth) ngưng tụ (Aggregation) 03 bước tiến hành điều kiện in vitro [12] Do đó, phương pháp phân tích Calcium oxalate (CaC₂O₄) gồm 03 thí nghiệm phân tích: phân tích hạt nhân (Nucleation assay), phân tích phát triển (Growth assay) phân tích ngưng tụ (Aggregation Assay) [13] Bảng Kết ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ (%) in vitro Nồng độ (mg/mL) 0,25 0,50 0,75 10 IC50 (mg/mL) Chất chuẩn Natri citrate 0l k 22,13 ± 0,07 30,16h ± 0,14 37,45g ± 0,23 44,02f ± 0,06 62,11e ± 0,13 72,26d ± 0,21 81,99c ± 0,39 90,15b ± 0,46 98,13a ± 0,49 1,39 Cao chiết hạt dưa lưới 0l k 18,19 ± 0,04 24,56h ± 0,24 33,45g ± 0,16 39,68f ± 0,23 54,64e ± 0,29 66,16d ± 0,31 74,59c ± 0,07 85,29b ± 0,26 82,11a ± 0,06 1,68 Trong cột giá trị theo sau kí tự khơng khác biệt mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Trong phản ứng phân tích hạt nhân (Nucleation assay), phương pháp phân tích thực theo Nirmaladevi cộng [13], Na₂C₂O₄ trộn với cao chiết, nước cất chất đối chứng dương Natri citrate thêm CaCl2 vào sau Phản ứng nhằm để đánh giá khả cao chiết ức chế hình thành hạt nhân Calcium oxalate monohydrate (COM) chuyển hóa COM hình thành thành tinh thể Calcium oxalate dihydrate (COD) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate Natri citrate, phương trình đường chuẩn: y = 22,278x + 19,124; R2 = 0,980 suy giá trị IC50 Natri citrate 1,39 mg/mL (Bảng 3) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate cao chiết hạt dưa lưới, phương trình đường chuẩn: y = 20,47x + 15,57; R2 = 0,9613 suy giá trị IC50 cao chiết 1,68 mg/mL (Bảng 3) Bảng Kết ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ (%) in vitro Nồng độ (mg/mL) 0,25 0,50 0,75 10 IC50 (mg/mL) Chất chuẩn natri citrate 0l k 25,64 ± 0,07 34,59h ± 0,11 42,95g ± 0,26 52,16f ± 0,31 58,14e ± 0,19 63,99d ± 0,06 70,11c ± 0,19 77,80b ± 0,08 85,65a ± 0,17 0,94 Cao chiết hạt dưa lưới 0l k 28,13 ± 0,26 39,65h ± 0,16 47,98g ± 0,32 58,14f ± 0,41 66,13e ± 0,08 75,06d ± 0,27 83,56c ± 0,04 90,12b ± 0,22 96,35a ± 0,15 0,79 Trong cột giá trị theo sau kí tự khơng khác biệt mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 127 3.4 Hiệu ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Theo Agarwal Varma [14], bước phát triển tinh thể (Growth) theo phản ứng: CaCl2 + Na2C2O4­­ -> CaC2O4 + NaCl Bởi phản ứng CaCl2 Na2C2O4­ với mầm tinh thể khiến cho tinh thể CaC₂O₄ bao phủ lên bề mặt tinh thể [13] Đối với phân tích phát triển (Growth assay), phản ứng Calcium chloride Natri oxalate diện tinh thể hạt nhân Calcium oxalate monohydrate dẫn đến độ giảm gốc Oxlate tự độ giảm phát bước sóng 214 nm [13] Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ Natri citrate, phương trình đường chuẩn: y = 35,168x + 16,855; R2 = 0,9997 và suy giá giá trị IC50 Natri citrate 0,94 mg/mL (Bảng 4) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới, phương trình đường chuẩn: y = 39,344x + 18,885; R2 = 0,9965 suy giá trị IC50 cao chiết 0,79 mg/mL (Bảng 4) 3.5 Hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Bước cuối trình hình thành sỏi thận ngưng tụ (Aggregation), tinh thể Calcium oxalate tụ lại khối nhờ lực liên kết hóa học, tĩnh điện ổn định lại cấu trúc kích thước sỏi [15] Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ natri citrate, phương trình đường chuẩn y = 17,329x + 17,95; R2 = 0,9273 suy giá trị IC50 Natri citrate 1,85 mg/mL (Bảng 5) Tiến hành xây dựng đường biểu diễn hiệu ức ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới, phương trình đường chuẩn: y = 20,861x + 19,363; R2 = 0,9623 suy giá trị IC50 cao chiết 1,47 mg/mL (Bảng 5) Bảng Kết ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ (%) in vitro Nồng độ (mg/mL) 0,25 0,50 0,75 10 IC50 (mg/mL) Chất chuẩn Natri citrate 0l 19,16k ± 0,27 25,64h ± 0,18 32,59g ± 0,09 40,15f ± 0,6 50,19e ± 0,30 57,69d ± 0,16 69,78c ± 0,06 76,29b ± 0,11 84,26a ± 0,21 1,85 Cao chiết hạt dưa lưới 0l 21,26k ± 0,31 29,87h ± 1,01 37,01g ± 0,15 43,59f ± 0,29 59,06e ± 0,17 69,01d ± 0,03 76,05c ± 0,09 86,45b ± 0,10 93,26a ± 0,27 1,47 Trong cột giá trị theo sau kí tự không khác biệt mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn Bảng Hiệu làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Natri citrate Nồng độ (mg/mL) 10 128 Phần trăm làm tan tinh thể Calcium oxalate (%) Natri citrate Hạt dưa lưới 0,0g 0,0g 20,87f ± 0,14 26,88f ± 0,09 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 20 30 40 50 60 37,14e ± 0,25 45,97d ± 0,04 60,59c ± 0,12 75,91b ± 0,18 87,11a ± 0,07 42,24e ± 0,14 56,57d ± 0,02 70,57c ± 0,16 80,35b ± 0,19 91,89a ± 0,23 Trong cột giá trị theo sau kí tự khơng khác biệt mức ý nghĩa % Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn 3.6 Hiệu làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Thí nghiệm làm tan tinh thể CaC₂O₄ Natri citrate cao chiết dược liệu tiến hành mức nồng độ - 60 mg/mL sau 24 Natri citrate đạt giá trị làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao mức nồng độ 60 mg/mL đạt hiệu 87,11 ± 0,07 % thấp nhất, nồng độ Natri citrate 10 mg/mL, hiệu tan tinh thể CaC₂O₄ 20,87 ± 0,14 % (Bảng 3) Cao chiết hạt dưa lưới có khả làm tan tinh thể CaC₂O₄ Cụ thể, mức nồng độ 60 mg/mL, cao chiết đạt giá trị làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao với hiệu 87,11 ± 0,23 % thấp nhất, nồng độ cao chiết 10 mg/mL, hiệu tan tinh thể CaC₂O₄ 26,88 ± 0,09 % (Bảng 3) 3.7 Phân tích hàm lượng Phenolic Flavonoid cao chiết hạt dưa lưới Hàm lượng Phenolic Flavonoid cao chiết hạt dưa lưới tính dựa vào phương trình đường chuẩn Gallic acid Quercetin Hàm lượng Phenolic tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn, y = 0,0049x + 0,0127 với hệ số R2 = 0,9985 Hàm lượng Phenolic tổng cao chiết hạt dưa lưới đạt 101,77 mg Gallic acid/100 g cao chiết Hàm lượng Flavonoid tổng phân tích phương pháp quang phổ đường chuẩn: y = 0,0054x + 0,0185 với hệ số R2 = 0,9992 Hàm lượng Flavonoid tổng cao chiết hạt dưa lưới đạt 76,83 mg Quercetin/100g cao chiết Thảo luận chung Trong q trình tạo cao chiết, dung mơi Ethanol 80 % sử dụng, nguyên nhân sử dụng nước làm loại dung môi để ly trích mẫu trích nhiễm nhiều tạp chất Acid hữu cơ, đường Protein tan nước ảnh hưởng tới q trình định tính hay định lượng hợp chất có hoạt tính sinh học Ngồi ra, sử dụng cồn tuyệt đối giảm hiệu suất chiết cao Ethanol khó thấm vào mẫu Vì vậy, sử dụng Ethanol 80 % làm dung môi tạo mơi trường tối ưu cho việc ly trích, tăng tiếp xúc mẫu dung mơi, tăng hiệu suất trích ly bảo quản mẫu khỏi vi sinh vật [16] Theo Saranya cộng [17], hợp chất Saponin, Flavonoid Terpenoids có khả ức chế hình thành làm tan tinh thể Calcium oxalate Saponin có đặc tính chống kết tinh cách ngăn cản trình Mucoprotein, chất thúc đẩy trình kết tinh [18] Flavonoid ức chế kết tinh Canxi oxalate nước tiểu người mơ hình động vật lắng đọng tinh thể Các hợp chất muối Citrate chất ức chế trình hình thành sỏi Calcium oxalate Calcium phosphate Chúng tạo thành phức chất với ion Calcium nên làm giảm nồng độ tinh thể Calcium oxalate Ngoài ra, Citrate tăng hiệu ức chế ngưng tụ kết tinh sỏi cách tăng hoạt tính Urine macromolecule THP giảm biểu Urinary osteopotin, thành phần quan trọng hệ thống Protein liên quan tới hình thành Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 129 sỏi tiết niệu Natri citrate hay Kali citrate giúp tăng độ hòa tan Acid uric, ngăn ngừa kết tủa muối Calcium oxalate [19] Vì vậy, Natri Citrate chất chuẩn cho thí nghiệm ức chế q trình hình thành làm tan tinh thể CaC₂O₄ Hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới chất chuẩn Natri citrate đánh giá qua giá trị IC50 Giá trị IC50 cao chiết (IC50 = 1,68 mg/mL) cao IC50 Natri citrate (IC50 = 1,39 mg/mL) Nguyên nhân cao chiết hạt dưa lưới có chứa hợp chất (Flavonoid, Saponin Terpenoid) có khả kết hợp với ion Ca2+ tạo thành muối tan làm giảm mật độ tinh thể chậm so với chất chuẩn Natri citrate [19] Kết nghiên cứu thấp Nirmaladevi cộng [13] cho rằng, dịch trích hoa H rosa-sinensis Linn có khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ đạt khoảng 30 % nồng độ 1.400 µg/mL Agarwal cộng [20] khả ức chế hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao đạt 60,06 ± 0,19 % cao chiết A aspera L nồng độ 1.000 µg/mL, 49,93 ± 0,07 % cao chiết B pinnatum Lam, nồng độ 1.000 µg/mL Trần Đức Tài [1], cao chiết bùm sụm hiệu ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ với giá trị IC50 = 1,76 mg/mL Chất chuẩn Natri citrate có IC50 = 0,94 mg/mL có hiệu ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ cao IC50 cao chiết IC50 = 0,79 mg/mL nên cao chiết có khả ức chế mạnh q trình phát triển tinh thể CaC₂O₄ có khả hình thành hợp chất tan với ion Calcium ion Oxalate làm giảm khả hình thành sỏi [19] Cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế phát triển sỏi CaC₂O₄ cách bao phủ bên hạt tinh thể nên ngăn cản khả kết hợp chúng, hợp chất thiên nhiên tương tác ngăn cản kết hợp ion Calcium ion Oxalate, ngăn ngừa phát triển sỏi [21] Khi tăng hiệu ức chế, hiệu ức chế giảm cao chiết gia tăng hình thành tinh thể COD lên giảm hình thành Calcium oxalate monohydrate (COM), tinh thể Calcium oxalate dihydrate (COD) khơng có lực lớn nên dễ dàng loại thải ngoài, giảm nguy sỏi thận nên cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế phát triển Kết thấp Nirmaladevi cộng [13], cao chiết nước H rosa-sinensis Linn đạt hiệu ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ 35 % mức nồng độ 1.400 µg/mL Kalpana cộng [22], cao chiết Ethanol thân B cultivar Monthan đạt hiệu 70 % ức chế phát triển hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ nồng độ 1.600 µg/mL Trần Đức Tài [1], cao chiết Bùm sụm ức chế phát triển tinh thể CaC₂O₄ với IC50 = 1,5 mg/mL Chất chuẩn Natri citrate có hiệu thấp so sánh hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ với cao chiết hạt dưa lưới Natri citrate có IC50 = 1,85 mg/mL, cao IC50 cao chiết IC50 = 1,47 mg/mL Cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế mạnh giai đoạn ngưng tụ hợp chất thiên nhiên cao chiết bao phủ bên ngồi tinh thể khiến chúng khơng thể kết tụ lại với hạt dưa lưới có chứa hợp chất Saponin, Terpenoid chất có khả ức chế hình thành sỏi cách tương tác ức chế với Mucoprotein, nguyên nhân gây bão hòa tinh thể Calcium oxalate, khiến chúng ngưng tụ tạo nên sỏi, nên hiệu ức chế cao chiết tăng lên nghiên cứu động vật Tuy nhiên, tăng mức nồng độ cao chiết, hiệu ức chế giảm cao chiết gia tăng hình thành tinh thể COD lên nhiều lần, giảm hình thành COM, tinh thể COD khơng có lực lớn nên dễ dàng loại thải ngồi, khơng giảm q bão hịa tinh thể CaC₂O₄ thể, giảm nguy sỏi thận nên cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế ngưng tụ [24] Kết nghiên cứu cao Vyawahare cộng [24], cao chiết M charantia đạt hiệu ức chế ngưng tụ sỏi CaC₂O₄ 30 %, nồng độ 500 µg/mL Nghiên cứu Agarwal cộng [20], 130 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững P niruri L hiệu ức chế ngưng tụ sỏi CaC₂O₄ đạt mức 58,62 % ± 0,02 % Trần Đức Tài [1], cao chiết bùm sụm cho hiệu ức chế ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ với IC50 = 0,8 mg/mL Trong nghiên cứu, hiệu làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới (91,89 %; nồng độ 60 mg/mL) cao chất chuẩn Natri citrate (87,11 %; nồng độ 60 mg/mL) Cao chiết hạt dưa lưới có khả hòa tan tinh thể CaC₂O₄ hạt dưa lưới chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Phenolic, Flavonoid, Tanin,… Đồng thời, hạt dưa lưới có hiệu ức chế trình hình thành tinh thể CaC₂O₄ gây sỏi thận điều kiện phịng thí nghiệm cho hiệu ức chế 03 giai đoạn gồm: ức chế hạt nhân, phát triển ngưng tụ, dựa vào thí nghiệm Giá trị IC50 cao chiết hạt dưa lưới, trình hình thành tinh thể CaC₂O₄ đạt 0,76 mg/mL; 0,75 mg/mL 0,99 mg/mL Đồng thời, hiệu làm tan diện hợp chất phân cực cao chiết hạt dưa lưới (Polyphenol, Flavonoid Tannin) Hàm lượng Phenolic Flavonoid tổng cao chiết hạt dưa lưới đạt hàm lượng 101,77 mg Gallic acid/100g cao chiết 76,83 mg Quercetin/100 g cao chiết Các hợp chất hoạt động thơng qua khả hình thành dạng hóa học hịa tan làm giảm nguy ngưng tụ cách hấp phụ bề mặt tinh thể nhiều điện tích anion chúng ức chế phát triển ngưng tụ tinh thể Ngoài ra, cố định chúng tinh thể dẫn đến thay đổi tượng lực hút điện nguyên tử nằm bề mặt tinh thể ion có dung dịch Kết hiệu làm tan tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới cao Byahatti cộng [25] cao chiết Butanol Bergenia ciliata đạt hiệu làm tan 26,88 % Monika cộng [26], hiệu làm tan dịch trích nước rễ Ceropegia bulbosa làm tan 20 % Ngoài ra, Saso cộng [7], với khả làm tan EDTA nồng độ 0,25 M đạt mức làm tan 25 % tinh thể CaC₂O₄ Theo Zhong cộng [27], đánh giá hàm lượng Phenol Flavonoid phân lập từ cao chiết Ethanol Orthosiphon stamineus Polysaccharid phân lập từ cao chiết nước việc hòa tan tinh thể Canxi oxalate mơ hình in vivo Kết cho thấy, Phenol, Flavonoid Polysaccharid từ chiết xuất O stamineus có hiệu việc hòa tan tinh thể CaC₂O₄ Polysaccharid ức chế đáng kể hình thành tích tụ tinh thể CaC₂O₄ Trong nghiên cứu Patel cộng [28], hiệu hòa tan sỏi CaC₂O₄ sỏi Calcium phosphate cao chiết Piper nigrum Kết quả, chất cao chiết từ dung mơi nước cồn có tác dụng cao so với dung môi Ethyl acetate Ether dầu mỏ việc ngăn ngừa hình thành, kết tinh tích tụ sỏi CaC₂O₄ sỏi Calcium phosphate Các nhà nghiên cứu cho rằng, hiệu ứng diện Slkaloid chiết xuất Ethanol nước Kết luận Cao chiết hạt dưa lưới có khả ức chế hình thành, phát triển ngưng tụ tinh thể CaC₂O₄ in vitro với giá trị IC50 1,68 mg/mL; 0,79 mg/mL 1,47 mg/mL Cao chiết hạt dưa lưới có hiệu làm tan tinh thể CaC₂O₄ in vitro với hiệu 91,89 % nồng độ 60 mg/mL Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu cao chiết điều kiện in vivo phân tách hợp chất có khả ức chế tinh thể CaC₂O₄ từ cao chiết hạt dưa lưới Lời cảm ơn: Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Trường Đại học Trà Vinh hỗ trợ tạo điều kiện để nhóm thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Đức Tài (2016) Ảnh hưởng dịch trích thân bùm sụm (Carmona microphylla L.) lên ức chế hình thành tinh thể Calcium oxalate gây bệnh sỏi thận điều kiện in vitro Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Cần Thơ Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 131 [2] Unnati, A., B Roshni, U Siddhi, U Umesh (2013) Anti-urolithiatic activity of Dolichos biflorus seeds. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(2): 209 - 213 [3] Yadav, M., Chatterji, S., Gupta, S.K and Watal, G (2014) Preliminary phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine International of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(5): 539 - 542 [4] Saha, S., & Ramtej, J V (2013) Inhibition of calcium oxalate crystallisation in vitro by an extract of Bergenia ciliata Arab Journal of Urology, 11(2): 187 - 192 [5] Phatak, R.S., & Hendre A.S (2015) In-vitro antiurolithiatic activity of Kalanchoe pinnata extract. International Journal of Pharma and PhytoResearch, 7: 275 - 279 [6] Chaudhary, A., Singla, S K., & Tandon, C (2010) In vitro evaluation of Terminalia arjuna on calcium phosphate and calcium oxalate crystallization Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 72(3): 340 - 348 [7] Saso, L., G Valentini, M G Leone, E Grippa and B Silvestrini (1999) Development of an in vitro assay for the screening of substances capable of dissolving Calcium oxalate crystals.  Urologia internationalis, 61(4): 210 - 214 [8] Zarrow, M.X (2012) Experimental endocrinology: a sourcebook of basic techniques Elsevier pp.387 - 389 [9] Pieme, C A., Kumar, S.G., Dongmo, M.S., Moukette, B.M., Ngogang, J.Y and Saxena, A.K (2014) Antiproliferative activity and induction of apoptosis by Annona muricata (Annonaceae) extract on human cancer cells BMC complementary and alternative medicine, 14(1): - 10 [10] Yadav, R.N.S and Agarwala, M (2011) Phytochemical Analysis of Some Medicinal Plants Journal of Phytology, 3: 10 - 14 [11] Olubunmi, I.P., Olajumoke, A.A., Bamidele, J A & Omolara O.F (2019) Phytochemical Composition and in vitro Antioxidant Activity of Golden Melon (Cucumis melo L.) Seeds for Functional Food Application International Journal of Biochemistry Research & Review 25(2): - 13 [12] Kalpana, S., T.S Rai & R Niramaladevi (2014) Effect of Tridax procumbens extract on calcium oxalate crystallization under in vitro conditions Advances in Applied Science Research, 5(3): 411 - 416 [13] Nirmaladevi, R., D Kavitha, & Padma P R (2012) Evaluation of antilithiatic potential of Hibiscus rosa-sinensis Linn, in vitro. Journal of Pharmacy Research, 5(8): 4353 - 4356 [14] Agarwal, K., and R Varma (2014) Ocimum gratissimum L.: A medicinal plant with promising antiurolithiatic activity. Int J Pharm Sci Drug Res, 6: 78 - 81 [15] Yu, H., R Sheikholeslami and W.O.S Doherty (2005) Calcium oxalate crystallization in silica and sugar solutions-characterization of crystal phases and habits. Powder technology, 160(1): - [16] Bandar, H., A Hijazi, H Rammal, A Hachem, A., Z Saad & Badran B (2013) Techniques for the extraction of bioactive compounds from Lebanese Urtica Dioica. American Journal of Phytomedicine and Clinical Therapeutics, 1(6): 507 - 513 [17] Saranya, R., and Geetha, N (2014) Inhibition of calcium oxalate (caox) crystallization in vitro by the extract of beet root (Beta Vulgais L.) International J of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(2): 361 - 365 [18] Joshi V, Parekh B, Joshi M, Vaidya A (2005) Herbal extracts of Tribulus terrestris and Bergenia ligulata inhibit growth of calcium oxalate monohydrate crystals in vitro Journal of Crystal Growth, 275(1):e1403 - e1408 [19] Gupta, M., Bhayana, S., & Sikka K (2011) Role of urinary inhibitors and promoters in calcium oxalate crystallisation Inter Jour of Res in Phar and Chem, 1(4): 793 - 798 132 Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững [20] Agarwal, K., & Varma R (2015) In-vitro Calcium oxalate crystallization inhibition by Achyranthes aspera L and Bryophyllum pinnatum Lam. British Journal of Pharmaceutical Research, 5(2): 146 - 153 [21] De Cógáin, M R., Lee, H J., & Lieske J C (2015) Aqueous extract of Costus arabicus inhibits calcium oxalate crystal growth and adhesion to renal epithelial cells. Urolithiasis, 43(2): 119 - 124 [22] Kalpana, S., R Nirmaladevi, Rai, T S & Karthika P (2013) Inhibition of Calcium oxalate crystallization in vitro by extract of Banana cultivar monthan.  International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(4): 649 - 653 [23] Atmani, F., & Khan S R (2000) Effects of an extract from Herniaria hirsuta on calcium oxalate crystallization in vitro. Bju International, 85(6): 621 - 625 [24] Vyawahare, J N., Shelke, P A., & Baheti D G (2014) Inhibition of Calcium Oxalate Crystallization in Vitro by Extract of Momordica Charantia Linn International Journal of Pharmaceutical And Chemical Sciences, 3(2), 448 - 452 [25] Byahatti, V V., K V Pai and M G D’Souza (2010) Effect of Phenolic Compounds from Bergenia ciliata (Haw.) Sternb leaves on Experimental kidney stones. Ancient science of life, 30(1): 14 - 20 [26] Monika, J., B Anil, B Aakanksha and P Priyanka, P (2012) Isolation, characterization and in vitro antiurolithiatic activity of cerpegin alkaloid from Ceropegia bulbosa var Lushii root. International Journal of Drug Development and Research, 4(4):154 - 160 [27] Zhong Y S, Yu C H, Ying H Z, Wang Z Y, Cai H F (2012) Prophylactic effects of Orthosiphon stamineus Benth Extracts on experimental induction of calcium oxalate nephrolithiasis in rats J Ethnopharmacol, 14(3): 761 - 767 [28] Patel P K, Patel M A, Vyas B A, Gandhi T R (2010) Antiurolithiatic activity of saponin rich fraction from the fruits of Solanum xanthocarpum Schrad & Wendl (Solanaceae) against ethylene glycol induced urolithiasis in rats J Ethnopharmacol, 144(1): 160 - 170 Ngày chấp nhận đăng: 10/11/2021 Người phản biện: TS Trịnh Thị Thủy Nghiên cứu chuyển giao, ứng dụng khoa học công nghệ sử dụng hợp lý tài nguyên, bảo vệ môi trường phát triển bền vững 133 ... sinh học Phenolic, Flavonoid, Tanin,… Đồng thời, hạt dưa lưới có hiệu ức chế trình hình thành tinh thể CaC₂O₄ gây sỏi thận điều kiện phịng thí nghiệm cho hiệu ức chế 03 giai đoạn gồm: ức chế hạt. .. khả ức chế hình thành làm tan tinh thể Calcium oxalate Saponin có đặc tính chống kết tinh cách ngăn cản trình Mucoprotein, chất thúc đẩy trình kết tinh [18] Flavonoid ức chế kết tinh Canxi oxalate. .. sinh học cao chiết hạt dưa lưới Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học theo phương pháp Yadav cộng [3] 2.2.3 Khả ức chế hình thành hạt nhân tinh thể CaC₂O₄ cao chiết hạt dưa lưới Khả ức chế hình