Khéo tay hay làm Khéo tay hay làm Khéo tay hay làmkl lu quoc dinh

Luận văn tốt nghiệp đại học MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc lồi bị cạp .4 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Phân bố môi trƣờng sống .4 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.5 Sinh sản phát triển 1.2 Bò cạp Việt Nam 1.2.1 Thành phần loài phân bố [19] 1.2.2 Loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 1.3 Nọc độc bò cạp 1.3.1 Thành phần tác động nọc bò cạp .9 1.3.2 Cấu trúc toxin từ nọc độc bò cạp 11 1.3.4 Những ứng dụng nọc bò cạp 11 1.3.5 Các nghiên cứu nọc bò cạp Việt Nam 12 1.4 Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp phân tích nọc bò cạp 13 1.4.1 Phƣơng pháp sắc ký lọc gel 13 1.4.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 16 1.4.3 Phƣơng pháp điện di 18 1.4.4 Độc tính cấp thuốc 21 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 24 2.1 Q trình ni bị cạp 24 2.2 Thu nọc bảo quản nọc 24 2.2.1Dụng cụ 24 2.2.2 Thu nọc bảo quản 24 2.3 Phân tích thành phần nọc thô sắc ký lọc gel 25 2.3.1 Dụng cụ 25 2.3.2 Hóa chất .25 2.3.3 Các bƣớc thực 25 2.4 Xác định khối lƣợng phân tử phân đoạn sau sắc ký lọc gel phƣơng pháp điện di gel poly acrylamide 27 2.4.1 Dụng cụ 27 2.4.2 Hóa chất .27 2.4.3 Các bƣớc thực 28 2.5 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc sau sắc ký lọc gel lên động vật 30 2.5.1 Hóa chất dụng cụ 30 2.5.2 Động vật thử nghiệm 30 2.5.3 Tiến hành thí nghiệm 30 2.6 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên động vật 31 2.6.1 Hóa chất dụng cụ 31 2.6.2 Động vật thử nghiệm 31 2.6.3 Tiến hành thử nghiệm 32 Luận văn tốt nghiệp đại học 2.7 Phân tích thành phần phân đoạn độc lên động vật phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 33 2.7.1 Hóa chất .33 2.7.2 Dụng cụ 33 2.7.3 Các bƣớc tiến hành 33 2.8 Khảo sát độc tính phân đoạn nọc sau sắc ký lỏng cao áp lên động vật 34 2.8.1 Hóa chất dụng cụ 34 2.8.2 Động vật thử nghiệm 35 2.8.3 Tiến hành thí nghiệm 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 Kết việc ni, thu nọc bị cạp Heterometrus laoticus 36 3.1.1 Kết ni bị cạp .36 3.1.2 Kết thu nọc 37 3.2 Kết chạy sắc ký lọc gel 39 3.3 Khảo sát khối lƣợng phân tử phân đoạn nọc sau sắc ký lọc gel phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide 40 3.4 Kết khảo sát độc tính phân đoạn nọc sau sắc ký lọc gel lên động vật 42 3.5 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên động vật theo đƣờng tiêm tĩnh mạch 43 3.6 Phân tích thành phần phân đoạn độc lên động vật phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 45 3.7 Khảo sát độc tính phân đoạn sau sắc ký lỏng cao áp 46 3.8 Phân tích thành phần peak 4.6 phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 49 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Luận văn tốt nghiệp đại học LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay, với việc tổng hợp hóa dƣợc làm thuốc, xu hƣớng sâu nghiên cứu xác minh kinh nghiệm dân gian y học cổ truyền việc tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học làm nguồn dƣợc liệu ngày đƣợc quan tâm rộng rãi Khoảng 30 năm trở lại đây, nọc độc bò cạp thu hút quan tâm nghiên cứu nhà khoa học thành phần có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa bệnh Thành phần chủ yếu nọc bò cạp neurotoxin đƣợc chứng minh có tác dụng dƣợc lý hỗ trợ điều trị bệnh thần kinh nhƣ Pakinson, Ashmer…[2,9] Tiếp tục nghiên cứu nọc độc bò cạp nhằm mục đích tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học làm nguồn dƣợc liệu trị bệnh, chúng tơi thực đề tài: “Khảo sát tính chất thành phần độc tố nọc bò cạp Heterometrus laoticus” với mục tiêu:  Khảo sát thành phần protein nọc bò cạp phƣơng pháp lọc gel điện di  Xác định phân đoạn có độc tính nọc bị cạp  Phân tích thành phần độc tố nọc bò cạp phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp  Xác định độc tính cấp phân đoạn lên chuột Luận văn tốt nghiệp đại học CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc lồi bị cạp Ngày nay, bị cạp khơng thu hút quan tâm nghiên cứu nhà khoa học đặc điểm hình thái học, tính đa dạng loài, phƣơng diện sinh thái, nguồn gốc cổ xƣa mà cịn thành phần có hoạt tính sinh học nọc độc chúng [10,17] 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Đƣợc mệnh danh “hóa thạch sống”, bò cạp đƣợc xem động vật cổ xƣa trái đất, xuất phát từ tổ tiên lƣỡng cƣ sống kỷ Silua cách 400 triệu năm Những mẫu hóa thạch lồi bị cạp đƣợc tìm thấy lớp trầm tích có nguồn gốc đại dƣơng, trầm tích than đá từ kỷ Cacbon hổ phách Xu hƣớng tiến hóa thích nghi thơng minh cho phép chúng tồn hình thái hầu nhƣ khơng thay đổi hàng trăm triệu năm qua [1] Theo trình tự phân loại động vật, bò cạp động vật đƣợc xếp vào: - Ngành Chân khớp (Arthropoda) - Lớp Hình nhện (Arachnida) - Bộ Bị cạp (Scorpiones) Chúng có có hàng gần gũi với loài nhện, ve bét rệp [25] Theo The Scorpion files, có khoảng 1952 lồi đƣợc ghi nhận thuộc 191 chi, phân bố 14 họ Trong đó, họ lớn họ Buthidae có 89 chi gồm 941 lồi, kế họ Scorpionidae có 17 chi gồm 264 lồi, họ Vaejovidae có 17 chi gồm 173 lồi, họ Chactidae có 12 chi 172 lồi, họ Bothriuridae có 15 chi 139 lồi, họ Hemiscorpiidae có 12 chi 89 lồi…[6] 1.1.2 Phân bố mơi trƣờng sống Bị cạp đƣợc tìm thấy tất châu lục, trừ châu Nam cực nhƣng phong phú đa dạng khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Mơi trƣờng sống lồi bị cạp đa dạng từ khu vực sa mạc, bán sa mạc đến vùng thảo nguyên, vùng rừng mƣa nhiệt đới, vùng rừng kim…[1] Luận văn tốt nghiệp đại học Bị cạp cịn đƣợc tìm thấy sƣờn núi cao (ở độ cao 5500 m) dãy Alps, Andes hay Hymalaya, hang động sâu (gần 1000m dƣới lịng đất) Mơi trƣờng sống ƣa thích bò cạp tự nhiên hang hốc, khe đá, không gian dƣới vỏ hay lớp rụng [1] Họ Buthidae Họ Scorpionidae Loài Androctonus australis Loài Heterometrus spinifer Họ Vaejovidae Họ Chactidae Loài Smerinigurus vachoni Loài Uroctonus mordax Họ Bothriuridae Họ Hemiscorpiidae Loài Bothriurus keyserlingi Loài Hadogenes troglodytes Hình 1.1: Một số lồi bị cạp đại diện họ khác Luận văn tốt nghiệp đại học 1.1.3 Đặc điểm hình thái Cơ thể bị cạp gồm hai phần phần đầu ngực gọi prosoma phần bụng gọi opisthosoma Phần bụng đƣợc chia thành hai phần, phần trƣớc bụng gọi mesosoma phần đuôi gọi metasoma [1] Phần đầu ngực bao phủ mai giống khiên, mai có cặp mắt trung tâm, cịn cặp mắt phụ rìa góc phía trƣớc mai Nằm phía trƣớc mai đơi kìm nhỏ gọi kìm miệng dùng để xé có mồi ăn Ở hai bên phần đầu đôi kìm to gọi kìm kẹp có tác dụng chụp giữ mồi tự vệ Xung quanh đơi kìm kẹp đƣợc che phủ lông cứng cảm giác Mặt phía dƣới nơi mọc bốn cặp chân có quan giống nhƣ lƣợc gọi pectin, chúng có vai trị nhƣ cảm biến để cảm nhận bề mặt tiếp xúc chấn động mặt đất [1] Phần bụng bao gồm mƣời hai phân đoạn, phần trƣớc bụng gồm bảy phân đoạn, phần đuôi gồm năm phân đoạn kết thúc quan telson [1] Phần bụng trƣớc đƣợc coi thể chính, nơi chứa phổi, quan tiêu hóa, quan sinh dục bị cạp Telson túi tích trữ nọc độc từ tuyến nọc bò cạp, tận quan ngòi đốt cong nhọn dùng để truyền nọc độc [1] 1.1.4 Đời sống tập tính Bị cạp loài động vật sống đêm, ban ngày chúng thƣờng ẩn nấp hang hốc, khe đá Tuổi thọ trung bình lồi bị cạp – năm nhƣng có số lồi sống từ 25 – 30 năm nhƣ lồi Hadrurus arizonensis [10] Bị cạp lồi hội, chúng khơng trực tiếp săn mồi mà nằm phục kích, đợi có hội bắt đƣợc mồi Con mồi đƣợc bò cạp phát với quan cảm giác đặc biệt chúng Thức ăn bị cạp loại trùng, nhện, rết hay đồng loại Một số loài lớn ăn lồi động vật có xƣơng sống nhƣ thằn lằn, rắn nhỏ chuột [1] Luận văn tốt nghiệp đại học 1.1.5 Sinh sản phát triển Khác với động vật chân đốt khác, bị cạp có nét khác biệt q trình phát triển sinh sản chúng, ngƣời ta thấy chúng có nét tƣơng đồng đời sống với lồi động vật có xƣơng sống Điểm khác biệt chỗ, bị cạp sinh mà khơng đẻ trứng nhƣ họ hàng khác chúng, chúng có hình thức sinh sản hữu tính, nhƣng có lồi đƣợc ghi nhận có hình thức sinh sản đơn tính [10,12] Hoạt động sinh sản bò cạp đặc biệt, hành động tình dục chúng việc đực dùng kìm kẹp kẹp lấy kìm kẹp thực vũ điệu gọi “promenade deux” trƣớc bào tinh (spermatophore) đƣợc phóng từ đực lên vị trí đất thích hợp đặt bào tinh Tiếp theo đó, đực dẫn đến nơi đặt bào tinh trƣớc hƣớng dẫn đặt lỗ sinh dục lên bào tinh Sau thời kì mang thai kéo dài từ – 85 tuần tùy lồi, bị cạp sinh từ nắp sinh dục [12] Mỗi lứa đẻ số lƣợng bị cạp khác tùy theo lồi nhƣng dao động từ – đến 105 – 110 Các bò cạp sau sinh đƣợc mẹ chúng hƣớng dẫn leo lƣng, chúng lƣng mẹ kỳ lột xác Thơng thƣờng bị cạp phải trải qua từ – lần lột xác để trƣởng thành hoàn tồn [12] Kích thƣớc bị cạp trƣởng thành dao dộng khoảng từ 10 – 21cm tùy loài, lồi bị cạp châu Phi Hadogenes troglodytes đạt kích thƣớc 20cm [1,10] Ở số lồi bị cạp, việc phân biệt đực chúng trải qua kỳ lột xác cuối đặc điểm lƣỡng hình tình dục đƣợc nhìn thấy Ở số lồi khác phân biệt nhận sớm [12] 1.2 Bị cạp Việt Nam 1.2.1 Thành phần lồi phân bố [19] Bò cạp Việt Nam phân bố rộng rãi gồm họ:  Họ Buthidae gồm loài: Luận văn tốt nghiệp đại học  Loài Lychas mucronatus Fabricius, 1708 Phát tỉnh miền Trung miền Nam, phát triển mạnh Đồng Phú (Bình Phƣớc)  Lồi Isometrus basilicus Karch, 1879 Phát Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định, Khánh Hịa (Trƣờng Sa), Bình Phƣớc (Đồng Phú)  Lồi Isometrus sp Phát Nghệ An (Vinh)  Họ Scorpionidae gồm loài:  Loài Hetrometrus spinifer spinifer (Hemprich et Ehrenberg), 1828 Phát Bình Phƣớc (Bù Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú)  Loài Heterometrus petersii petersii (Thorell), 1876 Phát Thành phố Hồ Chí Minh, Bình Thuận, Khánh Hòa, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh  Loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 Phát Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hịa), An Giang  Loài Javanimetrus cyaneus cyaneus (Koch), 1836 Phát Thừa Thiên (Huế), Quảng Trị  Loài Heterometrus sp Phát Sơn La (Mộc Châu), Hà Tây (Ba Vì) 1.2.2 Lồi Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 Đối tƣợng nghiên cứu luận văn nọc bò cạp đƣợc lấy từ bò cạp An Giang, đƣợc xác định loài Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 Loài Heterometrus laoticus đƣợc xác định lần Couzijn vào năm 1981 Thái Lan [11] Chúng phân bố chủ yếu nƣớc nhƣ Lào, Thái Lan, Campuchia Việt Nam Con trƣởng thành đạt chiều dài từ 90 – 125 mm, màu sắc màu đen đồng nhất, dƣới ánh sáng ngồi trời có ánh xanh sẫm Luận văn tốt nghiệp đại học Sự phân biệt giới tính lồi khó xác định kích thƣớc thể đặc điểm bên đực giống [11] Hình 1.2 Lồi Heterometrus laoticus Couzijn, 1981 1.3 Nọc độc bò cạp 1.3.1 Thành phần tác động nọc bò cạp Nọc bò cạp hỗn hợp phức tạp bao gồm protein bản, peptide thành phần thứ yếu khác hợp thành nhƣ serotonin, histamine, chất ức chế protease, mucopolysaccharide, hyaluronidase, photpholipase, chất độc tán huyết…[2,7] Đặc biệt nọc độc bò cạp giàu protein khối lƣợng phân tử thấp chất độc thần kinh (neurotoxin) có tƣơng tác cụ thể lên kênh ion khác màng tế bào dễ bị kích thích tế bào khơng bị kích thích [3] Chúng ngăn cản hoạt động bình thƣờng kênh ion dẫn đến tác hại lên sinh vật ngƣời Bên cạnh tác động lên thể ngƣời, toxin từ nọc bị cạp có tác động lên lồi sinh vật khác.Trong nọc độc bị cạp có toxin khác gây tác động khác lên động vật có vú, trùng giáp xác [8] Các toxin từ nọc bị cạp đƣợc chia thành nhóm khác dựa tƣơng tác đặc hiệu chúng lên loại kênh ion khác bao gồm : kênh Na+, kênh K+, kênh Ca2+ kênh Cl- [8] Có khoảng 100.000 peptide khác đƣợc đốn có mặt nọc độc tất lồi bị cạp Tuy nhiên có 0,02% Luận văn tốt nghiệp đại học số đƣợc biết tới liệt kê báo cáo Trong bao gồm 121 loại tác động lên kênh Na+, 74 loại tác động lên kênh K+, loại lên kênh Cl- loại lên kênh Ca2+ [8] Tác động toxin đƣợc thể việc chúng ngăn cản dòng ion di chuyển qua kênh ion làm thay đổi chế đóng – mở kênh ion Chẳng hạn nhƣ neurotoxin tác động lên kênh điện Natri đƣợc xem nhƣ kênh ion có vai trò quan trọng việc dẫn truyền xung thần kinh sợi trục (axon) tế bào thần kinh Những neurotoxin làm suy giảm trì hỗn khử cực (kéo dài q trình đóng kênh này) dẫn tới việc kéo dài giai đoạn tái phân cực màng sợi trục Kết ngăn cản truyền động xung thần kinh cách bình thƣờng [2] Trong neurotoxin tác động lên kênh K+ lại tƣơng tác phía mặt ngoại bào kênh gây nên cản trở dòng ion di chuyển qua lại Còn hai loại toxin tác động lên kênh Ca2+ làm thay đổi liên kết ryanodine với kênh Ca+, loại làm tăng liên kết ryanodine với kênh Ca2+, loại lại ức chế liên kết [8] Dựa vào kết nghiên cứu tác động toxin nọc bò cạp, ngƣời ta nhận thấy phù hợp với tác động lâm sàng mà nọc bò cạp gây nên thể ngƣời bao gồm tác động lên hệ thần kinh tự chủ, co cơ, trụy tim mạch suy hô hấp Việc kéo dài hoạt động tế bào thần kinh gây kích thích mức, đặc biệt hệ thần kinh tự chủ từ kéo theo loạt hệ lụy lên tim, phổi [7] Ngoài toxin tác động lên kênh ion, thành phần khác nọc bò cạp gây tác động khác nhau, chẳng hạn nhƣ thành phần hyaluronidase nhóm enzyme xúc tác cho phân hủy acid hyaluronic, polysaccharide đƣợc tìm thấy ma trận ngồi bào mô liên kết mềm Bản thân chúng không gây độc nhƣng chúng lại tác nhân tạo điều kiện cho toxin xâm nhập vào mô Từ chúng làm tăng khả hấp thu khuếch tán nọc độc qua mô hạn chế hiệu chất kháng nọc trình điều trị vết chích bị cạp Một thành phần khác serotonin có tác dụng gây đau cục gây co thắt tử cung [2,7] 10 Luận văn tốt nghiệp đại học  Phân đoạn 2: chứa protein nằm vùng có khối lƣợng phân tử từ 11 đến 30 kDa vùng từ 40 đến 60 kDa  Phân đoạn 3: chứa protein có khối lƣợng phân tử nằm vùng từ 13 đến 17 kDa vùng từ đến 11 kDa  Phân đoạn 4: chứa protein có khối lƣợng phân tử nằm vùng từ đến 10 kDa khoảng 65 kDa  Phân đoạn 5: chứa protein có khối lƣợng phân tử khoảng kDa kDa kDa M1 pđ pđ pđ pđ pđ 170 130 100 70 55 40 35 25 15 10 Hình 3.2 Kết điện di phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn  Nhận xét: Kết chạy điện di cho thấy, phân đoạn nọc có khối lƣợng phân tử khác theo cấp độ từ cao đến thấp, nhiên peptid phân đoạn chƣa đƣợc phân tách hoàn toàn mà kết điện di cho thấy phân đoạn khối lƣợng phân tử nằm rải rác nhiều vùng khác Những nghiên cứu tác động neurotoxin cho thấy chúng tác động lên kênh ion khác khối lƣợng phân tử chúng khác Cụ thể, neurotoxin tác động lên kênh Kali bào thần kinh có khối lƣợng phân tử 41 Luận văn tốt nghiệp đại học từ đến kDa neurotoxin tác động lên kênh Natri lại có khối lƣợng phân tử từ đến kDa Do đó, từ kết chạy điện di kết hợp với thử nghiệm khảo sát độc tính phân đoạn lên động vật, thử nghiệm hoạt tính sinh học, chúng tơi nhận biết thành phần phân đoạn nọc có hoạt tính cần quan tâm định hƣớng cho nghiên cứu 3.4 Kết khảo sát độc tính phân đoạn nọc sau sắc ký lọc gel lên động vật Thử nghiệm khảo sát độc tính phân đoạn nọc sau sắc ký lọc gel có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu Thông qua thử nghiệm khảo sát độc tính lên động vật nhận biết sơ đƣợc phân đoạn nọc có độc tính lên động vật, phân đoạn khơng có độc tính, kết hợp với kết điện di phân đoạn nọc, biết đƣợc phân đoạn nọc có chứa toxin để tiếp tục tinh phân đoạn nọc Tiến hành thử độc tính phân đoạn lên chuột, chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 3.4 Kết thử nghiệm độc tính phân đoạn nọc tách sắc ký lọc gel Phân đoạn nọc Biểu chuột sau tiêm Chuột gãi mõm, nằm im sau hoạt động bình thường Nhận xét độc tính Khơng độc Chuột giảm hoạt động, xù lông, thở gấp phục hồi Không độc sau 30 phút Chuột nằm im, chảy nước bọt, liệt chi, thở gấp phục Gây độc hồi sau Chuột nằm im, mắt nhắm, co giật, liệt chi, chảy nước bọt, Độc gây chết chuột tử vong sau Chuột run, nằm im, hoạt động bình thường sau 60 phút Khơng độc 42 Luận văn tốt nghiệp đại học  Nhận xét: Dựa vào kết thử nghiệm độc tính, ta thấy phân đoạn nọc tách phân đoạn phân đoạn có độc tính phân đoạn có độc tính gây tử vong Từ kết này, tiếp tục tinh phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Ứng với kết điện di nhận thấy, thành phần độc tố phân đoạn neurotoxin có khối lƣợng phân tử từ đến kDa Thành phần độc tố phân đoạn phospholipase có khối lƣợng phân tử nằm vùng từ 13 đến 14 kDa neurotoxin có khối lƣợng phân tử từ đến kDa Do đó, độc tính phân đoạn phospholipase neurotoxin gây Theo kết điện di, phân đoạn có khối lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử neurotoxin nhƣng qua kết thử nghiệm độc tính cho thấy chúng khơng gây độc, chúng protein có khối lƣợng phân tử nằm vùng tƣơng đƣơng với khối lƣợng neurotoxin nhƣng chất khác 3.5 Xác định độc tính cấp phân đoạn độc lên động vật theo đƣờng tiêm tĩnh mạch Phân đoạn tách từ nọc thơ bị cạp Heterometrus laoticus phƣơng pháp sắc ký lọc gel, thơng qua thử nghiệm độc tính lên chuột cho thấy chúng có độc tính gây chết Vì vậy, chúng tơi tiến hành xác định độc tính cấp phân đoạn lên động vật đạt đƣợc kết nhƣ sau:  Xác định đƣợc liều tối đa không gây chết LD0 = 18 mg/kg  Xác định đƣợc liều tối thiểu gây chết 100% LD100 = 35 mg/kg  Xác định liều chết trung bình LD50 theo phƣơng pháp Karber – Behrens theo bảng 3.7 ta có: ∑ab =102 n = 56/6 = 9,33 Vậy LD50 = 24, 07 mg/kg 43 Luận văn tốt nghiệp đại học Bảng 3.5 Tỷ lệ tử vong chuột liều khác khoảng LD0 LD100 sau 24 tiêm Liều tiêm 18,00 21,40 24,80 28,20 31,60 35,00 Số chuột/lô 10 12 12 10 Số chuột chết Số chuột sống Tỷ lệ chết (%) 0,00 20,00 66,66 75,00 80,00 100,00 Bảng 3.6 Bảng tính theo phƣơng pháp Karber – Behrens a 8,5 8,5 b 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 a.b 3,4 17 28,9 28,9 23,8 Hình 3.3 Đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng Dựa vào đồ thị tỷ lệ % chuột chết theo liều dùng ta xác định liều LD16 liều LD84 nhƣ sau: LD16 = 21 mg/kg LD84 = 32,5 mg/kg Từ tính đƣợc phân phối chuẩn s = 5,75, với bƣớc nhảy liều d = 3,4 Hằng số Karber – Behrens k = 0,564 44 Luận văn tốt nghiệp đại học Sai số chuẩn liều LD50 đƣợc tính theo cơng thức: Es 1,087 Vậy độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thơ bị cạp Heterometrus laoticus LD50 = 24, 07 ± 1,09 mg/kg  Nhận xét: Độc tính cấp phân đoạn tách từ nọc thơ bị cạp có độc tính đƣợc xếp vào độc loại II (loại có độc tính cao) theo bảng 1.1 3.6 Phân tích thành phần phân đoạn độc lên động vật phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Sau xác định đƣợc thành phần gây độc phân đoạn neurotoxin gây ra, tiến hành bƣớc tinh toxin phân đoạn phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tách phân đoạn sắc ký lỏng cao áp 45 Luận văn tốt nghiệp đại học Bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha cột C18 bƣớc sóng 280 nm, phân đoạn tách thành 25 peak khác Với kết nhƣ vậy, tiếp tục tiến hành tinh phân đoạn với điều kiện tƣơng tự để tích lũy đủ lƣợng mẫu cho peak Sau đó, chúng tơi tiến hành thử nghiệm xác định độc tính peak để xác định xem peak có độc tính 3.7 Khảo sát độc tính phân đoạn sau sắc ký lỏng cao áp Sau có kết sắc ký lỏng cao áp phân đoạn tách thành 25 peak, tiến hành thử nghiệm khảo sát độc tính chúng Từ kết thử nghiệm độc tính, chúng tơi tiếp tục có bƣớc tinh để tách toxin tiến hành xác định khối lƣợng phân tử nhƣ trình tự acid amin toxin Bảng 3.7 Kết thử độc tính phân đoạn sau tách sắc ký lỏng cao áp lên chuột Thứ tự peak Biểu chuột sau tiêm Nhận xét độc tính Chuột hoạt động mạnh, run, co người, gãi mõm sau nằm im, Không độc phục hồi sau 30 phút Chuột nằm im, xù lông, co người, ngủ say phục hồi sau 15 Không độc phút Chuột xù lông, gãi mõm, tiết nước bọt, co giật mạnh, nằm im, có dấu hiệu liệt chi phục hồi Gây độc sau 45 phút Chuột gãi mõm, thở gấp, co giật nhẹ hồi phục sau 40 Không độc phút Chuột xù lông, run, tiết nước bọt, co giật phục hồi sau Gây độc 46 Luận văn tốt nghiệp đại học Chuột xù lông, run, gãi mõm, tiết nước bọt, liệt chi, co giật mạnh kéo dài chết sau 45 Độc gây chết phút Chuột run, tăng tiết nước bọt, co chân trước, nằm im sau Gây độc phục hồi sau Chuột vận động nhiều sau nằm im hồi phục sau 30 Không độc phút Chuột xù lông, gãi mõm, co giật nhẹ, nằm im phục hồi sau Không độc 30 phút Chuột nằm im, xù lông, co người, 10 ngủ say phục hồi sau 20 Không độc phút Chuột xù lông, co người, gãi 11 mõm, run, co giật mạnh kéo dài Gây độc phục hồi sau 30 phút 12 Chuột hoạt động mạnh, gãi mõm phục hồi sau 30 phút Không độc Chuột hoạt động mạnh, co giật 13 nhẹ, gãi mõm phục hồi sau Không độc 14 Chuột xù lông, gãi mõm, co giật nhẹ phục hồi sau Không độc Chuột xù lông, gãi mõm, hoạt 15 động mạnh, co giật phục hồi Gây độc sau 30 phút 16 Chuột co giật nhẹ sau nằm im phục hồi sau 20 phút Không độc 47 Luận văn tốt nghiệp đại học 17 18 19 20 21 22 Chuột xù lông, gãi mõm, nằm im phục hồi sau Chuột xù lông, gãi mõm, nằm im phục hồi sau Chuột xù lông, nằm im, ngủ say phục hồi sau Chuột hoạt động mạnh, xù lông phục hồi sau Chuột lại nhiều, xù lơng sau nằm im phục hồi sau Chuột giảm hoạt động sau hồi phục Khơng độc Khơng độc Khơng độc Không độc Không độc Không độc Chuột giảm hoạt động sau hồi 23 24 phục Chuột xù lơng, run, nằm im phục hồi sau Không độc Không độc Chuột hoạt động nhiều, xù lông 25 sau nằm im phục hồi sau Khơng độc Nước muối sinh lý Chuột hoạt động bình thường Không độc Dựa vào kết khảo sát độc tính peak lên chuột, chúng tơi xác định có peak có độc tính với chuột lần lƣợt peak 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.11, 4.15, peak 4.6 có độc gây tử vong Các peak tƣơng đối nhỏ, chúng chiếm tỉ lệ thấp phân đoạn Do vậy, muốn tiến hành nghiên cứu cần phải tích lũy nhiều lƣợng mẫu Với kết peak 4.6 gây độc tử vong, toxin gây độc nọc bò cạp đƣợc tinh cách tƣơng đối, chúng tơi tiếp tục tinh peak 4.6 phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp tiến hành xác định khối lƣợng phân tử toxin 48 Luận văn tốt nghiệp đại học 3.8 Phân tích thành phần peak 4.6 phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Sau tích lũy đủ lƣợng mẫu peak 4.6, chúng tơi tiếp tục tinh phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp cột Jupiter 5u C18 column (250 x 46 m m x µm) bƣớc sóng 226 nm với chƣơng trình dung mơi nồng độ tăng dần tuyến tính từ dung mơi A (0,1% trifluoroaceticacid (TFA) nƣớc) đến 17% dung môi B (0.1% TFA in acetonitrile) thu đƣợc kết nhƣ hình 3.4: Hình 3.5 Sắc ký đồ peak phân tích phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Dựa vào kết phân tích peak 4.6 phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp, thu đƣợc peak tƣơng ứng 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3, hai peak 4.6.2 4.6.3 có hàm lƣợng lớn toxin gây độc tính phân đoạn 4.6 nọc bị cạp Heterometrus laoticus Vì vậy, chúng tơi gửi mẫu peak 4.6.2 4.6.3 xác định khối lƣợng phân tử phƣơng pháp khối phổ, kết đƣợc trình bày hình 3.5 3.6  Nhận xét: Nhƣ từ nọc thơ bị cạp ban đầu sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel sắc ký lỏng cao áp kết hợp với thử nghiệm độc tính lên chuột, tinh thành công hai toxin nọc bò cạp Heterometrus laoticus toxin 4.6.2 4.6.3 phƣơng pháp khối phổ máy MALDI MS (Bruker Daltonik, Đức) xác định đƣợc khối lƣợng phân tử hai toxin 3669,155 kDa 2915,040 kDa 49 Intens [a.u.] Luận văn tốt nghiệp đại học 3669.155 5000 4000 3000 2000 1000 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z Intens [a.u.] Hình 3.6 Khối phổ toxin 4.6.2 8000 2915.040 6000 4000 2000 3670.159 3258.643 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 m/z Hình 3.7 Khối phổ toxin 4.6.3 50 Luận văn tốt nghiệp đại học CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian thực luận văn tốt nghiệp “Khảo sát tính chất thành phần độc tố nọc bị cạp Heterometrus laoticus”, chúng tơi thu đƣợc kết nhƣ sau:  Với tổng số bò cạp thu mua ni điều kiện phịng thí nghiệm 850 Trong thời gian tháng chúng tơi thu đƣợc 6,9653 gram nọc thơ từ bị cạp Heterometrus laoticus  Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lọc gel gel Sephades G – 50 với dung môi đệm amonium acetat (pH = 4,7) phân tách nọc thơ thành phân đoạn nọc có khối lƣợng phân tử khác  Sử dụng phƣơng pháp điện di khảo sát khối lƣợng phân tử phân đoạn nọc thử nghiệm độc tính lên chuột, xác định đƣợc phân đoạn phân đoạn có độc tính, phân đoạn có độc tính gây tử vong Độc tính phân đoạn phospholipase (13 – 14 kDa) neurotoxin (3 – kDa) gây Độc tính phân đoạn neurotoxin (3 – kDa) gây  Tiến hành thử độc tính cấp phân đoạn theo đƣờng tiêm tĩnh mạch xác định đƣợc liều chết trung bình LD50 24,07 ± 1,09 mg/kg, đƣợc xếp vào độc loại II (loại có độc tính cao)  Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha cột C18 phân tách phân đoạn nọc thứ thành 25 peak khác Kết hợp với thử nghiệm độc tính lên chuột, chúng tơi nhận thấy peak 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.11, 4.15 có độc tính peak thứ 4.6 có độc tính gây tử vong Từ phân đoạn 4.6 làm lại phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp tách đƣợc hai toxin 4.6.2 4.6.3 Bằng khối phổ xác định khối lƣợng phân tử hai toxin lần lƣợt 3669,155 kDa 2915,040 kDa 51 Luận văn tốt nghiệp đại học 4.2 Kiến nghị Từ kết thu đƣợc, kiến nghị hƣớng nghiên cứu nhƣ sau:  Tiến hành xác định độc tính cấp phân đoạn theo đƣờng tiêm dƣới da để tìm liều khảo sát tác dụng chống co giật phân đoạn  Tiến hành xác định trình tự acid amin toxin 4.6.2 4.6.3  Tiến hành thử nghiệm khảo sát độc tính phân đoạn lên côn trùng 52 Luận văn tốt nghiệp đại học TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dawn H Gouge, Carl Olson, “Scorpions”, The university of Arizona cooperative extension [2] Camila T Cologna, Silvana Marcussi, José R Giglio, Andreimar M Soares, Eliane C Arantes (2009), “Tityus serrulatus Scorpion venom and toxins: an overview”, Proterin and Peptide Letters, 16, pp 920 – 932 [3] Dale Elgar, Johan Du Plessis, Lissinda Du Plessis (2006), “Cysteine – free peptides in scorpion venom: geographical distribution, structure – function relationship and mode of action”, African Journal of Biotechnology, (25), pp 2495 – 2502 [4] František Kovařík (2004), “A Review of the Genus Heterometrus Ehrenberg, 1828, with Descriptions of Seven New Species (Scorpiones, Scorpionidae)”, Euscorpius - Occasional Publications in Scorpiology, No.15 [5] Jan Ove Rein (1993), “Sting use in two species of Parabuthus Scorpions (Buthidae)”, The Journal of Arachnology, 21, pp 60 – 63 [6] Jan Ove Rein (2009), “The Scorpion files”, the University of Trondheim (NTNU) [7] John.J.Reeves (1998), “Scorpion envenomation”, Clinical toxicology review, 20 [8] Lourival D Possani, Baltazar Becerril, Muriel Delepierre, Jan Tytgat (1999), “ Scorpion toxins specific for Na+- channels”, Eur.J.Biochem, 264, pp 287 – 300 [9] Nunthawun Uawonggul, Sompong Thammasiriak, Arunrat Chaveerach et al (2007), “Purification and characterization of Heteroscorpine – (HS – 1) toxin from Heterometrus laoticus scorpion venom”, Toxicon, 49, pp 19 – 29 [10] P.Brownell, G Polis (2001), “Scorpion Biology and Research, Oxford University Press [11] Ubolwan Booncham, Duangkhae Sitthicharoenchai, Art – ong Pradatsundarasar, Surisak Prasarnpun, Kumthorn Thirakhupt (2007), “Sexual Dimorphism in Asian Giant Forest Scorpion, Herterometrus laoticus Couzijn, 1981”, NU Science Journal, (1), pp 42 – 52 53 Luận văn tốt nghiệp đại học [12] Wilson R Lourenco (2000), “Reproduction in scorpions, with special reference to parthenogenis”, Eropean Arachnology, (S Toft & N Scharff eds.), pp 71-85 [13] Đỗ Tất Lợi (1977), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB KHKT [14] Đỗ Trung Đàm (1996), Phƣơng pháp xác định độc tính cấp thuốc, NXB Y học, Hà Nội [15] Hoàng Ngọc Anh (2006), “Tách , làm bước đầu xác định cấu trúc số toxin từ nọc bò cạp Việt Nam Lychas mucromatus”, Tạp chí Sinh học, tr 44 – 49 [16] Hồng Ngọc Anh, Phạm Ngun Đơng n, Nguyễn Thị Mai Hƣơng, Trần Vƣơng Đức Nghĩa, Võ Phùng Nguyên (2009), “Nghiên cứu thành phần protein nọc bò cạp Herterometrus laoticus sau thời gian ni phịng thí nghiệm”, Tạp chí Hóa Học, T.47 (4A), tr 577 – 581 [17] Hồng Ngọc Anh, Phạm Ngun Đơng n, Nguyễn Thị Mai Hƣơng, Võ Phùng Nguyên (2009), “Khảo sát chất có hoạt tính sinh học nọc bị cạp Heterometrus laoticus”, Tạp chí Hóa Học, T.47 (2), tr 133 – 137 [18] Hoàng Ngọc Anh, Võ Đỗ Minh Hoàng, Nikitin Ilya, Utkin Yuri (2009), “Tách bước đầu nghiên cứu toxin ngắn nọc bị cạp Heterometrus laoticus”, Tạp chí Hóa học [19] Lê Xuân Huệ, Phạm Quỳnh Mai, Phạm Đình Sắc, Ngơ Thị Cát (1998), “Bọ cạp (Scorpinoides) Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, T.20 (1), tr – [20] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Các phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐHQG TP HCM [21] Nguyễn Thị Phƣơng Khuê, Võ Phùng Nguyên, Hoàng Ngọc Anh (2008), “Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng giảm đau, kháng viêm nọc bò cạp đen Tây Ninh”, Dƣợc học, 389, 09/2008 [22] Nguyễn Thị Phƣơng Khuê,Võ Phùng Nguyên, Hoàng Ngọc Anh (2008), “ Nghiên cứu độc tính cấp tác động giảm đau nọc bị cạp nâu bò cạp đen Việt Nam”, Y học TP Hồ Chí Minh, tập 12, phụ số 1, tr 106 – 111 [23] Nguyễn Thị Thu Vân (2004), Phân tích định lƣợng, NXB ĐHQG TP HCM [24] Võ Phùng Nguyên, Lê Lƣu Hoàng Giang, Hoàng Ngọc Anh (2009), “Độc tính 54 Luận văn tốt nghiệp đại học cấp – Bán trường diễn tác động giảm đau, kháng viêm nọc bò cạp đen An Giang Heterometrus laoticus”, Y học TP Hồ Chí Minh, tập 13, phụ số 1, tr – [25] W.D.Phillips, T.J.Chilton (2007), Sinh học tập 1, NXB Giáo dục 55