Nghiên Cứu Vi Khuẩn Chuyển Hóa Nitơ Trong Nền Đáy Vùng Nuôi Tôm Hùm (Panulirus Sp.) Phục Vụ Nuôi Trồng Thủy Sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢƠNG PHƢỚC THIÊN HỒNG NGHIÊN CỨU VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ TRONG NỀN ĐÁY VÙNG NUÔI TÔM HÙM (Panulirus sp.) PHỤC VỤ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TP HCM - Năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Phú Hòa PGS.TS Phạm Công Hoạt Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Vào hồi ……giờ … ngày …… tháng … năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh - Thư viện Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ở Việt Nam, tôm hùm phân bố từ Quảng Bình tới Bình Thuận số lượng lồng ni sản lượng lồng nuôi tôm hùm tập trung phát triển chủ yếu tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa Năm 2019, tổng số lượng lồng nuôi 02 tỉnh (Phú Yên Khánh Hòa) ước đạt 185.166 lồng, chiếm 97,8% số lượng nuôi tôm hùm Việt Nam; sản lượng đạt 2.273 chiếm 95% sản lượng nuôi nước (trích dẫn theo Tổng cục thủy sản, 2020) Tuy nhiên, hệ lụy tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp dẫn đến tình trạng nhiễm mơi trường dịch bệnh, nghề nuôi tôm biển Việt Nam gặp trở ngại lớn Theo Hoang ctv (2009), việc cho tơm hùm ăn dựa hồn toàn vào thức ăn tươi bao gồm cá giá trị thấp, nhuyễn thể, giáp xác hệ số thức ăn thường vượt 20, nghĩa lượng lớn chất hữu vào mơi trường ni Vì vậy, để sản xuất kg P ornatus P homarus, khoảng 15 kg chất thải rắn thải khu vực vùng vịnh nuôi tôm hùm Đối với lồng ni cơng nghiệp chất thải q trình ni chứa đến 45% nitơ 22% chất hữu khác Thức ăn nuôi tôm hùm thức ăn tươi phần lớn không thu gom thức ăn thừa đem vào bờ mà thải thẳng vào môi trường nước Cụ thể, chất lượng nước nuôi tôm hùm có biến động theo chiều hướng xấu Hàm lượng NH3 hầu hết vượt tiêu chuẩn cho phép, NO2 - có xu hướng tăng tầng đáy Giá trị nitơ tổng tầng đáy tập trung tương đối cao tầng lại, thấp mức 0,1 mg/l cao 0,2 mg/l, có phân tầng xảy nhóm thơng số dinh dưỡng nitrite, nitrate, ammonia, nitơ tổng (Hoàng Thị Mỹ Hương ctv, 2018) Việc phân lập tuyển chọn vi sinh vật chuyển hóa ammonia, nitrite, chịu độ mặn biển từ đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài để sản xuất chế phẩm vi sinh đánh giá hiệu chuyển hóa nitơ chủng vi sinh vật ao nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn post giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng ý nghĩa thực tiễn để định hướng sản xuất chế phẩm vi sinh quản lý môi trường nuôi trồng thủy sản nước mặn tương lai, hạn chế đáng kể lượng chất hữu thải mơi trường, góp phần phát triển nghề nuôi thủy sản cách bền vững Từ nguyên nhân mà đề tài "Nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa nitơ đáy vùng ni tơm hùm (Panulirus sp.) phục vụ nuôi trồng thủy sản” thực MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có nguồn gốc từ đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài, Phú Yên có khả chuyển hóa nitơ nhằm làm sở khoa học việc chọn lựa chủng vi khuẩn hữu ích để tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng, bột thử nghiệm hiệu chế phẩm bể ương nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn post ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Luận án phân lập chọn lọc chủng vi sinh vật chuyển hóa ammonia nitrite đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài, Tỉnh Phú Yên Mẫu bùn đáy thu thập từ bùn vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài Luận án nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng môi trường, thời gian, mật độ giống, nhiệt độ, pH để tạo chế phẩm vi sinh vật dạng lỏng Luận án nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến q trình tạo chế phẩm vi sinh chuyển hóa ammonia, nitrite dạng bột như: môi trường, thời gian, độ ẩm, tỷ lệ giống điều kiện bảo quản chế phẩm Luận án đánh giá khả chuyển hóa ammonia, nitrite mơ hình ni tơm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống bể nhằm đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập, tuyển chọn định danh nhóm vi khuẩn chuyển hoá ammonia, nitrite phân lập từ bùn đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài, Phú Yên Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng lỏng sản xuất chế phẩm vi khuẩn dạng bột Đánh giá khả cải thiện chất lượng nước nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ nước ni tơm thẻ chân trắng phịng thí nghiệm mơ hình ni ương giống tôm thẻ chân trắng giai đoạn post bể 1m3 Ý NGHĨA KHOA HỌC, THỰC TIỄN VÀ TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học đề tài Luận án bổ sung chủng vi khuẩn thu thập từ đáy vùng nuôi tơm hùm Vịnh Xn Đài, Phú n có khả xử lý ammonia nitrite, sống độ mặn nước biển vào nguồn sở liệu khoa học chung ứng dụng vi khuẩn hữu ích, làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn chuyển hóa ammonia, nitrite mơi trường ni tơm nước mặn Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết luận án tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng bột, đánh giá hiệu chế phẩm bể nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống, hỗ trợ cho nghề nuôi tôm nước lợ phát triển bền vững, góp phần cải thiện ô nhiễm môi trường vùng nuôi tôm nước lợ, làm tảng định hướng cho việc sản xuất ứng dụng chế phẩm vi sinh xử lý môi trường nước ni tơm hùm tương lai Tính luận án Luận án phân lập, tuyển chọn từ đáy vùng nuôi tôm hùm khu vực Vịnh Xuân Đài, Tỉnh Phú Yên ba chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 có khả chuyển hóa hợp chất ammonia, nitrite, nitrate Luận án xây dựng qui trình phân lập ba chủng vi khuẩn từ môi trường nước mặn Luận án nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường lỏng bán rắn phù hợp cho phát triển ba chủng vi khuẩn làm sở cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh vật CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ đồ chu trình chuyển hóa nitơ hệ sinh thái biển Q trình chuyển hố 1: Quang hợp Phytoplankton Trong trình tác động lượng ánh sáng mặt trời, Phytoplankton sử dụng khí CO2, nước muối dinh dưỡng có Amoni, Nitrit Nitrat mơi trường để tổng hợp chất hữu Quá trình chuyển hố 2: Hơ hấp Phytoplankton Trong q trình này, phần lượng chất hữu thành tạo quang hợp bị ơxy hố làm giảm sinh khối PHY, kèm theo giải phóng số hợp phần vơ có hợp chất Nitơ vô cơ, làm tăng nồng độ AMO NIT Quá trình chuyển hố 3: Dinh dưỡng Zooplankton Trong q trình Zooplankton sử dụng Phytoplankton làm thức ăn để tồn phát triển Cường độ sử dụng thức ăn Zooplankton phụ thuộc vào hàm lượng thức ăn (PHY), sinh khối chất quần thể Zooplankton Quá trình chuyển hố 4: Hơ hấp Zooplankton Hơ hấp Zooplankton q trình ngược lại với đồng hố Trong q trình phần vật chất (năng lượng) lấy đồng hoá thức ăn lại bị oxy hố để giải phóng lượng Zooplankton sử dụng lượng để tồn phát triển Q trình chuyển hố 6: Chết tự nhiên quần thể Phytoplankton Zooplankton Quá trình làm giảm sinh khối quần thể làm tăng sinh khối chất hữu (DOM) Đối với PHY, cường độ trình chết tự nhiên bị giới hạn nồng độ muối dinh dưỡng (AMO NIT), ZOO - bị giới hạn hàm lượng thức ăn (PHY) Q trình chuyển hố 7: Khống hố chất hữu Phân huỷ khoáng hoá chất hữu biển (các xác chết, sản phẩm dư thừa hoạt động sống) tập hợp q trình lý-hố-sinh học phức tạp, có tham gia sinh vật (chủ yếu vi sinh vật phân giải) chất Ôxy, nước 1.2 Các q trình chuyển hố nitơ vai trị nhóm vi khuẩn tham gia chuyển hóa Trong nước nitơ tồn nhiều dạng khác môi trường cạn nitơ phân tử, hợp chất nitơ vô hợp chất hữu phức tạp có thể sống (protein, acid amin) Khi thể sinh vật chết đi, chất hữu chứa nitơ bị thối rửa amôn hoá tác dụng + + vi sinh vật thành NH3 hay NH4 Dạng NH4 bị chuyển hố thành dạng NO3 nhờ nhóm vi khuẩn nitrate hoá Các hợp chất nitrate lại chuyển hoá thành dạng nitơ phân tử tác đụng vi khuẩn phản nitrtate hố Khí nitơ phân tử cố định lại dạng hợp chất hữu nhờ nhóm vi khuẩn cố định đạm Các q trình kết hợp lại tạo vịng tuần hồn nitơ thuỷ vực Trong tất trình có tham gia nhóm vi khuẩn khác 1.3 Đặc điểm nhóm vi khuẩn tham gia q trình chuyển hóa Nitơ 1.3.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus nhóm trực khuẩn, tế bào hình que thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10 µm, di động chu mao, vi khuẩn Gram dương, catalase dương tính 1.3.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Rhodococcus Một số chủng tạo khuẩn ty khí sinh phân nhánh bó sợi Chúng khơng có khả chuyển động khơng hình thành bào tử hay nội bào tử Vi khuẩn gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính 1.3.3 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Pseudomonas Vi khuẩn Pseudomonas thường vi khuẩn Gram âm (–), hình que Có chiên mao cực nên có khả di chuyển tốt nước, khơng có khả tạo bào tử Vi khuẩn Pseudomonas vi khuẩn sống tự do, chúng diện khắp nơi môi trường đất, nước, thực vật, động vật, số làm hư thực phẩm 1.3.4 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Stenotrophomonas Stenotrophomonas chi vi khuẩn Gram âm, bao gồm mười lồi Các nguồn chứa Stenotrophomonas đất thực vật (Ryan ctvl, 2009) Các loài Stenotrophomonas bao gồm từ sinh vật đất thông thường (S nitritireducens) đến mầm bệnh hội người (S maltophilia), phân loại phân tử chi chưa rõ ràng 1.3.5 Đặc điểm sinh học nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitơ khác Providencia stuartii loại trực khuẩn Gram âm thường tìm thấy đất, nước nước thải P stuartii loài phổ biến số loài tìm thấy chi Providencia, với Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Providencia rustigianii, P heimbachae Alcaligenes faecalis loài vi khuẩn Gram âm, hình que thường tìm thấy mơi trường Nitrosomonas thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có hình que tế bào vi khuẩn khác có hình dạng kích thước khác Nitrobacter thuộc nhóm vi khuẩn tự dưỡng hố vơ hiếu khí bắt buộc, nhận nguồn lượng từ q trình oxy hố nitrite thành nitrate 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật ni trồng thủy sản nƣớc ngồi nƣớc Năm 2017, Hoàng Hà Phương ctv, tạo chế phẩm sinh học chứa chủng vi khuẩn nitrate hóa có hiệu chuyển hóa ammoni 95% hệ lọc điều kiện phịng thí nghiệm, ứng dụng thành công đầm, ao nuôi trồng thủy sản Tỉnh Thanh Hóa Sóc Trăng với hàm lượng TAN thấp 0,1mg/L sử dụng chế phẩm vi khuẩn nitrate hóa Các chế phẩm vi sinh sử dụng nuôi tôm bao gồm CPVS xử lý chất hữu cơ, CPVS xử lý khí độc đáy ao, CPVS đối kháng Vibrio gây bệnh, CPVS bổ sung vào thức ăn, đặc biệt hai chủng CPVS xử lý khí độc đối kháng Vibrio sử dụng nhiều hộ nuôi tôm bán thâm canh thâm canh (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh ctv, 2017) Sarmila Muthukrishnan ctv (2015), phân lập vi khuẩn từ mẫu nước thải sau thu hoạch tôm cấy môi trường Nitrate Agar (SRL, Sisco Research Laboratoau ries Pvt Ltd, Mumbai, India) có bổ sung 2% (w/v) NaCl, sau cho dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình 25L nước thải, tiến hành đo TAN Nitrite sau 24 ngày, đánh giá hiệu suất chuyển TAN nitrite chủng vi khuẩn thời gian ngày cao 73,80% (TAN), 91,61% (nitrite) Lei Yang ctv (2016) sử dụng phương pháp giải trình tự gen vùng 16S rRNA với cặp mồi 27F and 1492R định danh chủng vi khuẩn khử nitrate mẫu bùn, kết chủng vi khuẩn dị dưỡng khử nitơ Acinetobacter junii, Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ bước nghiên cứu thể Hình 2.1 Nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) đánh giá chuyển hóa Nitơ ni trồng thủy sản Phân lập, tuyển chọn định danh nhóm vi khuẩn từ đáy vùng ni tơm hùm (Panulirus sp.) Nhóm vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa ammonia đáy vùng ni tơm hùm Nhóm vi khuẩn AOB chuyển hóa ammonia đáy vùng ni tơm hùm Nhóm vi khuẩn NOB chuyển hóa nitrite đáy vùng nuôi tôm hùm Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonia, nitrite, nitrate cao Đánh giá hiệu chuyển hóa Nitơ ni trồng thủy sản Tối ưu hóa thành phần mơi trường nhân sinh khối lỏng chủng vi khuẩn Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột Thử nghiệm sử dụng chế phẩm vi sinh chuyển hóa Nitơ mơi trường nước ni tơm thẻ chân trắng Hình 2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Luận án thực từ tháng 8/2016 đến tháng 08/2020 Đại Học Nông Lâm Tp.HCM 2.3 Thu mẫu bùn Mẫu thu từ tháng 8/2016 – 7/2017, định kỳ tháng lần (12 lần thu mẫu) 11 lồng treo lồng chìm, tổng số mẫu thu 132 mẫu bùn, phân tích tiêu pH, độ mặn, ammonia, nitrite, nitrate, N tổng 2.4 Nội dung 1: Phân lập định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ đáy vùng ni tơm hùm 2.4.1 Phân lập định danh vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa ammonia 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus sp Môi trường phân lập vi khuẩn Bacillus sp Phân lập môi trường Tripticase soya agar (TSA) có bổ sung NaCl nồng độ 1,5%, 2%, 2,5%, 3% 3,5% Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả xử lý ammonia Sau phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp., chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường ammonium-calcium-carbonate 48 giờ, đem kiểm tra khả xử lý ammonia 2.4.1.2 Phƣơng pháp định danh sinh hóa vi khuẩn Bacillus sp Phương pháp nhuộm Gram thực khóa phân loại bergey 2.4.1.3 Phƣơng pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn Bacillus sp Khuếch đại vùng gen mục tiêu phản ứng PCR: thực phản ứng PCR với cặp mồi chung vùng 16S - rRNA 27F (5' AGATTTGATCCTGGCTCAG3') 1492R(5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3') (Tim Schuurman ctv, 2004) Xây dựng phả hệ phần mềm MEGA X theo phương pháp Neighbor Joining với hệ số bootrap 1000 (Kurma, 2018) 2.4.2 Phân lập định danh vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB) 2.4.2.1 Mơi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia Mơi trường phân lập vi khuẩn: mơi trường ammonium-calciumcarbonate có bổ sung muối NaCl 1,5%, 2%, 2,5%, 3% 3,5% 2.4.2.2 Các bƣớc phân lập nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia Kiểm tra diện nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia: Mẫu bùn pha loãng thành nồng độ chuyển vào mơi trường ammonium – calcium – carbonate có bổ sung NaCl, ủ tối 28 0C máy lắc khoảng 21 ngày Sau ủ, kiểm tra diện NO2- thuốc thử Griess – Ilosway Xác định dương tính nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia: Dung dịch thuốc thử A, B, C trộn lẫn theo tỉ lệ 1:1:1 cho vào 5mL dịch huyền phù vi khuẩn, lắc để yên phút xem kết Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn AOB theo MPN: Số lần dương tính hay âm tính mẫu bùn ghi nhận tra bảng thống kê Mac Crady để suy giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật mẫu Nuôi tăng sinh phân lập vi khuẩn: dung dịch huyền phù vi khuẩn chuyển vào môi trường ammonium – calcium – carbonate, ủ bóng tối 28 0C, lắc tuần Sau ngày, kiểm tra có mặt NO2- ống môi trường thuốc thử Griess - Ilosway tuần kiểm tra khả nhiễm vi khuẩn dị dưỡng ống mơi trường phân lập vi khuẩn TSA có bổ sung NaCl 2.4.2.3 Phƣơng pháp định danh sinh hóa vi khuẩn AOB Phương pháp nhuộm Gram phản ứng sinh hóa: theo Sharmin Rahman, 2007 Định tính khả chuyển hóa ammonia chủng vi khuẩn AOB: Cho ml dung dịch huyền phù vi khuẩn phân lập vào chứa môi trường ammonium – calcium – carbonate, tiến hành ủ lắc 28 C với 10 ngày Phương pháp sử dụng kit API 20 E API 20NE: thực phản ứng sinh hóa theo hướng dẫn hãng Biomerieux, Pháp (The global health network, 2013) 2.4.2.4 Phƣơng pháp định danh sinh học phân tử vi khuẩn AOB Khuếch đại vùng gen mục tiêu phản ứng PCR: thực phản ứng PCR với cặp mồi chung vùng 16S – rRNA 27F (5’ AGATTTGATCCTGGCTCAG 3’) 515 R (5’-TACCGCGGC TGC TGG CAC-3’) (Tim Schuurman ctv, 2004) Xây dựng phả hệ : thực tương tự mục 2.4.1.3 2.4.3 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB) 2.4.3.1 Môi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite Mơi trường nitrite – calcium – carbonate có bổ sung muối NaCl 1,5%, 2%, 2,5%, 3% 3,5% 2.4.3.2 Các bƣớc phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB) Kiểm tra diện nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitrite: thực bước mục 2.4.2.2 môi trường nitrite – calcium – carbonate Xác định dương tính nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitrite: Thực bước mục 2.4.2.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn NOB: tương tự mục 2.4.2.2 Nuôi tăng sinh phân lập vi khuẩn: thực tương tự mục 2.4.2.2 môi trường nitrate - calcium – carbonate 2.4.3.3 Phƣơng pháp định danh sinh hóa vi khuẩn NOB Phương pháp nhuộm Gram, phản ứng sinh hóa: thực tương tự 2.4.2.3 Định tính khả chuyển hóa nitrite chủng vi khuẩn NOB: Các 11 licheniformis B85 Pseudomonas stutzeri KL15 có sử dụng nguồn cacbon nitơ tốt mật rỉ đường cao nấm men Các yếu tố chọn cho nghiên cứu mật rỉ đường, cao nấm men, K2HPO4, MgSO4, NaCl CaCl2, yếu tố kiểm tra hai cấp độ: mức thấp (-1) mức cao (+1) Đối với vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9, yếu tố chọn cho nghiên cứu glucose, pepton, K2HPO4, MgSO4, NaCl CaCl2, yếu tố kiểm tra hai cấp độ mức thấp (-1) mức cao (+1) Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 thiết kế Box – Behnken Sử dụng phương pháp thiết kế Box - Behnken để tạo mơ hình kiểm tra biến cần thiết cho trình nhân sinh khối vi khuẩn Trong thí nghiệm có ba mức độ khảo sát thấp (-1), sở (0) cao (+1) Đối với vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 Pseudomonas stutzeri KL15: Ba yếu tố ảnh hưởng đến q trình nhân sinh khối vi khuẩn chọn lọc từ thiết kế ma trận Plackett-Burman sử dụng ma trận Box – Behken, ký hiệu A (Mật rỉ đường), B (Cao nấm men), C (MgSO4), C’(NaCl) Đối với vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9: Ba yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân sinh khối vi khuẩn chọn lọc ma trận PlackettBurman sử dụng ma trận Box – Behken ký hiệu A’ (Glucose), B’ (Cao nấm men), C’(NaCl) 2.5.2 Chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột 2.5.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến điều kiện sản xuất chủng vi khuẩn môi trƣờng bán rắn Khảo sát môi trường ảnh hưởng đến sinh khối chủng vi khuẩn Mơi trường bán rắn có chứa cám gạo, cám bắp, cám mì bã đậu nành khảo sát để chọn tỷ lệ nạp giống tốt Khảo sát tỷ lệ nạp giống ảnh hưởng đến mật độ chủng vi khuẩn Khảo sát tỷ lệ nạp giống vi khuẩn 2,5%, 5%, 7,5% 10% (mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL), để chọn tỷ lệ nạp giống tốt Khảo sát độ ẩm ảnh hưởng đến mật độ chủng vi khuẩn Khảo sát độ ẩm nuôi cấy chủng vi khuẩn 45%, 50%, 55%, 60%, ủ nhiệt độ 30oC sau 48 giờ, đếm mật số vi khuẩn để chọn độ ẩm tốt Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến mật độ chủng vi khuẩn 12 Khảo sát thời gian nuôi cấy với mốc thời gian 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ, nhiệt độ 30oC Đếm mật độ vi khuẩn để chọn thời gian tối ưu 2.5.2.2 Bảo quản chế phẩm vi sinh dạng bột Chế phẩm vi sinh khảo sát mức nhiệt độ: nhiệt độ phòng (28 – 32o C), nhiệt độ tủ mát (4 -8oC) thời gian bảo quản 30, 60, 90, 120, 180, 270, 360 ngày, sau mức thời gian tiến hành đếm mật độ vi khuẩn 2.6 Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ chủng vi khuẩn nuôi trồng thủy sản 2.6.1 Đánh giá chuyển hóa N chủng vi khuẩn nƣớc ao nuôi trồng tôm thẻ chân trắng qui mơ phịng thí nghiệm Mẫu nước ao ni tơm thẻ chân trắng (khơng có tơm thí nghiệm) bổ sung tỷ lệ chế phẩm vi sinh vật có mật độ 108 CFU/gam vào can 20L, theo dõi tiêu pH, ammonia, nitrite, nitrate, tổng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn chuyển hóa ammonia, vi khuẩn chuyển hóa nitrite theo ngày, thời gian - ngày nhằm đánh giá hiệu chuyển hóa Nitơ chế phẩm vi sinh khảo sát tỷ lệ bổ sung vi khuẩn vào nước ao nuôi tơm thẻ chân trắng 2.6.2 Đánh giá chuyển hóa N chủng vi khuẩn bể nuôi trồng tơm thẻ chân trắng qui mơ phịng 1m3 Từ thí nghiệm 3.6.1, chọn ba tỷ lệ vi sinh thích hợp với mật độ 10 CFU/gam Chế phẩm vi sinh bổ sung ngày/ lần/ 30 ngày (chế phẩm vi sinh bổ sung từ ngày bắt đầu thả tơm) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với tất nghiệm thức lần lặp lại, bao gồm: Nghiệm thức đối chứng (NTĐC): không bổ sung chế phẩm vi sinh Nghiệm thức (NT1): bổ sung chế phẩm vi sinh với tỷ lệ 0,3% Nghiệm thức (NT2): bổ sung chế phẩm vi sinh với tỷ lệ 0,4% Nghiệm thức (NT3): bổ sung chế phẩm vi sinh với tỷ lệ 0,5% 2.7 Xử lý thống kê Sử dụng phần mềm Excel để tính giá trị trung bình độ lệch chuẩn Tối ưu hóa phần mềm Design Expert 11 Các số liệu mật độ vi khuẩn chuyển dạng log cfu/mL trước phân tích thống kê So sánh thống kê phương pháp phân tích phương sai nhân tố ANOVA phần mềm MSTATC 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nội dung 1: Phân lập định danh vi khuẩn chuyển hóa Nitơ từ đáy vùng ni tơm hùm 3.1.1 Các tiêu môi trƣờng mẫu bùn đƣợc thu Vùng Vịnh Xuân Đài Kết phân tích mẫu bùn cho thấy hàm lượng tiêu môi trường pH, độ mặn, ammonia, nitrite, nitrate N tổng 12 tháng nằm giới hạn cho phép vi sinh vật AOB, NOB phát triển, tham gia vào q trình chuyển hóa ammonia, nitrite đáy vùng nuôi tôm hùm Vịnh Xuân Đài phù hợp cho việc nuôi tơm hùm 3.1.2 Nhóm vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa ammonia 3.1.2.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus chuyển hóa ammonia Mẫu bùn tổng 132 mẫu thu thập khu vực nuôi tôm hùm người dân Vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên tiến hành phân lập, sau 18-24 nuôi cấy phân lập 93 khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus sp 3.1.2.2 Chọn lọc khả xử lý ammonia vi khuẩn phân lập đƣợc Trong 36 chủng vi khuẩn nghi ngờ Bacillus sp., xác định 13 chủng vi khuẩn (B2, B5, B7, B9, B11, B12, B18, B31, B58, B68, B74, B85, B91) có khả xử lý ammonia, tiến hành định danh sinh hóa 13 chủng vi khuẩn 3.1.2.3 Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn Bacillus sp Dựa vào khóa phân loại Bergey, bước đầu khẳng định 13 chủng vi khuẩn Bacillus sp., nhiên kết sinh hóa chưa định danh đến lồi mà xác định đến chi, cần thực phương pháp giải trình gen vùng 16S-rRNA để kết luận xác tên loài vi khuẩn 3.1.2.4 Kết định danh sinh học phân tử chủng vi khuẩn Bacillus sp Hình 3.1 cho thấy phả hệ cho thấy chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp không phát sinh loài mới, chứng tỏ chủng vi khuẩn phân lập thuộc chi Bacillus sp Ở nhánh phân loài, hệ số bootstrap chủng vi khuẩn B85 với trình tự tham chiếu Bacillus licheniformis 95% Do đó, xác định chủng B85 vi khuẩn Bacillus licheniformis, chủng vi khuẩn lại (B2, B5, B7, B9, B11, B12, B18, B31, B58, B68, B74, B91) vi khuẩn Bacillus sp Các trình tự Bacillus 14 đưa vào Genbank Hình 3.1 Cây phả hệ chủng vi khuẩn Bacillus sp 3.1.2.5 Kết đánh giá khả chuyển hóa ammonia chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập Tiến hành nuôi 13 chủng vi khuẩn Bacillus định danh (B2, B5, B7, B9, B11, B12, B18, B31, B58, B68, B74, B85, B91) mơi trường định lượng có chứa NH3/NH4 Các chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonia có chủng chuyển hóa ammonia với hiệu suất từ 80% - 90% (B2, B7, B9, B11, B12, B18, B91) chủng vi khuẩn chuyển hóa 97% (B5, B31, B58, B68, B74 B85) 3.1.3 Kết phân lập vi khuẩn chuyển hóa ammonia từ mẫu bùn 3.1.3.1 Kết xác định vi khuẩn chuyển hóa ammonia có mẫu bùn Sau kiểm tra diện nhóm AOB 132 mẫu bùn, loại bỏ bớt mẫu bùn có màu hồng nhạt có mật độ vi khuẩn từ 101 - 102 MPN/gam, kết có 21 mẫu bùn có mật độ vi khuẩn nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB) 3.1.3.2 Kết đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Từ 21 mẫu bùn có diện nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia, phân lập 60 chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa ammonia mơi trường ammonium – calcium – carbonate bổ sung NaCl 3.1.3.3 Kết xác định khả chuyển hóa NH3 chủng vi khuẩn 15 Trong 60 chủng vi khuẩn khảo sát có 35 chủng có khả chuyển hóa ammonia, 25 chủng vi khuẩn khơng có khả chuyển hóa ammonia Khả chuyển hóa 35 chủng vi khuẩn sau 10 ngày mức độ khác nhau, có 10 chủng vi khuẩn KL2, KL10, KL11, KL14, KL15, KL21, KL26, KL30, KL33, KL35 cho phản ứng màu vàng có mặt NO2- nên mức độ chuyển hóa ammonia mạnh 3.1.3.4 Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn Tra kết phần mềm Kit API 20 NE V 8.0 cho thấy chủng vi khuẩn KL2 có độ tương đồng với nhóm vi khuẩn Acinetobacter baumannii/calcoaceticus 99,9%, chủng KL10 có độ tương đồng 99,9% với chủng vi khuẩn Ochrobactrum anthropi, chủng vi khuẩn KL 11 chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa với độ tương đồng 82,9%, KL14 Pseudomonas fluorescens có độ tương đồng 99,1%, chủng KL15 Pseudomonas fluorescens có độ tương đồng 99,8%, chủng KL21 thuộc chi Burkholderia Sphingomonas chủng vi khuẩn có ký hiệu KL26 vi khuẩn Sphingoacterium multivorum với độ tương đồng 99,9% Kết phần mềm API 20E V5.0 cho thấy chủng KL30 vi khuẩn Providencia stuartii với độ tương đồng 97,5% Chủng vi khuẩn KL33 xuất chi vi khuẩn Alcaligenes, Moraxella Bordetella với độ tương đồng 59,9% Chủng vi khuẩn KL35 vi khuẩn Pseudomonas oryzihabitans với độ tương đồng 39,8% 3.1.3.5 Kết định danh giải trình tự vùng 16S – rRNA Hình 3.3 Cây phả hệ chủng vi khuẩn AOB Cây phả hệ hình 3.3 vẽ theo phương pháp Neighbor joining 16 phần mềm MEGA X với độ tin cậy 1000 lần lặp lại thể vùng gen giải trình tự khơng phát sinh lồi có họ hàng gần hay lồi khác Các trình tự gen chủng vi khuẩn phân lập phân nhóm với trình tự tham chiếu NCBI có hệ số bootstrap đạt 99% - 100% Xác định KL2 Acinetobacter baumannii/calcoaceticus, KL10 chủng vi khuẩn Ochrobactrum anthropi, KL11, KL14, KL15 chủng vi khuẩn Pseudomonas stuzeri, KL26 vi khuẩn Sphingoacterium multivorum, KL30 vi khuẩn Providencia stuartii, KL33 Alcaligenes faecalis, KL35 Micrococus luteus Các trình tự DNA chủng vi khuẩn đưa vào Genbank làm liệu so sánh 3.1.3.6 Kết đánh giá khả chuyển hóa ammonia chủng vi khuẩn tuyển chọn Tất 10 chủng vi khuẩn sau bổ sung vào môi trường chứa NH4+, chủng nuôi cấy qua đêm 30oC Mẫu thu thời điểm ngày, ngày, ngày, ngày, ngày, ngày, ngày để xác định nồng độ NO2- Kết vi khuẩn Sphingoacterium multivorum KL26, Providencia stuartii KL30, Alcaligenes faecalis KL33 có chuyển hóa ammonia nhanh thời gian ngày (84 giờ) với hiệu suất xử lý 90% Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 Micrococus luteus KL35 có hiệu suất chuyển hóa ammonia 80% ngày 3.1.4 Kết phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite từ mẫu bùn 3.1.4.1 Kết xác định vi khuẩn chuyển hóa nitrite có mẫu bùn Tổng số 132 mẫu bùn thu từ lồng nuôi tơm hùm (lồng treo lồng chìm) thời gian 12 tháng nuôi tôm vịnh Xuân Đài, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên, chọn 22 mẫu bùn có mật độ nhóm NOB từ 102 MPN/gam trở lên để tiến hành phân lập vi khuẩn nhóm NOB 3.1.4.2 Kết đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Từ 22 mẫu bùn có diện nhóm vi khuẩn chuyển hóa nitrite, phân lập 50 chủng vi khuẩn có khả chuyển hóa nitrite mơi trường nitrite – calcium – carbonate Tất 50 chủng vi khuẩn có khuẩn lạc nhỏ, lồi, nhày vun cao môi trường phân lập, dạng tròn đều, màu trắng trong, trắng sữa, trắng đục, vàng đục, Sau nhuộm gram, kết thu 10 chủng vi khuẩn tế bào có hình cầu, gram âm 40 chủng vi khuẩn có hình dạng que ngắn, que dài, có 25 chủng vi khuẩn Gram âm, 15 chủng vi khuẩn gram dương 3.1.4.3 Kết xác định khả chuyển hóa NO2- chủng vi 17 khuẩn Trong 50 chủng vi khuẩn khảo sát có 40 chủng có khả chuyển hóa nitrite, 10 chủng vi khuẩn khơng có khả chuyển hóa nitrite Trong 40 chủng vi khuẩn, cho thấy khả chuyển hóa chủng vi khuẩn mức độ khác 10 ngày, có 16 chủng vi khuẩn CKT, C2/1, C2/2, C3/1, C4/2, C8/1, C9/1, C10, TKT, T1, T2/2, T3/1, T4/1, T5/3, T7/3, T9 phản ứng với test kit cho phản ứng màu vàng có mặt NO3- nên mức độ chuyển hóa nitrite mạnh 3.1.4.4 Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn Sau chọn 16 chủng vi khuẩn từ mục 4.4.3, tiến hành nhuộm gram, thử catalase, oxidase phản ứng sinh hóa kit API Trong có 10 chủng vi khuẩn Gram (+) chủng vi khuẩn gram (-) Định danh vi khuẩn phản ứng sinh hóa kit chuẩn đốn API 20E, API 20NE, API Coryne Cả chủng vi khuẩn TKT, T2/2, C2/2, C4/2 có độ tương đồng với chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia 96,7% Hai chủng vi khuẩn T1, C3/1 có độ tương đồng 99,7% với chủng vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia, chủng vi khuẩn CKT C2/1 độ tương đồng 99,8% với chủng vi khuẩn Chryseobacterium indologenes Chủng vi khuẩn T3/1 có độ tương đồng 72,5% với chủng vi khuẩn Delftia acidovorans, chủng vi khuẩn T4/1 có độ tương đồng 90,9% với chủng vi khuẩn Acinetobacter junii/johnsonii Chủng vi khuẩn C8/1 có độ tương đồng 89,2% với chi vi khuẩn Arthrobacter spp., chủng vi khuẩn C9/1 có độ tương đồng 98,7% với chi Brevibacterium spp., chủng vi khuẩn C10 có độ tương đồng 99,5% với chủng vi khuẩn Propionibacterium avidum Chủng vi khuẩn T5/3 tương đồng với 68,5% với nhóm Cellulomonas spp./Microbacterium spp., chủng vi khuẩn T7/3, T9 tương đồng với nhóm vi khuẩn Rhodococcus spp 92,9% 94,3% 3.1.4.5 Định danh vi khuẩn phân tích trình tự gen 16S rRNA Dựa vào kết sinh hóa kết giải trình tự gen 16S rRNA với phân nhóm di duyền hình 3.5, thấy chủng vi khuẩn nhánh di truyền, khơng phát sinh lồi mới, có độ tin cậy cao với trình tự vi khuẩn tham chiếu, xác định chủng CKT C2/1 Chryseobacterium gleum, chủng T3/1 Delftia lacustris, chủng ký hiệu T4/1 Acinetobacter junii, chủng vi khuẩn C8/1 Arthrobacter nicotianae, T7/3 Rhodococcus aetherivorans T9 Rhodococcus rhodochrous, C3/1 T1 18 Stenotrophomonas maltophilia, TKT, T2/2, C2/2, C4/2 Stenotrophomonas pavanii Các trình tự DNA chủng vi khuẩn đưa vào genbank nguồn liệu cho nghiên cứu so sánh Hình 3.5 Cây phả hệ chủng vi khuẩn NOB 3.1.4.6 Kết đánh giá khả chuyển hóa nitrite chủng vi khuẩn tuyển chọn Sau 72 giờ, hiệu suất chuyển hóa nitrite chủng vi khuẩn từ 66,5 % - 98,21%, có 11 chủng vi khuẩn CKT, C2/1, C2/2, C3/1, C4/2, TKT, T1, T2/2, T3/1, T4/1, T9 hiệu suất chuyển hóa nitrite 95%, chủng vi khuẩn T2/2 có hiệu suất xử lý cao (98,21%) chủng thấp T9 (95,05%) 3.1.5 Khảo sát khả chuyển hóa hợp chất chứa nitơ khả chịu mặn nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus, AOB NOB Từ chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus chuyển hóa ammonia 95%, chủng vi khuẩn AOB chuyển hóa 80% 11 chủng NOB chuyển hóa nitrite 95% 3.1.5.1 Khảo sát khả chuyển hóa NO2-, NO3- khả chịu mặn chủng vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn AOB Chọn chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 chuyển hóa 19 ammonia 95% 24 giờ, chuyển hóa nitrite 96,97%, chuyển hóa nitate 89,63% ngày chủng vi khuẩn thứ Pseudomonas stutzeri KL15, có hiệu suất chuyển hóa ammonia 83,87% ngày, chuyển hóa nitrite 99,06% ngày, nitrate 98,02 % ngày, tất chủng vi khuẩn sống độ mặn từ 3-7% 3.1.5.2 Khảo sát khả chuyển hóa NH4- NO3- khả chịu mặn nhóm vi khuẩn NOB Chọn chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 có chuyển hóa ammonia 86,21 % thời gian ngày, chuyển hóa nitrite 95,01 % ngày, chuyển hóa nitrate 81,24 % ngày, sống độ mặn từ 37% 3.2 Nội dung 2: Tạo chế phẩm vi sinh dạng lỏng bột 3.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng ni cấy tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng lên men tạo chế phẩm dạng lỏng chủng vi khuẩn 3.2.1.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến tăng sinh khối ba chủng vi khuẩn Tóm lại, chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 tăng sinh môi trường NB, thời gian 24 giờ, tỷ lệ giống 1% với mật độ 108 CFU/mL Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15 tăng sinh môi trường TSB thời gian 24 giờ, tỷ lệ giống 1% với mật độ 108 CFU/mL 3.2.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình tạo chế phẩm dạng lỏng Ba chủng vi khuẩn R.rhodochrous T9, B.licheniformics B85, P.stutzeri KL15 nuôi cấy với tỷ lệ giống 2,5% (mật độ 108 CFU/mL), nhiệt độ 30oC, thời gian 36 pH Nguồn nitơ cacbon môi trường sản xuất cho chủng vi khuẩn B.licheniformics B85, P.stutzeri KL15 mật rỉ đường cao mấm men, chủng vi khuẩn R rhodochrous T9 glucose pepton 3.2.1.3 Tối ƣu hóa thành phần môi trƣờng nhân sinh khối chủng vi khuẩn phƣơng pháp đáp ứng bề mặt (RMS) Tối ưu hóa thành phần mơi trường sản xuất sinh khối vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 Từ liệu thu phương tình hồi quy, mơ hình dự đốn dự đốn yếu tố ảnh hưởng đến q trình sản xuất mật rỉ đường: 3,94 g/L, cao nấm men: 15,56 g/L NaCl 1,13g/L, cho kết dự đoán phần mềm DX11 11,44 Log.CFU/mL (2,77 x 1011 CFU/mL), kết vi 20 khuẩn thực nghiệm 3,14 x 1011 CFU/mL (11,49 Log.CFU/mL ) điều kiện nhiệt độ 30oC, 36 giờ, pH 7, tỷ lệ giống 2,5% Tối ưu hóa thành phần mơi trường sản xuất sinh khối vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 Từ liệu thu phương tình hồi quy, thông số tối ưu thành phần môi trường xác định sau: mật rỉ đường 4,95 g/L, cao nấm men 19,08 g/L MgSO4 1,13 g/L, mơ hình phần mềm Design Expert 11 dự đốn mật độ vi khuẩn tối đa đạt 2,45 x 1011 CFU/mL (11,60 Log.CFU/mL) Mật độ vi khuẩn P stutzeri KL15 sau 36 nuôi cấy, nhiệt độ 33 oC, tỷ lệ nạp giống 2,5% 2,37 x 1011 CFU/mL Tối ưu hóa thành phần mơi trường sản xuất sinh khối vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 Từ liệu thu phương tình hồi quy, thành phần mơi trường nuôi cấy vi khuẩn R rhodochrous T9 xác định mơ sau: Glucose 7,93 g/L, pepton 6,1 g/L NaCl 2,95 g/L, kết dự đoán mật độ vi khuẩn phần mềm DX11 tối đa đạt 2,93x 1010 CFU/mL (10,467 Log.CFU/mL) Mật độ vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 nuôi thực nghiệm sau 36 nuôi cấy, nhiệt độ 33 oC, tỷ lệ nạp giống 2,5% 2,52 x 1010 CFU/mL (10,40 Log.CFU/mL) 3.2.2 Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột 3.2.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến điều kiện sản xuất chủng vi khuẩn môi trƣờng bán rắn Khảo sát môi trường ảnh hưởng đến sinh khối chủng vi khuẩn Kết chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 phát triển tốt môi trường bã đậu nành, tỷ lệ nạp giống 5%, độ ẩm 55%, thời gian nuôi cấy 60 Chủng vi khuẩn P stutzeri KL15 phát triển tốt mơi trường có chất mang cám bắp, tỷ lệ nạp giống 7,5%, độ ẩm 55%, thời gian nuôi cấy 72 Chủng Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt môi trường cám gạo, tỷ lệ nạp giống 5%, độ ẩm 55%, thời gian nuôi cấy 72 3.2.2.2 Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng bột Ba chủng vi khuẩn nhân lên từ môi trường bán rắn theo điều kiện khảo sát, đem sấy điều kiện nhiệt độ 400C - 450 C thời gian -3 ngày, sấy khơ độ ẩm 10 - 15%, sau nghiền mịn, đếm lại mật độ vi khuẩn để tiến hành trộn với chất phụ gia 21 Bảng 3.21 Mật độ vi khuẩn sau nghiền sấy Stt Chủng vi khuẩn Mật độ vi khuẩn (CFU/gam) Bacillus licheniformis B85 5,1 x 109 Pseudomonas stutzeri KL15 3,3 x 109 Rhodococcus rhodochrous T9 1,8 x 109 Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm vi sinh Bảo quản điều kiện nhiệt độ từ – 8oC, vi khuẩn bảo quản tốt hơn, mật độ vi khuẩn có giảm nhẹ sau 120 ngày bảo quản sau 360 ngày, chủng vi khuẩn B licheniformis B85 giảm 107 CFU/g, chủng vi khuẩn lại 106 CFU/g Đối với bảo quản nhiệt độ 28-32oC, mật độ vi khuẩn giảm nhẹ sau 180 ngày sau 360 ngày, mật số vi khuẩn B licheniformis B85 giảm 106 CFU/g, hai chủng vi khuẩn giảm xuống 105 CFU/g 3.3 Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ chủng vi khuẩn nuôi trồng thủy sản 3.3.1 Đánh giá chuyển hóa N chủng vi khuẩn nƣớc ni tơm thẻ chân trắng (khơng có tơm) qui mơ phịng thí nghiệm 3.3.1.1 Đánh giá chuyển hóa N chủng vi khuẩn Hình 3.33 Chỉ tiêu pH Hình 3.35 Hàm lượng nitrite Hình 3.34 Hàm lượng ammonia Hình 3.36 Hàm lượng nitrate Hàm lượng chế phẩm vi sinh thích hợp cần bổ sung vào bể nuôi tôm thẻ chân trắng qui mô 1m3 để cải thiện hàm lượng ammonia 108 CFU/g với liều lượng 0,3 % (82,04%), 0,4% (85,31%) 0,5% (85,31%) 3.3.1.2 Đánh giá mật độ vi sinh vật bổ sung chế phẩm vi sinh  Tổng vi khuẩn hiếu khí 22 Sau ngày, NTĐC có tổng vi sinh vật hiếu khí cịn 1,2 x 103 CFU/mL nghiệm thức NT1, NT2, NT3 1,6 – 8,1 x 106 CFU/mL, NT4, NT5 1,2 -1,5 x 107 CFU/mL  Vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB) Sau ngày, nghiệm thức NT1 4,1 x 103 CFU/mL, NT2, NT3 1,6 – 2,1 x 104 CFU/mL NT4, NT5 1,2 – 6,2 x 105 CFU/mL  Vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB) Sau ngày, mật độ vi sinh NOB nghiệm thức NT1, NT2 1,6 1,7 x 102 CFU/mL, NT3 2,1 x 103 CFU/mL, NT4, NT5 1,2 – 2,2 x 104 CFU/mL 3.3.2 Đánh giá chuyển hóa N chủng vi khuẩn bể ni trồng tôm thẻ chân trắng giai đoạn ƣơng giống qui mô bể xi-măng 1m3 Các tiêu môi trường nước Các tiêu môi trường nước nuôi tôm nhiệt độ, pH, DO, độ mặn độ kiềm nằm giới hạn cho phép, thích hợp cho tơm hoạt động vi khuẩn chuyển hóa hợp chất nitơ Khảo sát hàm lượng TAN, nitrite nitrate bể ni tơm Hình 3.40 Hàm lượng TAN Hình 3.41.Hàm lượng nitrite Hình 3.42 Hàm lượng nitrate Trong thời gian 30 ngày, TAN NT1 biến thiên từ 1,14 – 3,31 mg/L, NT2 từ 1,12 - 2,90 mg/L NT3 từ 1, 26 – 2,50 mg/L Hàm lượng nitrite có khoảng biến thiên hàm lượng Nitrite NTĐC từ 0,06 – 15,58 mg/L, NT1 từ 0,07 – 7,32 mg/L, NT2 từ 0,04 – 3,32 mg/L NT3 từ 0,05 – 3,10 mg/mL Hàm lượng Nitrate khoảng biến thiên NO3- NT ĐC từ 0,44 - 61,11 mg/L, NT1 0,56 – 18,51 mg/L, NT2 0,56 – 13,86 ng/L, NT3 từ 0,50 – 10,03 mg/L, nghiệm thức có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê (P < 0,05) Các tiêu vi sinh vật 23 Trong 30 ngày nuôi tôm, mật độ vi khuẩn dao động nghiệm thức biến thiên từ 104 CFU/mL đến 107 CFU/mL 12 lần thu mẫu Mật độ vi khuẩn Vibrio spp dao động từ 103 – 106 CFU/mL Đối với vi khuẩn chuyển hóa ammonia (AOB) ao, mật độ vi khuẩn chuyển hóa ammonia dao động từ 7,3 x 103 cfu/mL – 9,1 x 106 cfu/mL Mật độ vi khuẩn chuyển hóa nitrite (NOB) dao động từ 102 cfu/mL – 105 cfu/mL Tăng trưởng tỷ lệ sống tôm Kết tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống tơm nghiệm thức có bổ sung chế phẩm vi sinh cao so với NTĐC Trong đó, tốc độ tăng trưởng tăng trọng đạt cao NT2, khơng có khác biệt có ý nghĩa với NT3 lại có khác biệt có ý nghĩa thống kê NT1 ĐC (P < 0,01) Tỷ lệ sống NT3 cao 93,87% có khác biệt có ý nghĩa với NT ĐC NT2, khơng có khác có ý nghĩa thống kê với NT1 Kết thử nghiệm cho thấy NT2, NT3 có bổ sung chế phẩm vi sinh 0,4% 0,5% cho kết hàm lượng TAN, NO2-, NO3-, mật số vi khuẩn Vibrio có khả cải thiện mơi trường nước bể nuôi tôm thẻ chân trắng, giúp tôm phát triển tăng trưởng tốt, tỷ lệ sống cao nghiệm thức đối chứng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Phân lập, chọn lọc chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 có khả chuyển hóa ammonia, nitrite sau: (1) Bacillus licheniformis B85 có hiệu suất chuyển hóa ammonia 98,8% thời gian 24 giờ, chuyển hóa nitrite 96,97% nitrate 89,63% ngày; (2) Pseudomonas stutzeri KL15 có hiệu suất chuyển hóa ammonia 83,87% ngày, chuyển hóa nitrite 99,06% nitrate 98,02 % ngày; (3) Rhodococcus rhodochrous T9 có hiệu suất chuyển hóa ammonia 86,21 % thời gian ngày, chuyển hóa nitrite 95,01 % ngày, chuyển hóa nitate 81,24 % ngày - Xác định qui trình phân lập cho chủng vi khuẩn đáy vùng ni tơm hùm Mỗi qui trình có khác môi trường, điều kiện phân lập môi trường tăng sinh - Tối ưu hóa thành phần mơi trường nhân sinh khối dạng lỏng cho chủng vi khuẩn để sản xuất chế phẩm vi sinh dạng lỏng: (1) Mật độ vi khuẩn B.licheniformis B85 3,14 x 1011 CFU/mL với thành phần môi trường gồm 3,94 g/L mật rỉ đường, 15,56 g/L cao nấm men 1,13 g/L 24 NaCl; (2) Mật độ vi khuẩn P.stutzeri KL15 2,37 x 1011 CFU/mL với thành phần môi trường gồm 4,95 g/L mật rỉ đường, 19,08 g/L cao nấm men 1,13 g/L MgSO4; (3) Mật độ vi khuẩn R.rhodochrous T9 2,52 x 1010 CFU/mL với thành phần môi trường 7,93 g/L glucose, 6,1 g/L pepton 2,95 g/L NaCl - Xác định yếu tố chất mang, tỷ lệ giống, độ ẩm thời gian ảnh hưởng đến trình tạo sinh khối bán rắn chủng vi khuẩn: (1) B licheniformis B85: chất mang bã đậu nành, tỷ lệ giống 5%, độ ẩm 55% thời gian lên men 60 giờ; (2) P stutzeri KL15: chất mang cám bắp, tỷ lệ giống 7,5%, độ ẩm 55% thời gian lên men 72 giờ; (3) R.rhodochrous T9 : chất mang cám gạo, tỷ lệ giống 5%, độ ẩm 55% thời gian lên men 72 - Chế phẩm vi sinh có chứa chủng vi khuẩn B licheniformis B85, P.stutzeri KL15, R rhodochrous T9 có khả chuyển hóa ammonia, nitrite mơi trường nước ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng (post 5) mật độ 108 CFU/gam, định kỳ ngày/1 lần Đề nghị Nghiên cứu đa dạng di truyền nhóm vi khuẩn chuyển hóa ammonia, nitrite đáy vùng nuôi tôm hùm Nghiên cứu thêm điều kiện, tối ưu hóa mơi trường bán rắn để sản xuất chế phẩm vi sinh qui mô lớn Đánh giá khả đối kháng lẫn chủng vi khuẩn B licheniformis B85, P.stutzeri KL15, R rhodochrous T9 phối trộn để sản xuất chế phẩm vi sinh qui mô lớn Đánh giá hiệu xử lý môi trường nước chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn B licheniformis B85, P.stutzeri KL15, R rhodochrous T9 ao nuôi thực tế tôm thẻ chân trắng, bể hay ao nuôi tôm hùm đối tượng thủy sản nuôi môi trường nước mặn, lợ khác Nghiên cứu so sánh hiệu sử dụng chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn B licheniformis B85, P.stutzeri KL15, R rhodochrous T9 với sản phẩm xử lý môi trường nuôi tôm nước lợ thị trường DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ Các báo khoa học Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng, Trần Ngọc Linh Thùy, Phạm Cơng Hoạt, Nguyễn Phú Hòa, 2019 Phân lập vi khuẩn Bacillus sp có khả chuyển hóa ammonia từ bùn đáy vùng nuôi tôm hùm lồng bè, Tỉnh Phú Yên Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn,1:72-78 (ISSN 1859 4581) Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng, Võ Trần Quốc Thắng, Đỗ Huỳnh Dân, Nguyễn Phú Hòa, 2021 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitrite từ bùn đáy vùng nuôi tôm hùm vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên Tạp chí Khoa Học Cơng Nghệ Việt Nam, 63(9): 59 - 64 (ISSN 1859-4794) Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng, Lê Phước Thọ, Vũ Phú Quang, Nguyễn Phú Hòa, Nguyễn Văn Thống, Phạm Cơng Hoạt, 2021.Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men thu sinh khối vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) Tạp chí Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam, 19(11): 1509-1521 (ISSN 1859-0004) Các giải pháp hữu ích sáng chế Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng, Nguyễn Phú Hịa, 2021 Giải pháp hữu ích: Chủng vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa nitơ mơi trường nước ni tơm hùm, Cục sở hữu trí tuệ, Công báo sở hữu công nghiệp, 399 (A-1): 365 - 366 (ISSN 0868- 2534) Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng, Nguyễn Phú Hòa, 2021 Sáng chế: Chủng vi khuẩn Stenotromonophas pavanii khiết mặt sinh học chuyển hóa nitrite mơi trường nước ni tơm hùm, Cục sở hữu trí tuệ, Công báo sở hữu công nghiệp, 401 (A-1): 299 (ISSN 0868- 2534) ... bước nghiên cứu thể Hình 2.1 Nghiên cứu phân lập vi khuẩn từ đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) đánh giá chuyển hóa Nitơ ni trồng thủy sản Phân lập, tuyển chọn định danh nhóm vi khuẩn từ đáy vùng. .. tơm hùm (Panulirus sp.) Nhóm vi khuẩn Bacillus sp chuyển hóa ammonia đáy vùng ni tơm hùm Nhóm vi khuẩn AOB chuyển hóa ammonia đáy vùng ni tơm hùm Nhóm vi khuẩn NOB chuyển hóa nitrite đáy vùng. .. khuẩn chuyển hóa nitơ đáy vùng nuôi tôm hùm (Panulirus sp.) phục vụ nuôi trồng thủy sản? ?? thực MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có nguồn gốc từ đáy vùng ni tơm hùm Vịnh Xuân