Nghiên Cứu Chuyển Đổi Biểu Mô - Trung Mô Trong Các Carcinôm Tế Bào Gai Hốc Miệng

2 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ NGUYỆT ÁNH NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI BIỂU MÔ - TRUNG MÔ TRONG CARCINÔM TẾ BÀO GAI HỐC MIỆNG Ngành: RĂNG HÀM MẶT Mã số: 62 72 06 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS.BS.Nguyễn Chấn Hùng Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Sào Trung Phản biện 2: TS.BS Phạm Xuân Dũng Phản biện 3: GS.TS Phạm Văn Liệu Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi 00 ngày 31 tháng 03 năm 2022 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM GIỚI THIỆU LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư niêm mạc miệng (UTNMM) ung thư thường gặp Cho đến nay, UTNMM mối quan tâm sức khỏe cộng đồng tỉ lệ tử vong cao, phát lâm sàng trễ, tỉ lệ sống thấp chưa có dấu ấn sinh học đặc hiệu Dù vị trí bướu dễ phát thực tế lâm sàng đa số bệnh nhân đến khám giai đoạn trễ bướu phát triển nhanh dễ xâm lấn cấu trúc xung quanh Điều trị phối hợp đa mô thức thường định gây ảnh hưởng nhiều đến chức năng, thẩm mỹ tâm lý người bệnh Đa số UTNMM carcinôm tế bào gai, thuật ngữ UTNMM dùng nghiên cứu hiểu carcinôm tế bào gai UTNMM thường xuất biểu mô bị biến đổi Theo thuyết “mơi trường ung thư hóa”, tồn niêm mạc miệng bị ảnh hưởng chất sinh ung thư, cho dù niêm mạc bình thường có biến đổi phân tử để phát triển ác tính Q trình biến đổi từ niêm mạc miệng bình thường hay từ tổn thương tiền ung thư, loạn sản trở thành ung thư gọi trình chuyển dạng ác tính Gần đây, mơ hình sử dụng nhiều để giải thích chế chuyển dạng ác tính số đặc điểm ung thư, đặc biệt ung thư biểu mô, q trình chuyển đổi biểu mơ - trung mơ (EMT) EMT trình sinh học thuận nghịch cho phép tế bào biểu mô (là tế bào phân cực kết dính với nhau) trải qua nhiều thay đổi sinh hóa để đạt kiểu hình tế bào trung mô (không phân cực tách rời nhau) có khả di cư xuyên qua màng đáy đến vị trí di Sự diện EMT yếu tố dự đoán tiến triển tiên lượng UTNMM Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu EMT UTNMM Có nhiều yếu tố phân tử tham gia vào q trình EMT Nhờ EMT, tế bào biểu mơ có khả tách rời cầu nối liên bào (giảm biểu E-cadherin), di chuyển qua màng đáy (hiện diện màng đáy biểu laminin), xâm lấn mô đệm (biểu vimentin) Đặc điểm EMT tìm thấy loạn sản biểu mơ với giảm hay biểu keratin (dấu ấn biệt hóa biểu mơ) Nhằm góp phần hiểu rõ q trình EMT xảy UTNMM giúp ích cho cơng tác chẩn đoán, tiên lượng hướng đến điều trị hiệu quả, nghiên cứu thực với mục tiêu sau: Xác định so sánh tỉ lệ, mức độ biểu hóa mơ miễn dịch hai dấu ấn biểu mô E-cadherin keratin UTNMM loạn sản biểu mô miệng, niêm mạc miệng bình thường rìa bệnh phẩm mổ ung thư; phân tích liên quan biểu dấu ấn với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM Xác định tỉ lệ mức độ biểu hóa mơ miễn dịch dấu ấn màng đáy laminin 332 UTNMM; phân tích liên quan biểu laminin 332 với lâm sàng giải phẫu bệnh UTNMM Xác định tỉ lệ mức độ biểu hóa mơ miễn dịch dấu ấn trung mơ vimentin UTNMM; phân tích liên quan biểu vimentin với lâm sàng giải phẫu bệnh UTNMM Phân tích liên quan biểu bốn dấu ấn EMT bao gồm Ecadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin UTNMM TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI UTNMM vấn đề y tế nặng nề tỉ lệ mắc tử vong di chứng thể chất tâm lý sau điều trị Bất kể tiến nghiên cứu chiến lược điều trị, tỉ lệ sống bệnh nhân UTNMM thấp không cải thiện đáng kể thập niên qua Hiện nay, EMT xem chế chủ yếu tiến triển ung thư biểu mô liên quan đến đặc điểm ác tính tế bào ung thư Tuy nhiên, hiểu biết EMT UTNMM chưa nhiều, nghiên cứu UTNMM báo cáo tỉ lệ thay đổi Tại Việt nam, chưa có nghiên cứu tìm hiểu tượng chuyển đổi biểu mơ – trung mô ung thư niêm mạc miệng Việc hiểu rõ kiện phân tử EMT cần thiết nhằm tìm kiếm thiết lập mục tiêu phân tử giúp phát sớm, dự đoán diễn tiến ung thư định hướng phát triển chiến lược điều trị đặc hiệu Trong chẩn đốn, xếp loại mơ học yếu tố tiên lượng tốt tiến triển từ tiền ung thư sang ung thư xác định mức độ trầm trọng ung thư sở để đưa định lâm sàng Tuy nhiên, việc đánh giá mô học chủ quan có sai số quan sát viên lần quan sát Trong đó, thực tế có trường hợp loạn sản thấp tiến triển thành ung thư loạn sản mức độ cao giữ nguyên trạng thái chí thối lui bất chấp yếu tố mơi trường Do vậy, khơng thể tiên đốn xác tổn thương có tiềm chuyển đổi ác tính cao dựa vào kết mô bệnh học truyền thống Trong điều trị, UTNMM có tỉ lệ tái phát chỗ cao phẫu thuật cắt bỏ không đủ rộng Đánh giá mơ học rìa cắt phẫu thuật cho thấy sau cắt bỏ hồn tồn bướu, khơng thể phát tế bào ung thư sót lại xét nghiệm mơ học thường quy Hơn nữa, có tái phát vị trí ngun phát dù chẩn đốn mơ học khơng cịn bướu Do đó, việc sử dụng dấu ấn phân tử nhằm xác định tế bào ác tính đóng vai trị quan trọng lựa chọn điều trị giảm tỉ lệ tái phát ung thư Đến nay, tiên lượng điều trị UTNMM dựa vào hệ thống phân loại TNM lâm sàng Tuy nhiên, sử dụng hệ thống TNM gây hạn chế xử trí ung thư giai đoạn sớm T1 di hạch tiến triển nhanh với kết tử vong Nhiều dấu ấn phân tử nghiên cứu liên quan đến kết điều trị UTNMM, nhiên kết không quán trái ngược nhau, thiếu chứng cụ thể lợi ích thực tiễn chi phí làm giới hạn khả ứng dụng dấu ấn thực hành lâm sàng thường qui Vì vậy, cần bổ sung dấu ấn tin cậy giúp phân loại ung thư tốt dựa đặc điểm sinh học bướu, hướng đến điều trị ứng hợp người bệnh ung thư Ý NGHĨA THỰC TIỄN VÀ ĐÓNG GÓP MỚI Ứng dụng giảng dạy nghiên cứu: Đây cơng trình nghiên cứu Việt Nam khảo sát biểu dấu ấn liên quan chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) ung thư niêm mạc miệng Các số liệu hình ảnh nhuộm sử dụng giảng dạy giải phẫu bệnh RHM Thực hóa mơ miễn dịch khảo sát số đặc điểm phân tử loạn sản niêm mạc miệng bước đầu liên kết loạn sản với chuyển đổi biểu mơ – trung mơ giúp tìm hiểu chế tiến triển ung thư, thấy rõ tranh tồn cảnh từ niêm mạc miệng bình thường sang loạn sản cuối ung thư niêm mạc miệng Nghiên cứu chứng minh có dấu hiệu q trình chuyển đổi biểu mơ-trung mơ ung thư niêm mạc miệng, góp phần bước đầu cung cấp liệu nghiên cứu trình chuyển đổi chế tiến triển xâm lấn di ung thư niêm mạc miệng người Việt Nam Ứng dụng thực tiễn điều trị: Thơng qua nhuộm hóa mơ miễn dịch keratin cho thấy phương pháp khách quan hữu dụng, hỗ trợ bác sĩ giải phẫu bệnh chẩn đoán sớm loạn sản nhẹ giúp đưa hướng giải đắn sang thương tiền ung thư hỗ trợ thêm thông tin chẩn đoán mức độ loạn sản Trên lâm sàng, nhuộm keratin giúp xác định niêm mạc miệng bình thường rìa diện cắt từ xác định rìa diện cắt phẫu thuật đủ rộng an toàn CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án có 141 trang, bao gồm phần: mở đầu (3 trang), chương 1: tổng quan tài liệu (29 trang), chương 2: đối tượng phương pháp nghiên cứu (27 trang), chương 3: kết (40 trang), chương 4: bàn luận (38 trang), kết luận (2 trang), kiến nghị (1 trang), cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 27 bảng, 12 biểu đồ, 33 hình, sơ đồ Phần tài liệu tham khảo gồm 190 tài liệu (8 tài liệu tiếng Việt, 182 tài liệu tiếng Anh) Ngồi ra, luận án có phụ lục (17 trang) NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ung thư niêm mạc miệng (UTNMM) tân sinh ác tính xuất phát môi hốc miệng, bao gồm ung thư môi, lưỡi, nướu, cái, sàn miệng niêm mạc má Trên 90% UTNMM ung thư biểu mô tế bào gai UTNMM có mức độ biệt hóa khác xu hướng cao xâm lấn chỗ di hạch Đa số UTNMM thường xuất niêm mạc bị biến đổi gọi tổn thương tiền ung thư Ở sang thương này, số loạn sản nhẹ tiến triển thành ung thư, loạn sản mức độ cao giữ ngun trạng thái chí thối lui bất chấp yếu tố mơi trường Khơng thể tiên đốn xác tổn thương có tiềm chuyển đổi ác tính cao Tiến triển ung thư biểu mô đặc điểm ác tính tế bào ung thư có chế chủ yếu liên quan đến trình chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) Khái niệm EMT đề xướng lần Greenburg c.s EMT q trình sinh học phức tạp đảo ngược, tế bào biểu mơ thay đổi khả phân cực khả kết dính để đạt đặc tính trung mơ có khả di cư mạnh, tiềm xâm lấn, kháng chết tế bào theo lập trình tăng tạo thành phần khung ngoại bào EMT tạo điều kiện cho tế bào ung thư phá vỡ màng đáy, xâm nhập mô đệm di Tại vị trí di căn, tế bào trải qua q trình chuyển đổi đảo ngược trung mơ-biểu mơ (MET) trở lại kiểu hình biểu mơ để khu trú, kết dính phát triển EMT xem chế chủ yếu tiến triển ung thư biểu mô liên quan đến đặc điểm ác tính tế bào ung thư Sự diện EMT yếu tố dự đoán tiến triển tiên lượng UTNMM, phát EMT hỗ trợ việc định lâm sàng, chiến lược điều trị tiên lượng bệnh nhân Có nhiều yếu tố phân tử tham gia vào trình EMT E-cadherin dấu ấn sinh học điển hình EMT; keratin dấu ấn biệt hóa biểu mơ với giảm biểu loạn sản biểu mô; vimentin sợi trung gian khung tế bào thường biểu tế bào có kiểu hình trung mơ, khơng biểu tế bào biểu mơ bình thường; biểu vimentin tế bào biểu mơ ác tính xem dấu ấn EMT đáng tin cậy EMT giúp tế bào biểu mô tách rời cầu nối liên bào, chuyển dạng di chuyển qua màng đáy Màng đáy cấu trúc nâng đỡ tế bào biểu mơ, có vai trị yếu trì kiểu hình biểu mơ đồng thời ngăn ngừa di chuyển, xâm lấn di tế bào ung thư Laminin thành phần cấu tạo màng đáy, góp phần quan trọng bệnh học ung thư giảm biểu màng đáy biểu bào tương tế bào ung thư Các nghiên cứu trước giới báo cáo EMT liên quan với nguy cao tái phát, tiên lượng kém, giảm tỉ lệ sống còn, biệt hoá kém, di hạch, đề kháng với xạ trị hóa trị tế bào ung thư Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) ung thư niêm mạc miệng Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang (mô tả phân tích) 2.2 Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân UTNMM đến khám điều trị Bệnh viện Ung Bướu Tp Hồ Chí Minh chẩn đốn xác định trước mổ UTNMM điều trị phẫu thuật UTNMM Khoa Ngoại (Khoa Ngoại Đầu Cổ) từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2015 Tiêu chí chọn mẫu: Bệnh nhân chọn vào mẫu nghiên cứu có đủ yếu tố sau: (1) bệnh nhân từ 18 tuổi trở lên; (2) tổn thương lâm sàng ung thư niêm mạc miệng nguyên phát; (3) chẩn đoán giải phẫu bệnh sinh thiết trước mổ carcinôm tế bào gai; (4) định điều trị phẫu thuật cắt rộng, chưa điều trị đặc hiệu ung thư; (5) giải phẫu bệnh sau mổ (bệnh phẩm mổ) carcinôm tế bào gai; (6) có đủ mẫu bệnh phẩm sau mổ vùi sáp (khối sáp) để làm xét nghiệm giải phẫu bệnh hóa mơ miễn dịch; (7) có đầy đủ hồ sơ bệnh án; (8) đồng ý hợp tác tham gia nghiên cứu Tiêu chí loại trừ: Bệnh nhân loại khỏi mẫu nghiên cứu có yếu tố sau: (1) ung thư vị trí khác lan di đến hốc miệng; (2) ung thư niêm mạc miệng kết hợp với ung thư thứ hai vị trí khác; (3) mẫu mơ ung thư khơng đủ thành phần biểu mô mô liên kết để khảo sát hóa mơ miễn dịch; (4) mẫu bệnh phẩm mổ không đủ thành phần mô tế bào gai ung thư giao diện với niêm mạc miệng lành tính kế cận Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu tối thiểu tính theo cơng thức: N= Z 1− /  p  (1 − p ) d2 Với: p tỷ lệ % UTNMM có biểu hóa mơ miễn dịch E-cadherin (42,11% theo Zhu 2018), keratin (31% theo Enokida 2017), laminin 332 (56,67% theo Koshy 2012) vimentin (66,1% theo Angadi 2016) Cỡ mẫu tối thiểu nghiên cứu là: N (E-cadherin) = 116 N (keratin 4) = 101 N (laminin) = 117 N (vimentin) = 106 Sau cùng, tổng số mẫu UTNMM chọn cho dấu ấn sinh học nghiên cứu 130 trường hợp UTNMM Trong số 130 mẫu bệnh phẩm mổ cắt rộng UTNMM, có 44 trường hợp mẫu mơ có kèm loạn sản biểu mơ rìa diện cắt, có 111 trường hợp mẫu mơ có kèm niêm mạc miệng bình thường rìa diện cắt Phương pháp chọn mẫu: thuận tiện 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Các biến số nghiên cứu Bảng 2.1 Danh sách biến số nghiên cứu Tên biến số Loại biến Giá trị biến số Đặc điểm dịch tễ - lâm sàng UTNMM Giới tính Nhị giá 1: Nam; 2: Nữ Tuổi Liên tục Số tuổi Nhóm tuổi Thứ tự 1: < 40 tuổi; 2: 40 – 70 tuổi; 3: >70 tuổi Thói quen nguy Nhị giá 0: Khơng; 1: Có 1: Lưỡi; 2: Sàn miệng; 3: Nướu răng; Vị trí ung thư Danh định 4: Khẩu cái; 5: Má; 6: Mơi Kích thước bướu (T) Thứ tự 1: ≤ cm; 2: 2-4 cm; 3: > cm; 4: xâm lấn 0: khơng có hạch; 1: hạch bên ≤ cm; 2: hạch bên 3-6 cm nhiều hạch Di hạch (N) Thứ tự bên < cm hạch hai bên hay đối bên < cm; 3: Hạch > cm Di xa (M) Nhị giá 1: Có; 2: Không 1: Giai đoạn (T1N0M0); 2: Giai đoạn (T2N0M0); Giai đoạn lâm sàng 3: Giai đoạn (T1N1M0 T2N1M0 (UICC – 2009) Thứ tự T3N0M0 T3N1M0) 4: Giai đoạn (T4N0M0 T4N1M0 TxN2M0 TxN3M0 TxNxM1) Đặc điểm giải phẫu bệnh UTNMM Grad mô học 1: Grad 1; carcinôm tế bào gai Thứ tự 2: Grad 2; (WHO, 2005) 3: Grad 1: Loạn sản nhẹ; Loạn sản biểu mô Thứ tự 2: Loạn sản vừa; (WHO, 2005) 3: Loạn sản nặng Biểu hóa mơ miễn dịch E-cadherin, vimentin, keratin laminin UTNMM, loạn sản niêm mạc miệng bình thường 1: Màng tế bào; Vị trí biểu Danh định 2: Bào tương; biểu mô 3: Màng đáy Tỉ số tế bào biểu mô nhuộm miễn dịch dương Tỉ lệ biểu (%) Liên tục tính tổng số tế bào biểu mô đếm Mức độ biểu E0: < 90% (âm tính); Nhị giá cadherin màng tế 1: 90 – 100% (dương tính) 11 Tên biến số Loại biến bào biểu mơ ung thư, loạn sản bình thường (Zhu, 2018) Mức độ biểu keratin bào tương tế bào biểu Thứ tự mô ung thư, loạn sản bình thường (Einokida, 2017) Mức độ biểu laminin 332 màng đáy đám tế bào Danh định ung thư mô đệm (Sruthy, 2013) Mức độ biểu laminin 332 bào tương tế bào ung thư Thứ tự (Junior, 2014) Mức độ biểu vimentin màng tế bào bào tương Thứ tự tế bào ung thư (Akhtar, 2016) Giá trị biến số 1: > 70% (bảo tồn biểu K4); 2: 30-70% (mất phần biểu K4); 3: 50% (dương tính cao) 0: ≤5%; 1: – 25%; 2: 26-50%; 3: 51 - 75%; 4: >75% 2.3.2 Tiến trình thực (1) Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM: - Hỏi bệnh sử, khám lâm sàng - Ghi nhận liệu lâm sàng, cận lâm sàng chẩn đoán hồ sơ bệnh án vào phiếu thu thập thông tin (2) Tại lab Giải phẫu bệnh, Khoa Nha, Đại học Y Nha Tokyo, Nhật Bản: - Cắt lát mỏng mô, dán lát mô lên tiêu - Nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) - Thực microarray - Nhuộm hóa mơ miễn dịch E-cadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin (3) Tại lab Giải phẫu bệnh Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp.HCM: 13 - Biến định lượng (tuổi, tỉ lệ tế bào biểu E-cadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin): trung bình độ lệch chuẩn, trung vị khoảng tứ phân vị Thống kê phân tích: - Các biến độc lập (biến nền): giới tính, tuổi, thói quen, đặc điểm lâm sàng giải phẫu bệnh UTNMM - Biến phụ thuộc: tỷ lệ mức độ tăng biểu vimentin; tỷ lệ mức độ giảm biểu E-cadherin keratin 4; biểu liên tục laminin 332 màng đáy quanh đám tế bào ung thư mức độ biểu laminin 332 bào tương tế bào ung thư - Mối liên quan tình trạng tăng biểu vimentin giảm biểu E-cadherin, keratin biểu liên tục laminin 332 màng đáy quanh đám tế bào ung thư mức độ biểu laminin 332 bào tương tế bào ung thư với yếu tố tuổi, giới tính, thói quen, đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM: • Kiểm định Chi bình phương >80% vọng trị >5; kiểm định xác Fisher >20% vọng trị ≤5 để so sánh tỉ lệ • Kiểm định ANOVA phân phối chuẩn kiểm định Kruskal-Wallis phân phối khơng chuẩn để so sánh giá trị trung bình • Kiểm định T bắt cặp kiểm định Wilcoxon Signed Rank so sánh giá trị trung bình tỉ lệ tế bào dương tính UTNMM NMMBT mẫu • Sử dụng hệ số tương quan Spearman để phân tích tương quan biểu cặp dấu ấn sinh học E-cadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin • Đường cong ROC phân tích độ đặc hiệu độ nhạy để xác định lợi ích lâm sàng protein EMT nghiên cứu Tất phép kiểm sử dụng độ tin cậy 95% giá trị p: liên quan hay khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 Ngoài ra, nghiên cứu sử dụng hệ số tương quan nội ICC để đánh giá độ tin cậy hai bác sĩ đánh giá kết nhuộm hóa mơ miễn dịch 2.4 Kiểm sốt sai lệch thơng tin Chọn mẫu: chọn vào nghiên cứu ca UTNMM nguyên phát, chưa điều trị đặc hiệu ung thư có chẩn đoán giải phẫu bệnh trước mổ sau mổ carcinôm tế bào gai 14 Bệnh án: nghiên cứu sinh thực theo mẫu thống nhất, hỏi kỹ bệnh sử, thăm khám, ghi nhận chẩn đoán bệnh dựa lâm sàng giải phẫu bệnh theo hồ sơ bệnh án bệnh viện hội chẩn trước điều trị ung thư Lấy mẫu mô bệnh phẩm quy cách: Mẫu mô bác sĩ phẫu thuật trực tiếp cắt phẫu thuật cho bệnh nhân ung thư, mô bệnh phẩm ngâm dung dịch formol 10% đệm trung tính đảm bảo thời gian cố định (6 - 24g) đảm bảo chất lượng cho mẫu xét nghiệm giải phẫu bệnh hóa mơ miễn dịch Độ tin cậy xét nghiệm: • Cắt lát mỏng mơ, dán lên tiêu bản, nhuộm HE nhuộm hóa mơ miễn dịch thực theo qui trình chuẩn Lab Giải phẫu bệnh Bộ môn Bệnh học miệng, Khoa Nha, Đại học Y Nha Tokyo (Nhật Bản) nghiên cứu sinh thực • Nghiên cứu sinh huấn luyện định chuẩn qua hai khóa học: từ 21/7/2014 đến 20/1/2015 đạt Chứng nhận định hướng Giải phẫu bệnh Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM cấp; từ 10/5/2014 đến 10/5/2015 đạt Chứng định hướng chuyên khoa Giải phẫu bệnh Răng Hàm Mặt Đại học Y Dược Tp.HCM cấp (Phụ lục 4) • Đánh giá kết giải phẫu bệnh bác sĩ Giải phẫu bệnh RHM nghiên cứu sinh đọc độc lập với nhau, so sánh với kết bác sĩ giải phẫu bệnh Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM Trường hợp không thống kết quả, giải cách đọc kính nhiều đầu đạt đồng thuận • Đánh giá kết hóa mơ miễn dịch nghiên cứu sinh bác sĩ Giải phẫu bệnh RHM ĐHYD Tp.HCM đọc độc lập với Trường hợp kết khác biệt, nghiên cứu sinh bác sĩ giải phẫu bệnh RHM hội chẩn với bác sĩ giải phẫu bệnh Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM thống kết qua kính hiển vi nhiều đầu Sau tuần, nghiên cứu sinh chọn ngẫu nhiên 20% số ca đọc lại để kiểm tra độ kiên định chẩn đoán, kết đạt 100% 2.4 Vấn đề y đức nghiên cứu - Đề cương nghiên cứu thông qua Hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh Đại học Y Dược Tp.HCM Hội đồng Đạo đức chấp thuận khía cạnh đạo đức vào ngày 22 tháng năm 2014 số 216/ĐHYD-HĐ - Bệnh nhân giải thích rõ mục tiêu nghiên cứu, cung cấp đầy đủ thơng tin có liên quan, giải thích rõ vấn đề bệnh nhân thắc 15 mắc Chỉ tiến hành bệnh nhân hiểu, đồng ý tham gia nghiên cứu ký tên vào giấy đồng thuận; hợp tác vấn, làm bệnh án lưu trữ thơng tin Bệnh nhân có quyền đồng ý, từ chối rút khỏi nghiên cứu nào, với lý - Nghiên cứu hồn tồn khơng can thiệp vào q trình điều trị bệnh, sử dụng mô bệnh phẩm vùi sáp sau phẫu thuật cắt rộng ung thư kế hoạch điều trị bệnh viện - Bảo mật thông tin bệnh nhân cách mã hóa liệu thu thập - Mẫu mô bệnh phẩm cắt lát, nhuộm HE, nhuộm hóa mơ miễn dịch E-cadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin, sau đọc phân tích kết quả; khơng sử dụng cho mục đích khác - Tồn chi phí xét nghiệm hóa mơ miễn dịch người nghiên cứu chi trả CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 Tỉ lệ biểu E-cadherin keratin ung thư, loạn sản niêm mạc miệng bình thường 3.1.1 Tỉ lệ mức độ biểu E-cadherin 3.1.1.1 Biểu E-cadherin ung thư so với NMMBT A E-cadherin dương tính mạnh B Bảo tồn E-cad mô 100% NMMBT (hồ sơ 24197/14) ung thư (số hồ sơ 15148/15) Hình 3.1 Biểu E-cadherin NMMBT ung thư Tỉ lệ % trung bình biểu E-cadherin UTNMM 94,9 ± 13,5%, khác biệt có ý nghĩa so với tỉ lệ 99,6 ± 1,7% NMMBT (p < 0,001) Mức độ biểu E-cadherin khác biệt có ý nghĩa UTNMM NMMBT (p < 0,001) (Bảng 3.2) 16 Bảng 3.2 Biểu E-cadherin UTNMM so với NMMBT Ung thư Bình thường Biểu E-cadherin N=130 N=111 p số ca (%) số ca (%) Tỉ lệ % E-cad 94,9 (13,5) 99,6 (1,7) 0,05) b Keratin ung thư niêm mạc miệng Hầu hết tế bào ung thư protein keratin nên biểu keratin bị giảm nhiều, đa số UTNMM (93,1%) biểu K4 30% (độ 3); có ca (6,1%) biểu K4 từ 30-50% (độ 2), ca (0,8%) bảo tồn 90% K4 (độ 1) c So sánh biểu keratin ung thư với NMMBT Tỉ lệ mức độ biểu keratin UTNMM khác biệt có ý nghĩa so với NMMBT (p < 0,001) (Bảng 3.4) Tỉ lệ trung bình keratin dương tính NMMBT 94,1%, bị giảm nhiều UTNMM trung bình 6,3%, trung vị 0% (p < 0,001) Phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ biểu keratin UTNMM độc lập, không bị ảnh hưởng tỉ lệ biểu K4 NMMBT (p > 0,05) 18 Bảng 3.4 Biểu keratin ung thư so với NMMBT Ung thư Bình thường Biểu keratin p N=130 N=111 Tỉ lệ % keratin 6,3 (12,7) 94,1 (8,4) Trung bình (độ lệch chuẩn) 75%) A Vimentin dương tính độ (số hồ sơ 12764/15) B Vimentin dương tính độ (số hồ sơ 20632/14) Hình 3.4 Biểu vimentin ung thư niêm mạc miệng 3.3.2 Liên quan biểu vimentin với lâm sàng, giải phẫu bệnh ung thư Biểu vimentin UTNMM khác biệt theo giới tính, tuổi, thói quen nguy cơ, vị trí kích thước ung thư nguyên phát, tình trạng di hạch giai đoạn ung thư (p < 0,05) Tuy nhiên, có khác biệt có ý nghĩa thống kê biểu vimentin theo độ ác tính mơ học ung thư (p < 0,001) Grad mô học cao, biểu vimentin cao Biểu vimentin tăng dần từ 34% nhóm grad đến 52% nhóm grad cao 90% nhóm grad 3.4 Liên quan dấu ấn EMT ung thư niêm mạc miệng Mối liên quan dấu ấn EMT đánh giá tổn thương UTNMM cách sử dụng hệ số tương quan với biểu keratin 4, E-cadherin sau laminin 332 làm chuẩn Với keratin làm chuẩn, biểu keratin không liên quan với biểu Ecadherin, laminin 332 vimentin (p > 0,05) (Bảng 3.8) 24 Bảng 3.8 Liên quan biểu keratin với E-cadherin, laminin, vimentin ung thư niêm mạc miệng UTNMM E-cadherin Độ Độ Laminin Độ Độ Độ Độ Vimentin Độ Độ Độ Độ 3/4 Độ Keratin Độ 0,356 Tương quan Spearman R 0,08 0,197 0,19 0,959 0,11 p Độ (0) (0,9) (11,1) (4,5) 16 (88,9) 106 (94,6) (0) (3,0) (0) (0) (14,3) (9,1) (4,8) (0) (85,7) 29 (87,9) 60 (95,2) 27 (100) (1,4) (0) (0) (0) (7,2) (3,0) (5,6) (0) 63 (91,3) 32 (97,0) 17 (94,4) 10 (100) Kiểm định xác Fisher Khi sử dụng E-cadherin làm chuẩn để so sánh, biểu Ecadherin UTNMM khơng có mối liên quan với biểu laminin 332 bào tương liên quan có ý nghĩa với biểu vimentin với tương quan nghịch (p < 0,05); nhiên, hệ số tương quan Spearman thấp (R = - 0,2) (Bảng 3.9) Bảng 3.9 Liên quan E-cadherin với laminin, vimentin ung thư UTNMM Laminin 332 Độ Độ Độ Độ Vimentin Độ Độ Độ Độ E-cadherin Độ Độ (28,6) (9,1) 11 (17,5) (7,4) (71,4) 30 (90,9) 52 (82,5) 25 (92,6) (7,2) (18,2) (33,3) (10) 64 (92,8) 27 (81,8) 12 (66,7) (90) 0,292 Tương quan Spearman R 0,05 0,029 -0,20 p 25 Kiểm định xác Fisher Với laminin 332 làm chuẩn để so sánh cho thấy có mối tương quan thuận biểu laminin 332 bào tương biểu vimentin (p < 0,05); nhiên, hệ số tương quan Spearman không cao (R = 0,3) (Bảng 3.10) Bảng 3.10 Liên quan biểu laminin 332 vimentin ung thư Vimentin Ung Tương quan p thư Spearman R Độ Độ Độ Độ 3/4 Laminin 0,045 0,30 Độ (71,4) (28,6) (0) (0) Độ 22 (66,7) (18,2) (15,2) (0) Độ 34 (54,0) 18 (28,6) (9,5) (7,9) Độ (29,6) (25,9) (25,9) (18,5) Kiểm định xác Fisher KẾT LUẬN Biểu hai dấu ấn biểu mô E-cadherin keratin ung thư, loạn sản niêm mạc miệng bình thường; phân tích liên quan với lâm sàng giải phẫu bệnh • Biểu E-cadherin: Tỉ lệ biểu E-cadherin UTNMM 94,9% (13,8% độ 86,2% độ 1); LSNMM 98,8% (4,5% độ 95,5% độ 1); NMMBT 99,6% (100% độ 1) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Trong loạn sản biểu mô miệng, tỉ lệ biểu E-cadherin giảm có ý nghĩa mức độ biểu bảo tồn gần tương đương với NMMBT Trong đó, UTNMM có tỉ lệ mức độ biểu Ecadherin giảm nhiều so với NMMBT Giảm biểu E-cadherin liên quan với tăng độ ác tính mơ học ung thư Ung thư có độ ác tính mơ học cao giảm biểu Ecadherin • Biểu keratin 4: Tỉ lệ biểu keratin UTNMM 7% với mức độ 2,3% độ 1; 7,7% độ 90% độ 3; loạn sản 23,3% với 2,3% độ 1; 38,6% độ 59,1% độ khác biệt có ý nghĩa so với NMMBT biểu tỉ lệ 94,1% 100% độ 26 Biểu keratin giảm nhiều UTNMM so với NMMBT Nhuộm hóa mơ miễn dịch keratin giúp phân biệt mơ niêm mạc miệng lành - ác mặt sinh học cách khách quan rõ ràng, giúp nhận diện ranh giới niêm mạc miệng bình thường ung thư để xác định rìa phẫu thuật có an tồn hay khơng Keratin giảm biểu rõ loạn sản, cho dù loạn sản nhẹ, khác biệt có ý nghĩa so với NMMBT Do đó, keratin dấu ấn sinh học khách quan giúp phân biệt loạn sản với biểu mơ miệng bình thường Khi biểu keratin dương tính giảm nhiều cịn 30% (độ 3) gợi ý khả loạn sản nặng, ngược lại keratin 70% (độ 1) gợi ý niêm mạc miệng bình thường, keratin từ 30 - 69% (độ 2) thường loạn sản nhẹ vừa Kết gợi ý bất thường K4 xảy sớm trình sinh ung thư Biểu keratin khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê theo yếu tố lâm sàng độ ác tính mơ học UTNMM cho thấy tính qn tình trạng biểu K4 UTNMM, gợi ý K4 dấu ấn sinh học chẩn đốn UTNMM có tính độc lập cao – tuổi, giới, thói quen nguy cơ, vị trí, giai đoạn lâm sàng độ ác tính mơ học ung thư; thành ung thư K4 khơng bị ảnh hưởng yếu tố tình trạng di hạch, giai đoạn ung thư Sự định K4 yếu tố thuận lợi để nhận diện ung thư cho dù tình Biểu dấu ấn màng đáy laminin 332 UTNMM phân tích liên quan với lâm sàng giải phẫu bệnh Đa số (80%) UTNMM giảm và/hoặc không biểu laminin màng đáy quanh đám tế bào ung thư, bao gồm 62% có màng đáy khơng liên tục 18% khơng có màng đáy Giảm biểu laminin màng đáy liên quan với tăng độ ác tính mơ học ung thư: laminin dương tính 94,6% nhóm grad 1, giảm cịn 73% nhóm grad thấp 60% nhóm grad Tỉ lệ trung bình biểu laminin 332 bào tương tế bào ung thư 31,7%, với mức độ biểu hiện: 5% độ 0; 25% độ 1; 49% độ 21% độ Biểu laminin bào tương tăng dần theo độ ác tính mơ học ung thư: từ 64,2% nhóm grad đến 70,3% grad cao 90% grad 3 Biểu dấu ấn trung mô vimentin UTNMM phân tích liên quan với lâm sàng, giải phẫu bệnh 27 Tỉ lệ ung thư tế bào gai niêm mạc miệng biểu dấu ấn trung mô vimentin dương tính 47%, chủ yếu mức độ yếu (25% độ 1) vừa (14% độ 2), gặp dương tính mạnh (7% độ 1% độ 4) Biểu vimentin liên quan với độ ác tính mơ học ung thư: biểu vimentin dương tính (> 5%) tăng dần từ 34% nhóm grad 1, đến 52% nhóm grad 2, cao 90% nhóm grad Liên quan biểu bốn dấu ấn EMT UTNMM Có tương quan nghịch biểu E-cadherin vimentin UTNMM Giảm biểu dấu ấn biểu mô E-cadherin tăng biểu dấu ấn trung mơ vimentin tế bào gai ác tính cho thấy dấu hiệu q trình EMT UTNMM Có mối tương quan thuận biểu laminin 332 bào tương biểu vimentin UTNMM Qua khảo sát hóa mơ miễn dịch với danh sách kháng thể bao phủ tồn phổ chuyển dạng biểu mơ – trung mô (EMT) bao gồm E-cadherin, keratin 4, laminin 332 vimentin, nghiên cứu cung cấp chứng diện chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) carcinôm tế bào gai niêm mạc miệng người Việt Nam với giảm biểu dấu ấn biểu mô E-cadherin, keratin tăng biểu dấu ấn trung mô vimentin Tỉ lệ cao 50,8% ung thư niêm mạc miệng đạt kiểu hình EMT, 40,8% kiểu hình EMT phần 10% kiểu hình EMT hoàn toàn KIẾN NGHỊ Dựa vào kết nghiên cứu, chúng tơi xin có số kiến nghị sau: Nhuộm hóa mơ miễn dịch keratin xét nghiệm chẩn đoán khách quan hữu dụng, ứng dụng giúp chẩn đốn sớm loạn sản hỗ trợ thêm thơng tin chẩn đốn mức độ loạn sản, đồng thời giúp phân biệt rõ mơ ung thư với mơ bình thường để xác định diện cắt phẫu thuật đủ rộng an toàn từ định hướng điều trị phù hợp Tiếp tục nghiên cứu UTNMM với qui mô lớn hơn, theo dõi sau điều trị nhằm xác định ứng dụng giá trị chẩn đoán tiên lượng dấu ấn EMT, đặc biệt keratin thực tế lâm sàng, phát triển liệu pháp nhắm trúng đích ngăn chặn can thiệp vào q trình EMT ung thư để phịng ngừa điều trị xâm lấn di ung thư Đây nghiên cứu loạn sản biểu mơ miệng Việt Nam, cần tiếp tục nghiên cứu loạn sản người không ung thư nghiên cứu dấu ấn EMT loạn sản ... vimentin, nghiên cứu cung cấp chứng diện chuyển đổi biểu m? ?- trung mô (EMT) carcinôm tế bào gai niêm mạc miệng người Việt Nam với giảm biểu dấu ấn biểu mô E-cadherin, keratin tăng biểu dấu ấn trung mô. .. trị tế bào ung thư Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu chuyển đổi biểu m? ?- trung mô (EMT) ung thư niêm mạc miệng Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt... mạc miệng bình thường 1: Màng tế bào; Vị trí biểu Danh định 2: Bào tương; biểu mô 3: Màng đáy Tỉ số tế bào biểu mô nhuộm miễn dịch dương Tỉ lệ biểu (%) Liên tục tính tổng số tế bào biểu mô đếm