Ứng dụng của sinh học phân tử trong y học pptx

Phát hiện đột biến ở mức DNA : a Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLPs:  Phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA đựơc th

Sinh viên thực hiện:

Đỗ Phong LưuNguyễn Thị Hoa Thùy

Giáo viên hướng dẫn :

Trần Thị Dung

I KHÁI QUÁT CHUNG

 SHPT là ngành khoa học khảo cứu ở mức độ

phân tử cấu trúc của sinh vật, cơ chế hoạt động và điều tiết, sự tác dụng hỗ tương của các phân tử

này.

 Với những tiến bộ về kỹ thuật trong những năm gần đây, với sự đóng góp đắc lực của các máy tính, SHPT trở thành ngành "mũi nhọn" của sinh học

và y học.

II MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN

THƯỜNG GẶP

1 Bệnh Tay-sachs :

 Ðây là bệnh di truyền, thường gặp ở người châu Âu,

do thiếu gen mã hóa tổng hợp enzym

hexozaminidaza A có tác dụng phân hủy gangliozidGM2

 Do không có enzym phân hủy, Gangliozid GM2

tích lũy và ứ đọng gây ra hiện tượng chậm phát

triển, rối loạn tâm thần, mù lòa, tai biến ngập máu

và tử vong

II MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƯỜNG GẶP

2 ) Bệnh Huntington :

 Là một bệnh di truyền của hệ thần kinh trung ương,

thường biểu hiện ở tuổi từ 25 đến 55.

 Triệu chứng ban đầu, cử động vô thức và rối loạn thăng bằng Khi bệnh nặng lên, các chức năng sống như ngôn ngữ và đi lại có thể bị sút giảm.

 Bệnh Huntington liên quan đến phiên bản đột biến của protein huntingtin - kiểm soát việc sản sinh yếu tố hướng thần kinh của não (BDNF)

 Những bệnh nhân có protein huntingtin đột biến không thể sản sinh được lượng BDNF thích hợp, dẫn đến thoái hóa não.

II MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƯỜNG GẶP

3.Bệnh Thalassemia :

 Là bệnh lý thiếu máu di truyền thường gặp nhất tại Việt nam và các quốc gia vùng Đông Nam Á, Địa Trung Hải

 Đây là bệnh lý di truyền do sự thiếu hụt tổng hợp một

chuỗi globin trong huyết sắc tố của hồng cầu Hồng cầu bệnh nhân không bền, bị phá huỷ sớm làm bệnh nhân bị thiếu máu và ứ sắt

 người bệnh bị thiếu máu, da nhợt, màu

xanh lục, mu bàn tay nhiễm sắc tố nâu,

lách rất to, đôi khi gan to, có hiện tượng rối loạn loãng xương.

Hồng cầu bị biến dạng trong bệnh Thalassemia

II MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƯỜNG GẶP

4) Bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm :

 Bệnh do đột biến gen trên NST thường (đột biến gen mã hóa chuỗi Hbß): thay thế cặp A-T bằng cặp T-A làm cho

bộ ba XTX (axit Glutamic) bị biến đổi thành XAX (Valine) trong gen Hbß, làm biến đổi HbA > HbS

 HbS ở trạng thái khử ôxi kém hòa tan và kết tủa tạo nên hồng cầu có dạng hình lưỡi liềm, có thời gian tồn tại ngắn dẫn đến thiếu máu.

Hồng cầu hình liềm

Cơ chế gây đột biến hồng cầu hình liềm

Hồng cầu hình liềm gây nghẽn mạch máu

 Bệnh DMD xảy ra khi 1 gen trên NST X không mã hóa

sinh ra protein dystrophin Còn người bị bệnh BMD có 1 ít dystrophin nhưng không đủ hoặc có nhưng chất lượng

kém.

Cấu tạo của 1 bó cơ

Cơ chế gây bệnh loạn dƣỡng cơ Duchenne và Becker

II MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƯỜNG GẶP

6) Hội chứng X không bền :

 Đây là bệnh di truyền chậm phát triển tâm thần hay gặp nhất ở người Capcaz, ngoài ra có cả ở người Nhật, Trung Quốc, ấn Độ, châu Phi

 Bệnh di truyền liên kết giới tính, liên quan đến vùng không được phiên dịch 5' của exon 1 của gen FMR-1 (Fragile X Mental Retardation 1)

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH

DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở

MỨC ĐỘ PHÂN TỬ

1 Điện di protein (protein electrophoresis) :

 Điện di protein đã được dùng để phát hiện các

biến dị amino acid trên hàng trăm loại protein người

 Điện di protein chỉ cho phép phát hiện chỉ

khoảng một phần ba các đột biến xảy ra trên các codon của DNA.

Kỹ thuật điện di Protein

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI

TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ

2 Phát hiện đột biến ở mức DNA :

a) Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giới hạn

(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLPs):

 Phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA đựơc thực hiện thông qua vai trò của các enzyme giới hạn (được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhằmngăn chặn sự xâm nhập của các DNA lạ bằng cách cắt nhỏ những DNA này).

 Các DNA lạ sẽ được cắt tại những vị trí đặc hiệu trên DNA

được gọi là những vị trí ghi nhận hay vị trí giới hạn

 Ví dụ: Ở Escherichia coli

có một enzyme giới hạn EcoRI ghi nhận một đoạn DNA có trình tự GAATTC

Hình : Cắt DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI

 Để quan sát được các đoạn DNA giới hạn người ta đã thực hiện kỹ thuật :

xơ nang (cystic fibrosis) v.v

Kỹ thuật phát hiện tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA

giới hạn

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC

ĐỘ PHÂN TỬ

2 Phát hiện đột biến ở mức DNA :

b)Sự đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (Variable

Number of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR)

 Một vùng DNA tiểu vệ tinh có thể lặp 2, 3 lần hoặc lên đến trên 20 lần lặp Số lượng này thay đổi rất lớn từ người này qua người khác tạo ra nhiều biến dị di truyền trong quần thể

 gọi là số lượng dao động của các đoạn lặp nối tiếp

(variable number of tandem repeats: VNTRs)

 Các VNTR được phát hiện bằng kỹ thuật tương tự kỹ thuật dùng để phát hiện các RFLP

 Sự đa hình của các vị trí giới hạn chỉ cho phép phát hiện các biến dị dựa vào sự có mặt hoặc vắng mặt của các vị trí giói hạn (chỉ có 2 allele) thì các VNTR cho phép phát hiện các biến dị thông qua sự khác nhau về số lƣợng của các đoạn lặp giữa hai vị trí giới hạn (có thể có > 2 allele)

 Các DNA vi vệ tinh (short tandem repeat-STR-các đoạn lặp ngắn) cũng có những biến dị trong chiều dài

do kết quả của sự khác nhau trong số lần lặp.Mỗi

đoạn lặp ngắn như vậy có thể lặp đi lặp lại hàng trăm lần

 Tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (short

tandem repeat polymorphism: STRP) khác với các VNTR ở kích thước của đoạn lặp và chúng được phân lập không phải thông qua các vị trí giới hạn nằm cạnh các đoạn lặp mà thay vào đó là bằng kỹ thuật PCR.

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN

TỬ

2 Phát hiện đột biến ở mức DNA :

c) Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR

 Kỹ thuật PCR cho phép nhân một đoạn DNA đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn kb hoặc ngắn hơn) một cách

nhanh chóng thành hàng triệu bản sao giống hệt nhau tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA.

 Quá trình thực hiện PCR đòi hỏi các thành phần sau:

 Hai đoạn mồi (primer)

 DNA polymerase

 Một lượng lớn các nucleotìde tự do

 DNA từ một cơ thể sinh vật cần nghiên cứu

 PCR là một quá trình bao gồm ba bước cơ

bản:

 Tách cấu trúc kép

DNA bằng nhiệt độ cao

 Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp

 Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian Kết quả là tạo ra các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về trình tự

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI

TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ

2 Phát hiện đột biến ở mức DNA :

d) Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing)

 Cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene,

chức năng của gene, mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết.

 Kỹ thuật xác định trình tự của DNA là phương pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick

Sanger đưa ra.

Kỹ thuật xác định trình tự Nucleotide của DNA bằng

cách sử dụng phương pháp dideoxy

III) MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở

MỨC ĐỘ PHÂN TỬ

2 Phát hiện đột biến ở mức DNA :

e ) Chip DNA (DNA chip)

 Là kỹ thuật mới để phát hiện các đột biến đặc hiệu

với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân

tích đột biến bằng vi tính.

 Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide (gồm

các DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình

tự mang các đột biến gây bệnh đã biết) đóng vai trò

của các đoạn dò (probe) được máy cài lên một phiến

kính nhỏ.

 Mỗi phiến kính nhƣ vậy với diện tích khoảng 1cm 2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại

oligonucleotide khác nhau.

 Các oligonucleotide đƣợc đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA đƣợc gắn huỳnh quang của một đối tƣợng Quá trình lai xảy ra nếu có một oligonucleotide

có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA của đối tƣợng Ví trí phát huỳnh quang trên chip sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên chip

Sơ đồ minh họa một chip DNA

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

 Di truyền y học đã sử dụng các phương pháp và kĩ thuật hiện đại để chẩn đoán chính xác các tật,

bệnh di truyền, như sử dụng đánh dấu di truyền, các enzim chẩn đoán bệnh, kĩ thuật chọc ối chẩn đoán trước khi sinh, kết hợp với các phân tích hoá sinh nước ối, chuẩn đoán bằng DNA phôi thai

trong máu mẹ, PCR, real-time PCR, kỹ thuật cắt đoạn đa dạng (RFLP), phương pháp Southern

Blot,…

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

1 Chẩn đoán trước sinh

 Mục tiêu chính: cung cấp cho các gia đình có nguy cơ các thông tin cần

thiết để họ có thể lựa chọn trong quá trình mang thai.

 Những lợi ích của chẩn đoán trước sinh:

 Tái khẳng định cho các gia đình có nguy cơ yên tâm khi kết quả chẩn

1) Chuẩn đoán trước sinh :

Các test trong chuẩn đoán trước sinh :

Test sàng lọc :

 Độ chính xác không lớn

 Giá thành thấp

 Dễ thực hiện

 Cho phép thực hiện trên một lượng lớn cá thể

 Một kết quả bất thường của test sàng lọc sẽ chỉ

định cho các test chuẩn đoán tiếp theo

 Ví dụ : Theo đánh giá anpha – Fetoprotein (AFP) trong máu mẹ vào tuần thứ 15 của thai kỳ để sàng lọc các trường hợp bất thường ống thần kinh của thai nhi

Test chẩn đoán :

 Test chẩn đoán được sử dụng để chẩn đoán

xác định các trường hợp nghi ngờ mang bất

thường.

 Ví dụ : Thực hiện test chẩn đoán bằng nuôi

cấy tế bào nước ối đối với những sản phụ từ 35 tuổi trở lên để phát hiện các trường hợp thai nhi mắc trisomy.

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

 Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh hiện nay

Hiện nay có nhiều phương pháp khả thi

chẩn đoán sớm như: siêu âm, test sàng lọc bộ ba (triple test)

Phương pháp can thiệp như: chọc hút nước ối, nuôi cấy tế bào nước ối

Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu sinh, y, dược học (Học viện Quân y) vừa nghiên cứu thành công phương pháp chẩn đoán trước sinh từ tuần thứ 7 của thai kỳ bằng ADN phôi thai trong máu mẹ.

Một số bệnh đã được chẩn đoán trước sinh :

 Hội chứng Down:

Được thực hiện từ cuối năm 1999

Kỹ thuật sử dụng là định lượng real-time PCR Kết quả này đã mở ra việc chẩn đoán trước sinh bệnh Down Sự phát hiện ra ADN phôi lưu hành trong máu mẹ còn hứa hẹn được áp dụng trong chẩn

đoán trước sinh một số bệnh di truyền khác Từ tuần thai thứ 7 đã có ADN phôi trong máu của

người mẹ

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

 Bệnh Duchene:

Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR với 14 bộ primer

để phân tích ADN trong bệnh này Nghiên cứu cho thấy 63% có khuyết đoạn gen Hai điểm bệnh lý là ở exon 8-9 và exon 44-51

Kỹ thuật cắt đoạn đa dạng (RFLP) được sử dụng để phát hiện người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh

IV CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN

 RhD của phôi thai:

Sử dụng kỹ thuật PCR huỳnh quang để phát hiện gen RhD chỉ trên một tế bào lấy từ ADN máu mẹ.

Phát hiện này rất quan trọng để điều trị trước sinh những thai phụ nhạy cảm với RhD khi đối tác

là dị hợp tử gen RhD Bố mẹ có thể yên tâm là thai không có nguy cơ nếu nó RhD (-) Nếu phôi RhD (+) thì tiến hành điều trị.

 Bệnh phenylceton niệu (PKU):

Là bệnh di truyền thiếu enzym phenylalanin hydroxylase (PAH), do có biến dị ở 4 exon 7, 10,

11, 12 của gen điều khiển việc sản xuất PAH Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh bao gồm PCR-SSCP kết hợp với nhuộm bạc để phát hiện các biến dị ở gen này.

 Hội chứng X không bền:

Nǎm 1991, các nhà khoa học đã xác định được locus X không bền, từ đó phát triển kỹ thuật chẩn đoán ADN Bây giờ, đã chẩn đoán trước sinh và

cho cả những bà mẹ mang gen, sử dụng các kỹ

thuật lai tạo Phương Nam (Southern

hybridization) và PCR để phát hiện đột biến của X không đều.

 Chẩn đoán trước sinh một số bệnh di truyền,

chuyển hóa khác :

Buys (Hà Lan) mới công bố công trình nghiên cứu phát hiện trước sinh và người mang gen bệnh

ứ đọng glycogen týp 1a (bệnh Von Gierke) do

thiếu enzym glucose-6-phosphatase.

Cao và cộng sự (ý) đã rất thành công trong việc chẩn đoán trước sinh người mang gen di truyền dị hợp tử bệnh b -thalassemia ở đảo Síp và Sardinia bằng kỹ thuật phân tử, khiến cho tỉ lệ sinh trẻ em mắc bệnh b -thalassemia đồng hợp tử hạ xuống

gần bằng 0.

Các nhà khoa học Anh, Mỹ đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến D F508 trong bệnh xơ nang, với độ đặc hiệu 100%.

2 Chẩn đoán phân tử sơ sinh

Có một số bệnh di truyền đƣợc chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử ngay từ khi đứa trẻ mới ra đời:

_ Các công trình nghiên cứu ở Anh, ý, Tây Ban Nha đã nêu lên giá trị của kỹ thuật ADN phát hiện bệnh tǎng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu

enzym 21-hydroxylase ở trẻ sơ sinh Kỹ thuật

đƣợc sử dụng là Nested PCR đã phát hiện thấy

đột biến mất 8bp EX3 của gen hoạt động CYP

21B.

Nested PCR Reaction

Diagram

V TƢ VẤN DI TRUYỀN

1 ) Mục đích của công tác tư vấn di truyền

 Cung cấp những thông tin trong lĩnh vực y học bao gồm chẩn đoán, diễn biến của bệnh, các

phương tiện hỗ trợ và điều trị hiện có.

 Cung cấp những thông tin về khả năng di truyền của bệnh, nguy cơ tái phát

 Giúp lựa chọn những biện pháp thích hợp với

nguy cơ của bệnh, mục đích của gia đình bệnh

nhân, phù hợp với các tiêu chuẩn về đạo đức, tôn giáo của gia đình.

 Thực hiện những biện pháp can thiệp tốt nhất trong khả năng cho phép đối với người bệnh

2 ) Các chỉ định cho công tác tư vấn di truyền :

 Trước đây gia đình đã có một trẻ với nhiều dị tật bẩm sinh, chậm phát triển trí tuệ hoặc một dị tật chính

 Có tiền sử gia đình đối với một bệnh di truyền

 Chẩn đoán trước sinh trong trường hợp mẹ lớn tuổi hoặc những chỉ định khác.

 Tình trạng hôn nhân đồng huyết.

 Vô sinh hoặc sẩy thai liên tiếp.

 Một bệnh lý di truyền hoặc bất thường mới được chuẩn đoán.

3 ) Ngăn ngừa sự tái phát trong gia đình :

Tư vấn di truyền được thực hiện cả trước và sau các xét nghiệm trên để giúp định hướng trong việc thực hiện các xét nghiệm di truyền và phiên giải các kết quả xét nghiệm đó.

Nếu các bố mẹ có kế hoạch không có thêm con

hoặc không có con, việc ngừa thai và triệt sản là những biện pháp được lựa chọn

Nếu bố mẹ quyết định chấm dứt thai kỳ họ cần được tư vấn đầy đủ và theo dõi sau khi thực hiện quyết định này.

TÀI LIỆU KHAM KHẢO

Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long Chú giải Di

D Clark, Molecular Biology (Elsevier, 2005)

Giáo trình di truyền y học – Trường Đại Học Y Huế

Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương – NXB Giáo Dục – 2003.