Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 53B, 2021 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH VÀ BÁN MÃN TÍNH CỦA CHIẾT XUẤT ETANOL HÀNH ĐEN (Allium ascalonicum L.) TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh tranthiphuongnhung@iuh.edu.vn Tóm tắt Hành đen, sản phẩm chế biến từ hành tím (Allium ascalonicum L.), có nhiều đặc tính dược lý sinh học Trong hành đen chứa terpenoid, saponin, tannins hợp chất phenolic thể tính kháng sinh khả chống lại tế bào ung thư Trong nghiên cứu này, độc tính chiết xuất ethanol hành đen (EtAA) khảo sát Trong thử nghiệm độc tính cấp tính, chuột sử dụng EtAA (1000, 3000, 5000 7000 mg/kg) liên tục ngày theo dõi đến ngày thứ 14 Thử nghiệm độc tính mãn tính, chuột liên tục sử dụng EtAA (100, 200, 300 400 mg/kg) 12 tuần Trong động vật đối chứng cho uống nước cất Trọng lượng thể, lượng thức ăn nước tiêu thụ vật theo dõi hàng ngày Ngoài ra, thơng số sinh hóa máu, huyết học, trọng lượng thể mô bệnh học nội tạng chúng đo thời điểm quan sát cụ thể Kết thử nghiệm độc tính cấp tính bán mãn tính khơng ghi nhận trường hợp tử vong EtAA không gây bất thường đáng kể thông số sinh lý thay đổi bệnh lý quan chuột EtAA an toàn liều lượng nghiên cứu khơng gây độc cấp tính mãn tính mơ hình động vật Từ khóa: EtAA, Allium ascalonicum L., hành đen, độc tính cấp, độc tính bán mãn tính EVALUATION OF ACUTE AND SUB-CHRONIC TOXICITY OF THE ETHANOL EXTRACT OF BLACK SHALLOT (Allium ascalonicum L.) IN SWISS ALBINO MOUSE Abstract Black shallot, the new processing product from shallot (Allium ascalonicum L.), possesses many pharmacological and biological properties Black shallot contains terpenoids, saponins, tannins and phenolic compounds that exhibit antibiotic properties and resistance to cancer cells In this study, the toxicity profile of ethanolic extract of black shallot (EtAA) was investigated In acute toxicity tests, mice were administered with EtAA (1000, 3000, 5000 and 7000 mg/kg), for 14 days In the sub-chronic toxicity test, for 12 weeks, the experimental animals were given EtAA (100, 200, 300 and 400 mg/kg) On the other hand, control animals were fed distilled water The animals’ body weight, food and water consumptions were monitored weekly In addition, their biochemical and hematological parameters, histopathology, and body and organ weights were all measured at specific observation time points According to the results of the acute toxicity and sub-chronic test, no mortality was found, EtAA did not cause significant abnormalities in the physiological parameters or pathological changes in the major organs of the rats These results indicate that EtAA is safe at the studied dosage levels and causes no acute or chronic toxicity in animal models Keywords: EtAA, Allium ascalonicum L., black shallot, acute toxicity, sub-chronic toxicity GIỚI THIỆU Y học cổ truyền có lịch sử lâu dài việc cải thiện sức khỏe người Dược liệu thiên nhiên đa dạng phong phú nguồn tài nguyên quý giá để khám phá thêm loại thuốc Trong năm gần đây, có nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh tính hiệu việc chữa bệnh thảo dược Chính vậy, lượng lớn công chúng quan niệm sản phẩm y học cổ truyền an tồn chúng bào chế từ nguồn vật liệu tự nhiên [1] lịch sử lâu dài chúng điều trị bệnh [2] Tuy nhiên, thực tế cho thấy nhiều loại dùng y học cổ truyền thành phần có chứa chất có khả gây độc, gây đột biến ung thư [2,3,4,5] axit aristolochic thuộc họ Aristolochia có khả gây ung thư, suy thận, bệnh đường tiết niệu người [6] Một số loại thuốc truyền thống có chứa thành phần độc hại axit aristolochic, pyrrolizidine alkaloids, benzophenanthrine alkaloids, lectin, viscotoxin, glycoside cyanogenic, furanocoumarins có khả gây chết người [7] Những tác dụng phụ làm dấy lên lo ngại tính an tồn thảo dược Vì vậy, loại thảo © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH VÀ BÁN MÃN TÍNH CỦA CHIẾT XUẤT ETANOL HÀNH ĐEN (Allium ascalonicum L.) TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO 25 dược trước sử dụng điều trị bệnh cần khảo sát nghiêm ngặt độc tính WHO kêu gọi khẩn trương thiết lập tiêu chuẩn để đánh giá tính an tồn thảo dược trước sử dụng [8] Đánh giá dược lý độc tính điều cần thiết cho phát triển tiêu chuẩn hóa loại thảo dược [9,10] Vì an tồn, thảo dược cần thử nghiệm độc tính in vitro, sau sử dụng mơ hình động vật để kiểm tra lâm sàng Hành tím (Allium ascalonicum L.) loại gia vị tiếng nguồn cung cấp cacbonhydrat, vitamin A, B, C, kaempferon, catechin tannin Sự diện hợp chất hoạt tính sinh học hành tím giải thích lợi ích sức khỏe chống ung thư, chống béo phì, chống vi khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, thận [11] Gần đây, hành đen, sản phẩm chế biến hành tím, phát triển thơng qua q trình lên men buồng điều chỉnh nhiệt độ độ ẩm MorenoRojas cộng (2018) tìm thấy flavonoid, organosulfur, amino acids hợp chất khác thành phần hóa thực vật hành đen [12] Một số hoạt tính sinh học hành đen đặc tính chống oxy hóa, chống ung thư chống viêm báo cáo nghiên cứu trước [13] Mặc dù số tác giả báo cáo tác dụng dược lý hành đen, nhiên độ an toàn in vivo chúng chưa xác định Do đó, mục đích báo nghiên cứu độc tính cấp tính bán mãn tính EtAA chuột Swiss albino để khảo nghiệm tính an tồn chiết xuất hành đen Từ sử dụng chiết xuất tiếp tục nghiên cứu ứng dụng điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm gan, viêm dày… NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thực vật Hành tím (Allium ascalonicum L.) thu hái thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng vào tháng năm 2019 mẫu chứng lưu giữ Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Hành tím rửa nước máy bóc vỏ, sau ủ buồng kín (75oC, độ ẩm tương đối 90%) 20 ngày [14] Chiết xuất hành đen (EtAA) sản xuất theo Tran cộng (2020) [13] Hành đen cắt lát ngâm với thể tích dung dịch ethanol 98% ngày, lặp lại hai lần Dịch chiết xuất lọc giấy Whatman Dịch lọc cuối ngưng tụ máy cô quay chân không (IKA- Đức) áp suất giảm (130 mmBar), 60oC Dư lượng ethanol chiết xuất loại bỏ thông qua thăng hoa sấy khơ (Hình 1) Sau chiết xuất hành đen (EtAA) bảo quản 4oC sử dụng tiếp [13] Hình Hành đen, sản phẩm chế biến từ hành tím, màu nâu sẫm, vị 2.2 Phân tích hóa học: Sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học EtAA theo kỹ thuật chung bao gồm terpenoid (xét nghiệm Salkowski), saponin (thử nghiệm froth), alkaloid (thử nghiệm Dragendor Mayer) [15], tannin (phân tích Makkar 1993 Porter 1986), steroid (xét nghiệm Sofowora), flavonoid (xét nghiệm Evans 2002) [16,17] Carbohydrates (thử nghiệm Molishs Bial’s) Proteins (thử nghiệm Biuret) Phenolics (thử nghiệm EtSI + lead acetate + water, Potassium dichromate) Terpenoids (thử nghiệm EtSI + Cloroform + H2SO4 đậm đặc) [18] Flavones, Xanthones (th nghim Fortaleza: Ediỗừes EUF) [19] 2.3 ng vt thớ nghiệm: Chuột nhắt trắng Swiss albino (18-20 g) Viện Pasteur Tp HCM cung cấp Lồng nuôi chuột làm kính, kích thước 15cm x 30cm Máng treo inox móc vào thành lồng để đựng thức ăn nước uống Các lồng đặt nhà nuôi tiêu chuẩn với chu kỳ sáng/tối 12h/12h, nhiệt độ (24 ±1°C) suốt thời gian thử nghiệm Nước uống chứa bình có vịi uống, sử dụng thức ăn viên nhân tạo dành cho động vật gặm nhấm Quy trình thử nghiệm tiến hành theo hướng dẫn chung NIH Chăm sóc Sử dụng Động vật Phịng thí nghiệm [20] 60 chuột đực sử dụng cho thử nghiệm độc © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 26 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH VÀ BÁN MÃN TÍNH CỦA CHIẾT XUẤT ETANOL HÀNH ĐEN (Allium ascalonicum L.) TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO tính cấp tính bán mãn tính (6 chuột/nhóm) Chuột thí nghiệm ni tuần để thích ứng với điều kiện sống trước bắt đầu quy trình thí nghiệm Quy trình thử nghiệm tn thủ nghiêm ngặt theo Tuyên bố Helsinki (1975) [21] Hình Hệ thống ni chuột thí nghiệm (A Lồng ni chuột thí nghiệm; B Mơ hình thử độc tính bán mãn tính) 2.4 Nghiên cứu độc tính: Nghiên cứu thiết kế dựa khuyến nghị Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Chúng thực theo hướng dẫn đánh giá độc tính thảo dược trình bày “Hướng dẫn chung phương pháp nghiên cứu đánh giá y học cổ truyền” hướng dẫn Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) nghiên cứu xử lý động vật [22] Các khuyến nghị tuân theo số lượng giới tính động vật sử dụng [23] Tất thí nghiệm lặp lại lần Thử độc tính cấp tính: Nghiên cứu độc tính cấp tính EtAA thực phương pháp thử nghiệm 'Lên Xuống' chuột Swiss albino theo hướng dẫn Tổ chức Phát triển Kinh tế (OECD) 425 [24] 30 chuột sử dụng để thử nghiệm độc tính cấp tính Trước nghiên cứu độc tính cấp tính, chuột cân nhịn ăn qua đêm Chuột phân chia vào nhóm thử nghiệm: Nhóm chứng uống nước bình thường Các nhóm uống EtAA chuột uống EtAA nồng độ 1000, 3000, 5000, 7000 mg nguyên liệu khô/kg thể trọng [25] Chất chiết xuất sử dụng đường miệng với liều nhất/ngày Da, lông, mắt, vận động xương, dấu hiệu tuần hoàn, hệ thống thần kinh, nhịp hơ hấp hành vi có ý thức động vật quan sát hàng ngày Trọng lượng thể đo tuần lần Các động vật thử nghiệm uống EtAA ngày liên tục quan sát đến ngày thứ 14 Trước phẫu thuật động vật thí nghiệm gây chết hít khí CO2 [26] Thử độc tính bán mãn tính: Tổng cộng 30 chuột cho uống EtAA ngày lần với liều lượng 100, 200, 300, 400 mg nguyên liệu khô/kg thể trọng [25] 12 tuần, sau thời gian phục hồi tuần Chuột nhóm chứng uống nước hàng ngày Chiết xuất sử dụng đường miệng Những chuột quan sát hàng ngày hành vi bất thường dấu hiệu bất lợi khác độc tính Mức tiêu thụ thức ăn nước uống trọng lượng thể ghi lại hàng tuần Tất vật cho chết hít khí CO2 vào cuối q trình thử nghiệm Mẫu máu lấy cho xét nghiệm sinh hóa Gan, thận, tim thu thập, cân bảo quản formandehyt 10% [26] Hình A Chuột bị chết hít khí CO2; B Phẫu thuật chuột để thu nhận tim, gan, thận 2.5 Kiểm tra thể chất: Tác dụng độc cấp tính bán mãn tính chiết xuất ethanol xác định cách sử dụng phác đồ theo hướng dẫn 423 OECD [23] Chuột quan sát suốt 14 ngày nghiên cứu độc tính cấp tính 12 tuần nghiên cứu độc tính bán mãn tính Sự thay đổi dấu hiệu so sánh với tình trạng bản: Trong hệ thần kinh trung ương (CNS): hoạt động vận động, điều hòa, phản xạ nghiêng, phản xạ giác mạc, liệt bàn chân, hoạt động cầm nắm, phản ứng báo động, run, giật đầu co giật Ở mắt: nhãn khoa, © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH VÀ BÁN MÃN TÍNH CỦA CHIẾT XUẤT ETANOL HÀNH ĐEN (Allium ascalonicum L.) TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO 27 ngoại nhãn, giãn đồng tử, rung giật nhãn cầu, chảy nước mắt, giãn màng mi đục giác mạc Về da: xanh xao, tím tái sung huyết Các dấu hiệu chung: tiết nước bọt, cương cứng đuôi, tiêu chảy, nước (thử nghiệm Robichaud), khó thở, chảy nước mũi, thụ động, hăng, sợ hãi [23] 2.6 Trọng lượng thể: Trọng lượng thể chuột theo dõi cẩn thận trước bắt đầu nghiên cứu Trọng lượng thể đo cân điện tử (FEJ-3000B, dung tích 3000 g, Trung Quốc), tuần lần trình nghiên cứu [27] Phần trăm thay đổi trọng lượng thể tính theo cơng thức: [W(%) = Trọng lượng thể vào cuối tuần - trọng lượng thể ban đầu)/Trọng lượng thể ban đầu] x100 [28] 2.7 Thức ăn, nước uống tiêu thụ: Lượng thức ăn nước uống ghi lại hàng ngày Lượng thức ăn nước tiêu thụ đo lường trước cung cấp cho nhóm, phần cịn lại thu nhận tính tốn vào ngày hơm sau để có khác biệt Thức ăn hàng ngày tính theo đơn vị g/chuột/ngày lượng nước tiêu thụ (ml/chuột /ngày) [29] 2.8 Phân tích huyết học sinh hóa máu: Các thông số huyết học tổng số bạch cầu, hồng cầu, hemoglobin, tiểu cầu (PLT) … xác định máy phân tích huyết học tự động (Simens, Bayer ADVIA120, Đức) [26] Máy phân tích sinh hóa tự động Hitachi 7020 sử dụng để phát aspartate aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT), phosphatase kiềm, nitơ urê máu, tổng số protein, albumin, glucose, bilirubin tổng, creatinin, tổng cholesterol, triglycerid, creatine kinase, nồng độ ion natri, ion kali ion clorua [26] 2.9 Trọng lượng quan tương đối: Các quan quan trọng kiểm tra kỹ lưỡng Các quan tim, gan, thận phẫu thuật cắt bỏ, làm dung dịch nước muối lạnh, đặt giấy thấm, sau cân (trọng lượng nội tạng tuyệt đối tính gam) Trọng lượng quan tương đối (ROW) sau tính sau: ROW(%) = [Trọng lượng nội tạng tuyệt đối (g) ÷ Trọng lượng thể chuột vào ngày phẫu thuật (g)] × 100 [26] 2.10 Đánh giá mơ học: Gan, thận, tim bảo quản dung dịch formandehyt 10%, cố định 36 - 48 trải qua quy trình mơ học thơng thường để kiểm tra mô bệnh học Các phần mô kiểm tra kính hiển vi với vật kính x40 để kiểm tra hình thái số lượng tế bào [26] 2.11 Phân tích thống kê: Các kết thực nghiệm biểu diễn dạng 𝑋̅ ± 𝑆𝐷 Dữ liệu phân tích thống kê cách phân tích ANOVA Mức ý nghĩa sử dụng để kiểm định sai khác nghiệm thức p