Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 49,2021 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH DỊCH CAO CHIẾT ETHANOL TỪ QUẢ THỂ NẤM VÂN CHI (CORIOLOPSIS ASPERA) Ở VIỆT NAM TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO NGUYỄN NGỌC THUẦN 1,2, TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG 1, NGUYỄN NGỌC TUẤN 1, NGUYỄN THỊ NGẦN 1, ĐÀO THỊ HUỆ 1, VÕ DƯƠNG MỸ DUYÊN 1, BÙI THANH HÒA 1, TRẦN THÀNH ĐẠT 1, LÊ TRUNG THIÊN 2, ĐÀM SAO MAI 1 Viện Công nghệ Sinh học Thực Phẩm, Đại Học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Khoa Cơng nghệ Thực Phẩm, Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh damsaomai@iuh.edu.vn Tóm tắt Coriolopsis aspera loại nấm dược liệu, thành phần có chứa nhiều chất chống oxy hóa mạnh, giúp tăng cường hệ thống miễn dịch chống lại số bệnh ung thư Nghiên cứu nhằm mục đích kiểm tra độc tính cấp tính chiết xuất ethanol trích ly từ thể nấm vân chi (Coriolopsis aspera) Việt Nam chuột Swiss albino Các nghiên cứu thực với liều cố định 2000, 4000 6000 mg/kg thể trọng thông qua đường uống hàng ngày Các dấu hiệu độc tính hành vi tỷ lệ tử vong ghi nhận sau hai 24 dùng thuốc độc tính cấp tính tiếp tục sử dụng chất chiết xuất 14 ngày để phân tích thơng số vật lý, sinh hóa, huyết học nghiên cứu mô bệnh học tim, gan, thận Liều cao sử dụng không gây tử vong thay đổi hành vi chung động vật thử nghiệm Tất thông số không thay đổi suốt nghiên cứu Những kết cho thấy an toàn việc uống chiết xuất từ thể nấm Từ khóa: Coriolopsis aspera, độc tính cấp tính, swiss albino ACUTE TOXICITY ASSESSMENT OF THE ETHANOL EXTRACT FROM FRUITING MASSES OF YUNZHI MUSHROOMS (CORIOLOPSIS ASPERA) IN VIETNAM IN SWISS ALBINO MICE Abstract Coriolopsis aspera is a medicinal mushroom, it contains a variety of powerful antioxidants and other compounds that help boost immune system and fight certain cancers This study aims to test the acute toxicity of the ethanolic extract from fruiting masses of Turkey tails (Coriolopsis aspera) in Siss albino mice Studies were carried out with a fixed dose of 2000, 4000, and 6000 mg/kg body weight through oral administration daily In terms of behavior and mortality, signs of toxicity were noted after every two hours to 24 hours in an acute toxicity test The test Swiss albino mice were continued to use the Coriolopsis aspera ethanolic extracts for up to 14 days The physical, biochemical, hematological parameters of the mice were analyzed and the histopathological of heart, liver, kidney were studied The results showed that the highest dose used did not cause death or change test animals’ general behavior All parameters were unaltered throughout the stude The present study revealed no obvious toxicity in mice treated with Coriolopsis aspera These results indicate the safety of the oral administration of fruiting masses extract Keywords Coriolopsis aspera, acute toxicity, swiss albino, the ethanol extract from fruiting masses of turkey tails GIỚI THIỆU Coriolopsis sp thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota, lớp Agaricomycetes, Polyporales, họ Polyporaceae, chi Coriolopsis Các chi Coriolopsis, Artolenzites, Coriolus, Cubamyces, Cyclomycetella, Lenzites, Poronidulus, Pseudotrametes, Pycnoporus chi Trametes giống [1] Các loài thuộc chi Coriolopsis sp loại nấm lớn thuộc họ nấm lỗ có màu nâu thường mộc gỗ chết Lồi phân bố rộng Thế Giới Bắc Mỹ, Châu Phi, Nam Trung Âu Châu Á Ở Việt Nam loài phát rừng Cúc Phương, Pù Mát-Nghệ An, Tam Đảo Đây loài nấm hoại sinh gây mục trắng gỗ cứng, thể có kích thước trung bình từ 3-8 x 2-9 x 0,3-1cm [2] Trong thành phần loài chứa hợp chất hoạt tính sinh học phong phú, bao gồm terpenoids, steroid, phenol, nucleotide, dẫn xuất © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 78 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH DỊCH CAO CHIẾT ETHANOL TỪ QUẢ THỂ NẤM VÂN CHI (CORIOLOPSIS ASPERA) Ở VIỆT NAM TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO glycoprotein polysacarides [3, 4] Chi Coriolopsis chưa nghiên cứu nhiều, có lồi Coriolopsis aspera Hiện nay, xu hướng ứng dụng dịch cao chiết từ nguyên liệu tự nhiên để sử dụng lĩnh vực dược, y học thực phẩm ngày nhiều có lồi nấm vân chi Nguyên nhân dịch cao chiết có chứa chất có khả chống oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư [5, 6] Nhiều nghiên cứu gần cho thấy thành phần dịch cao chiết nấm vân chi ly trích từ dung mơi ethanol hay methanol có chứa nhóm chất terpenoids, saponins, steroids, flavonoids, phenols, tannins, alkaloids [3, 7, 8] Ngoài ra, dịch chiết ethanol nấm vân chi cịn có tác dụng kích thích hệ miễn dịch chống oxy hóa sử dụng cho thực phẩm bỗ sung dinh dưỡng [9, 10] Gần đây, Nguyen cộng (2020), nấm Coriolopsis aspera có hoạt tính chống oxy hóa, khả kháng viêm, khả gây độc tế bào ung thư gan tế bào ung thư cổ tử cung [11] Trong nghiên cứu nấm Coriolopsis aspera chưa thấy có cơng trình báo cáo độc tính dịch cao chiết ethanol từ thể Chính lý lần nghiên cứu đánh giá độc tính cấp tính dịch cao chiết ethanol từ thể nấm Coriolopsis aspera Việt Nam đối tượng chuột swiss albino nhằm mục đích làm sở ứng dụng dịch cao chiết ethanol lĩnh vực chế thực phẩm có lợi cho sức khỏe VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Nấm vân chi Coriolopsis aspera tự nhiên thu nhận vườn Quốc Gia Pù Mát nằm 18o46’ vĩ độ Bắc 104o24’ độ kinh Đơng thuộc tỉnh Nghệ An Hình 1: Quả thể dịch cao chiết ethanol nấm Coriolopsis aspera 2.2 Chuẩn bị dịch cao chiết ethanol nấm Coriolopsis aspera (EtCA) Quả thể nấm vân chi C aspera chiết xuất ethanol (EtOH) thực phẩm với thông số tối ưu để đạt hàm lượng triterpen 2,09 mg axit oleanolic/g DW, có hỗ trợ siêu âm (UAE) nitơ lỏng để phá vỡ tế bào nguyên liệu [11] Dịch chiết thu (EtCA) cho bay dung môi áp suất chân không nhiệt độ 400C thiết bị cô quay chân không IKA Đức Dung dịch đem cô đặc làm giàu TTC đến 130,3 mg acid oleanolic/g DW 2.3 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng Swiss albino cung cấp viện Pasteur TP.HCM Chuột ni phịng, cho ăn trì nhiệt độ cụ thể (23±3°C), độ ẩm tương đối (55±15%), tần số thơng gió (10–20 lần/h) chiếu sáng (12 giờ; từ sáng đến tối) Chuột chọn ngẫu nhiên, chia thành nhóm thí nghiệm đối chứng Ni nhốt lồng ni khử trùng, lồng chứa dăm gỗ làm chất độn chuồng Chuột ăn thức ăn viên tiêu chuẩn uống nước lọc Tất quy trình thử nghiệm tuân thủ theo nguyên tắc quốc tế chấp nhận việc sử dụng chăm sóc động vật phịng thí nghiệm Quy trình thử nghiệm tuân thủ nghiêm ngặt theo Tuyên bố Helsinki, 1975 [12] 2.4 Thử độc tính cấp tính dịch chiết nấm Coriolopsis aspera Sử dụng phương pháp Lorke (1983) Miller (1944) có chỉnh sửa [13, 14] Quy trình thử độc tính cấp tính chuột tiến hành theo hướng dẫn 407 (2001) OECD [15] hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu theo định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015 Cục trưởng Cục Khoa học Công nghệ Đào tạo, Bộ Y tế, Việt Nam © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Tthành phố Hồ Chí Minh ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH DỊCH CAO CHIẾT ETHANOL TỪ QUẢ THỂ NẤM VÂN CHI (CORIOLOPSIS ASPERA) Ở VIỆT NAM TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO 79 Thử nghiệm chuột Swiss albino xếp thành nhóm, nhóm Những chuột đối chứng cho uống nước lọc (10 ml/kg/trọng lượng thể) [16], nhóm cịn lại uống EtCA với liều 2000, 4000 6000 mg/kg thể trọng [17, 18] Nước lọc thuốc thử đuợc đưa vào dày chuột kim cong đầu tù, cho uống liên tục ngày [19] Tất chuột sau uống dịch chiết phép tiếp cận tự với thức ăn nước uống Việc quan sát dấu hiệu nhiễm độc thực 1, sau điều trị định kỳ 24 Tỷ lệ tử vong phát phòng thí nghiệm bao gồm thay đổi màu sắc da, mắt, màng nhầy ghi lại vòng Trong ngày tiếp theo, quan sát tư thể, chuyển động, đứng, nằm, chấn động, hấp thụ, đau, phản ứng chậm, phản xạ lại, hành vi (tiết nước bọt, hôn mê), thương tích bệnh tật nào, tỷ lệ tử vong v.v tiến hành quan sát lần/ngày 14 ngày ghi lại cẩn thận Ngoài ra, chế độ ăn uống quan sát ghi chép [20] Hàng ngày, hai tuần sau thực thí nghiệm quan sát liên tục ghi chép đầy đủ Tìm liều cao chuột khơng chết liều thấp gây chết 100% Những thay đổi huyết học, sinh hóa máu, trọng lượng quan tương đối, mô học quan ghi nhận thời gian thử nghiệm Theo dõi tình trạng chung chuột đến hết ngày thứ 14 sau uống thuốc thử lần đầu Vào ngày thứ 15, tất vật gây mê diethyl ete, mẫu máu, mẫu mô tim, gan, thận thu nhận gửi đến sở xét nghiệm để phân tích đọc kết Các khuyến nghị tuân theo số lượng giới tính động vật sử dụng [21] 2.5 Kiểm tra tiêu nghiên cứu 2.5.1 Kiểm tra thể chất Tất động vật quan sát hai lần ngày để đánh giá tình trạng chung, dấu hiệu lâm sàng tỷ lệ tử vong trước thử nghiệm suốt thời gian dùng cao chiết EtCA Tất động vật cân riêng trước dùng thuốc thử vào ngày tuần lần sau [22] Các thay đổi khác ngoại hình, hành vi (buồn ngủ, tiết nước bọt, hôn mê) chấn thương bệnh tật thời gian dùng thuốc, biểu độc tính xuất triệu chứng bất thường thuốc thử quan sát ghi chép vào sổ cá nhân hàng tuần Tỷ lệ tử vong, tình trạng nguy kịch diện, mức độ dấu hiệu bất thường ghi nhận riêng cho nhóm điều trị [23] 2.5.4 Huyết học sinh hóa máu Chuột nhịn ăn 18 trước giải phẫu, mẫu máu thu thập từ Máu tồn phần cho vào ống Vacutainer có chứa chất chống đơng K2-EDTA để chống đơng máu [22] Phân tích huyết học thực máy phân tích huyết học tự động (Sysmex K-450, Nhật Bản) [18] Thông số huyết học số lượng hồng cầu (RBC), hemoglobin (HGB), bạch cầu (WBC), số lượng tiểu cầu (PLT) ước tính [22, 24] Máu thu thập ống lấy huyết chứa hạt silicagen, thủy tinh silicagen làm tăng tốc độ đông máu ông NaF chứa thành phần Kali Oxalate NaF (Kali Oxalate - chất chống đông cách liên kết Ca2+ máu, NaF- chất ngăn cản trình đường phân, ngăn cho glucose máu khơng bị phân hủy) Các thơng số sinh hóa máu đo máy phân tích sinh hóa huyết (Hitachi 7020, HITACHI, Tokyo, Nhật Bản) Các tiêu sinh hóa phân tích protein, albumin, globulin, BUN, creatinine (CRE), axit uric [25] 2.5.5 Trọng lượng tương đối quan Vào ngày thứ 15 trình thử nghiệm, tất chuột gây mê chloroform Chuột sau phẫu thuật, quan nội tạng (tim, gan, thận) lấy cân để tính trọng lượng nội tạng tương đối [25] quan sát để tìm tổn thương tổng thể [26] Trọng lượng tuyệt đối quan chuột đo cân điện tử (Marte – AD 2000, tải trọng tối đa 210 g; độ nhạy 0,01 g) [27] Trọng lượng tương đối quan nội tạng tính theo công thức: Trọng lượng nội tạng tương đối (%) = (trọng lượng nội tạng tuyệt đối (g) / trọng lượng thể vật vào ngày phẫu thuật (g)) × 100 [28] 2.5.6 Mô bệnh học quan Các quan tim, gan, thận cắt bỏ cân đo cẩn thận Các quan bảo quản mơi trường cố định có 10% formalin đệm để nghiên cứu mô bệnh học Các phần parafin nội tạng chuẩn bị, nhuộm haematoxylin eosin, quan sát kính hiển vi ánh sáng [29] © 2021 Trường Đại học Cơng nghiệp Tthành phố Hồ Chí Minh 80 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TÍNH DỊCH CAO CHIẾT ETHANOL TỪ QUẢ THỂ NẤM VÂN CHI (CORIOLOPSIS ASPERA) Ở VIỆT NAM TRÊN CHUỘT SWISS ALBINO 2.6 Xử lý số liệu Tất giá trị biểu thị dạng MEAN ± SD kết phân tích thống kê phân tích phương sai chiều (ANOVA) Sau tiến hành thực kiểm tra so sánh Tukey phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XVIII, P